全 文 ：　收稿日期:2008-10-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30660031);国家重大基础研究前期研究专项(2004CCA02800)
作者简介:齐妍婷(1983-),女 , 硕士生 ,研究方向为植物生态;e-mail:qiyanting1206@hotmail.com。
通讯作者:王绍明(1963-),男 , 教授 ,从事生态学研究;e-mail:shaomingw@shzu.edu.cn。
第 26卷　第 6期
2008年 12月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science) Vol.26　No.6Dec.2008
文章编号:1007-7383(2008)06-0661-04
羽毛针禾交配系统的 SSR分析
齐妍婷 , 邓