全 文 ：书浦竹仔红色秆变异个体的 rDNA ITS序列
及系统发育研究
*
王 娟1，孙 浩1，彭桂莎1，王明悦1，熊 智1，张兴波3，孙茂盛1，杨宇明2
(1. 西南林业大学 国家林业局西南生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224;2. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;
3. 云南兴云园艺有限公司，云南 普洱 665000)
摘要:通过对浦竹仔红秆变异个体基因组 DNA的提取、rDNA ITS片段的扩增、回收及测序，分析了其 rDNA ITS
序列，构建了系统发育树。结果表明，供试竹种与 Genbank中记录的浦竹仔 ITS全长序列相似度为 99 %，与同
属的中华大节竹、酸竹属的酸竹、少穗竹属的少穗竹亲缘关系较近，其遗传距离为 0. 007 和 0. 010。RNA二级结
构模拟分析显示，各参试竹种之间 5. 8s RNA变异极微小，主要的遗传变异均集中在 ITS1 － ITS2 非编码序列中。
由此可以推论该竹种产花色苷性状并非种属差异导致，为样本收集地环境因子诱发基因突变所致。
关键词:浦竹仔;变异个体;rDNA ITS序列;系统发育
中图分类号:S 795 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2012)01 － 0001 － 06
Phylogenetic Study on Anthocyanin Produced Mutant of Indosasa hispida
Based on rDNA ITS Sequences
WANG Juan1，SUN Hao1，PENG Gui-sha1，WANG Ming-yue1，XIONG Zhi1，
ZHANG Xing-bo3，SUN Mao-sheng1，YANG Yu-ming2
(1. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest of China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，
Kunming Yunnan 650224，P. R. China;2. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. R. China;
3. Yunnan Xingyun Gardening Co. Ltd. ，Pu’er Yunnan 665000，P. R. China)
Abstract:Through DNA extraction，PCR amplification and DNA sequencing，the internal transcribed spacers
(ITS)sequence of anthocyanin produced mutant of Indosasa hispida were analyzed and the phylogenetic tree was
established． The results indicated that the ITS sequence similarity between the tested materials and the record of In-
dosasa hispida was 99 %，anthocyanin produced mutant had close genetic relationship with Indosasa sinica，Acido-
sasa purpurea and Oligostachyum sulcatum，with the genetic distance of 0. 007 and 0. 010 respectively． RNA sec-
ondary structure simulation analysis showed the genetic variation in 5. 8 sRNA was extremely small，the main genet-
ic variation were in ITS1 － ITS2 noncoding sequence． The results therefore implied that the anthocyanin produced
character was not the genus or species difference，but caused by environmental mutagenesis．
Key words:Indosasa hispida;individual variation;rDNA ITS sequence;phylogenesis
第 41 卷 第 1 期
2012 年 02 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 41 No. 1
Feb. 2012
* 收稿日期:2011 － 11 － 08
基金项目:国家林业局 948项目 (2008 －4 －30)竹子重要性状的基因工程研究技术引进;云南省自然科学基金面上项目 (2009CD073)
资助研究;云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目 (2010CI016)资助研究。
第一作者简介:王 娟 (1966 －) ，女，云南建水人，教授，博士，硕士生导师，主要从事生物多样性保护、生态学和竹类植物的
微观研究。
通讯作者简介:杨宇明 (1955 －) ，男，云南昆明人，教授，博士，博士生导师，主要从事竹类植物、生物多样性保护和野生动植
物保护与利用研究。
浦竹仔 (Indosasa hispida)为 禾本科 (Poace-
ae)竹亚科 (Bambusoideae)大节竹属 (Indosasa)
植物。主要分布于云南南部景洪、勐腊、普洱、江
城等地海拔 1 700 m以下地区，广东、广西及越南
北部也有分布［1 ～ 2］。灌木状小型竹，秆高约 3 m，
直径 1. 5 ～ 3 cm，髓膜片状;节间长 20 ～ 30 cm，
淡绿色，幼时密生白色或淡黄色小刺毛，后渐脱落
而留有细小槽痕;三分枝，主枝较明显;叶片披针
形至长椭圆状披针形，上面无毛，下面被短柔毛;
小穗密被淡黄色柔毛，并托以大型枝箨状苞片，以
及叶片下表面有短柔毛。项目组于 2009 年在云南
普洱偶然发现在当地自然分布的蒲竹仔群落中偶见
竹秆中下部出现不同程度的红色至紫红色，叶片上
有黄条纹的个体居群出现，该性状与以往的描述记
载的蒲竹仔有明显不同。经分类学鉴定，除秆基部
呈现红色与叶片淡黄条纹外，与蒲竹仔的形态学描
述没有异议，故在分类上应属 (当地自然分布的)
大节竹属的浦竹仔，而出现红色秆性状的居群，形
成原因尚无相关文献报道。本项研究以秆部呈红色
的浦竹仔变异个体为研究对象，为进一步证实该变
异个体与原变种和其他近缘属种的关系及花色苷性
状产生的原因，项目组对该突变体开展了 rDNA
ITS序列分析及系统发育的实验研究。旨在通过分
子生物学实验对蒲竹仔红秆变异个体的分类学地位
进行探讨，并揭示其与原变种和其他近缘属种的系
统学关系，以及花色苷 (Anthocyanins)性状产生
的原因，以期为后续研究提供科学可靠的实验依
据。
真核生物 rDNA 在基因组 DNA 中的编码序列
相对保守，种间变异度小。真核生物核糖体 DNA
内转录间隔区 ITS1 和 ITS2 为非编码序列，具有较
高的变异性［3 ～ 5］，此段序列中携带了大量的真核生
物进化信息，是在许多被子植物的科内、属内关系
研究中可靠的分子标记。诸葛强等，杨光耀等［6 ～ 7］
利用 rDNA ITS序列分析对广义青篱竹属中争议类
群的代表种进行了分子进化研究。李淑娴等［8］应
用微卫星标记 (SSR)技术对竹类植物的分子系统
学进行了研究。花色苷是植物次生代谢过程中产生
的类黄酮物质，为自然界一类广泛存在于植物中的
水溶性天然色素［9］，是构成花瓣和果实颜色的主
要色素之一。目前，除本项目组发表了一篇在高山
箭竹中发现花色苷的论文外，尚无其他有关竹子产
花色苷的报道。本项研究是继在高山箭竹 －棉花竹
(Fargesia fungosa)中首次发现竹类花色苷的存在
之后，对再次发现产花色苷竹类植物进行的深入研
究。
1 材料与方法
1. 1 材料
实验材料由普洱市思茅区林业局张兴波提供，
现保存于西南林业大学和云南省林业科学院温室里
(见图 1) ，并由云南省林业科学院杨宇明教授鉴定
为浦竹仔 (Indosasa hispida)。本项研究涉及的 7 种
竹类植物 rDNA ITS 序列信息 (表 1)取自于美国
国家生物技术信息中心 DNA数据库 (Genbank)。
a. 供试竹种
b. 供试竹种秆部
(纵切面示片状髓心)
c. 供试竹种秆部体视镜照片
(示花青素合成色点)
图 1 供试的浦竹仔
Fig. 1 Tested sample of Indosasa hispida
2 西 部 林 业 科 学 2012 年
表 1 7 种竹类植物的 rDNA ITS 序列信息
Tab. 1 rDNA ITS sequence information of 7 bamboo species
种名 属名 Genbank 号 种出处
酸竹(Acidosasa purpurea) 酸竹属(Acidosasa) AY004760 ［10］
少穗竹(Oligostachyum sulcatum) 少穗竹属(Oligostachyum) EU847131 ［11］
浦竹仔(Indosasa hispida) 大节竹属(Indosasa) EU847116 ［2］
中华大节竹(Indosasa sinica) 大节竹属(Indosasa) EU847117 ［12］
神农箭竹(Fargesia murielae) 箭竹属(Fargesia) AF280986 ［13］
元江箭竹(Fargesia yuanjiangensis) 箭竹属(Fargesia) AF280977 ［14］
薄竹(Leptocanna chinensis) 薄竹属(Leptocanna) DQ131519 ［15］
1. 2 主要试剂与仪器
植物基因组 DNA 提取试剂盒为天根植物基因
组提取试剂盒 DP305 － 01，PCR 扩增混合液选用
百泰克 Power taq PCR mix PR4001，核酸凝胶回收
试剂盒为百泰克 DNA 回收纯化试剂盒 DP1502，
PCR仪为 Biometra T － professional。
1. 3 方法
1. 3. 1 基因组 DNA的提取与检测
蒲竹仔样本采集后以无水乙醇擦拭，迅速保存
至液氮中，研磨备用。采用植物基因组提取试剂
盒，对蒲竹仔秆部基因组 DNA 进行提取，基因组
DNA片段以 1 %琼脂糖凝胶电泳检测， － 20℃保
存备用。
1. 3. 2 样本 rDNA ITS片段的扩增、回收及测序
本实验采用的 rDNA ITS片段的扩增引物结合位
点，分别位于核糖体 DNA转录间隔区 ITS1和 ITS4，
扩增片段横跨整个 5. 8s rDNA编码区域。ITS1 :5 －
AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTA － GG － 3，ITS4:
5`－ TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3`［6］全部引物序列
由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物干粉稀释
为 100 μmol /L储存液备用，PCR工作液终浓度为10
μmol /L。PCR扩增体系:Power taq PCR mix 25 μL，
上下游引物各 2. 5 μL，蒲竹仔 DNA 模板 30 ～ 40
ng，dd － H2O 定容至 50 μL。扩增程序为:75 ℃预
变性 10 min，1循环;94 ℃变性 60 s，56 ℃退火 30
s，72℃延伸 3 min，38循环。
扩增产物以 1 %琼脂糖凝胶电泳检测。割胶回
收后，扩增片段用百泰克 DNA 回收纯化试剂盒
(DP1502)进行回收纯化。扩增产物送上海美吉生
物工程有限公司进行 PCR 产物直接测序，测序引
物与扩增引物相同。
1. 4 生物信息学分析
测序结果采用 DNAman 6. 0 软件进行拼接不确
定片段后，在 GenBank 中进行 BLASTn 比较搜索，
下载同源性序列。本实验涉及的同源序列比对，遗
传距离计算，全部在 mega 5. 0 生物信息学平台上
进行。序列比对采用 Clustal － W 插件完成，手工
删节序列中的 gap 片段。系统学分析由 mega
5. 0［16］建树模块进行，采用最大简约法建立进化
树，并作 1 000 次 Boot － strap 检验。采用 RNA-
Structure［17 ～ 18］对蒲竹仔的 ITS1、ITS2 和 5. 8s 区域
排列序列进行二级结构模拟，以便在 RNA 二级结
构构象水平对 rDNA ITS 序列分歧度和系统分析可
靠性进行验证。
2 结果与分析
2. 1 蒲竹仔基因组 DNA的提取和 rDNA ITS序列
的分析
凝胶电泳结果显示，竹类植物基因组 DNA 提
取质量较好。
a. 蒲竹仔基因组
DNA检测
b. 蒲竹仔 rDNA ITS序列
产物检测
图 2 蒲竹仔基因组 DNA和 rDNA ITS序列产物检测
Fig. 2 Agarose gel (1. 5 %)electrophoresis detection on DNA
extraction and PCR products of ITS sequence
基因组 DNA 提取物纯净度高，无 RNA及蛋白
污染，适用于下游实验。蒲竹仔 rDNA ITS序列扩增
产物检测结果显示，蒲竹仔 rDNA ITS序列全长大小
为 750 bp 左右 (图 2) ，与引物设计初衷相符，平
行实验显示该扩增具有良好的重复性。测序峰图
3第 1 期 王 娟等:浦竹仔红色秆变异个体的 rDNA ITS序列及系统发育研究
(美吉生物测序号:M0929. 1026，M0929. 1027)显
示，该片段测序信号清晰完整，无重峰及诡峰，测
序引物与片段的结合良好，送测片段纯度较高无污
染。
蒲竹仔 rDNA ITS序列 (包含 5. 8s)对位排列
全长为 610 bp，亲缘关系较为接近的少穗竹 (Oli-
gostachyum sulcatum)全长为 596 bp。由 Blast 比对
结果可知，蒲竹仔 rDNA 5. 8s 序列起始于第 252 碱
基，终止于 415 碱基，长度为 163 bp。参试竹种的
rDNA 5. 8s 序列长度一致，含 1 个变异位点，位于
第 365 碱基至 369 碱基之间。经分析，蒲竹仔 ITS1
区含 45 个变异位点，ITS2 区含 40 个变异位点，其
中大部分变异位点均携带种属与系统进化信息，变
异位点分别占 ITS1 和 ITS2 区全长的 17. 9 % 和
20. 0 %。由此可见，蒲竹仔的系统发育信息主要
存在于 rDNA ITS1 和 rDNA ITS2 区。
由 RNAStructure 软件绘制的蒲竹仔和薄竹
(Leptocanna chinensis) rRNA 二级结构 (见图 3) ，
研究结果显示，两株亲缘关系相对较远的竹类植物
的 5. 8s rRNA结构完全相同。rDNA 5. 8s 序列中存
在的 1 个变异位点，并未造成 5. 8s rRNA二级结构
严重差异。ITS1 － ITS2 非编码序列构象模拟显示，
两个竹种的 ITS1 － ITS2 同源序列已经发生了极其
明显的遗传分化。
a. 蒲竹仔 b. 薄竹 c. 5. 8s rRNA 结构图
图 3 基于 5. 8s + ITS1 + ITS2 区构建的 2 种竹类植物 rRNA二级结构
Fig. 3 RNA secondary structures based on 5. 8s plus ITS1 plus ITS2
2. 2 蒲竹仔的系统发育分析
参试竹类植物 rDNA ITS 序列 (表 1) ，与对照
样本 ITS 序列经多重比对后，构建系统发育树 (图
4 )。结果显示:全部参试样本分为两个分支，其
中薄竹属的薄竹独立成为一大支，其余各竹种分为
一大支。分析结果表明，蒲竹仔与同为大节竹属的
中华大节竹 (I. sinica)具有较近的亲缘关系。酸
竹属的酸竹 (Acidosasa purpurea)、少穗竹属的少
穗竹与供试样本也显示了较为亲密的遗传关系。箭
竹属的元江箭竹 (F. yuanjiangensis)和神农箭竹
(F. murielae)共同聚为一个小分支。
图 4 基于 ITSl、5. 8s和 ITS2 序列分析构建的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree inferred from ITS1，5. 8s and ITS2
4 西 部 林 业 科 学 2012 年
基于参试竹种的 rDNA ITS 序列进行了绝对遗
传距离分析 (表 2) ，结果显示:浦竹仔红色秆变
异个体与 Genbank 中记录的浦竹仔遗传距离最近，
为 0. 002，与同属的中华大节竹遗传距离为 0. 014。
另外供试竹种与酸竹属的酸竹，少穗竹属的少穗竹
的遗传距离也较为相近，分别为 0. 007 和 0. 010。
表 2 基于 rDNA ITS序列的参试竹种绝对遗传距离
Tab. 2 Absolute genetic distance of rDNA ITS sequences of the bamboos used in this study
编号 竹种 1 2 3 4 5 6 7
1 对照样本
2 少穗竹(Oligostachyum sulcatum) 0. 010
3 酸竹(Acidosasa purpurea) 0. 003 0. 007
4 浦竹仔(Indosasa hispida) 0. 005 0. 005 0. 002
5 中华大节竹(Indosasa sinica) 0. 018 0. 021 0. 014 0. 016
6 神农箭竹(Fargesia murielae) 0. 035 0. 039 0. 032 0. 034 0. 040
7 元江箭竹(Fargesia yuanjiangensis) 0. 045 0. 049 0. 041 0. 043 0. 051 0. 030
8 薄竹(Leptocanna chinensis) 0. 083 0. 091 0. 087 0. 089 0. 091 0. 088 0. 092
3 结论与讨论
竹类植物种类繁多，经过长期的自然选择，遗
传变异极为丰富。同时，竹类植物以营养繁殖为
主，开花后即死亡。基于此生物学特性，竹类植物
很难以花、果等生殖器官作为形态分类的依据，导
致某些竹子类群在分类上长期存在较大争议［6］。
本项研究以 rDNA ITS 序列为依据，对蒲竹仔的红
色秆变异个体进行了初步的系统学研究，供试竹种
的分子系统学分析结果与传统分类学得出的鉴定结
果基本一致。RNA 二级结构模拟结果显示，参试
竹种在长期的进化过程中，5. 8s rDNA 序列极其保
守，其中唯一的变异位点并不携带进化信息，亲缘
关系较远的竹种在 5. 8s rRNA 结构上也不存在差
异，但 ITS1、ITS2 序列中存在较大的遗传变异。
该结果与分子系统学相关理论较为吻合。由此可
见，以 rDNA ITS序列为依据对竹类植物进行系统
学研究，并揭示其在长期进化过程中的亲缘关系，
是可靠的研究方法。
供试竹子具有蒲竹仔典型的形态学特征［1 ～ 2］，
ITS序列分析显示，该变异个体与大节竹属的其他
竹种之间具有极近的亲缘关系，分子系统学和形态
学的鉴定结果完全一致。文献记录中并无该竹种产
花色苷及秆部变红的报道［1 ～ 2］，该现象可能与环境
因子诱导的基因突变有关。滇南山地虽处热带北
缘，但海拔明显高于该竹种的发现地广西。在长期
较强的紫外诱导下，该竹种的某些与苯丙氨酸代谢
途径相关的基因可能发生突变并引起一系列遗传变
异，从而推动了苯丙氨酸代谢过程在某些生长时期
向花色苷的生物合成发生倾斜。花色苷为一种高效
的抗紫外辐射物，该竹种的产花色苷变异也与自然
选择学说相吻合。供试竹种与酸竹、少穗竹之间的
遗传距离非常小，但供试竹种在形态学上并不与二
者划归同一属。酸竹和少穗竹在形态上与供试竹种
极为相近，二者本身的亲缘关系也较为相近［11］。
酸竹在幼嫩时期秆部同样有零星红色出现但不明
显［10］，此现象可能与地理环境和外部诱导有一定
关系，其模式种采集地为海南［10］。供试竹种与其
他属竹种间出现的较为亲密的进化关系本研究尚不
能解释，有待后续研究做深入的探讨。但本研究的
结果可明确证实:供试竹种是蒲竹仔产生花色苷的
变异个体，这些变异个体已在滇南边缘热带及南亚
热带山地形成了一定范围的较稳定的居群，并与原
变种形成了明显的地理隔离，本项研究成果显示，
将该变异个体居群作为蒲竹仔的地理变种的种下分
类等级较为合理。
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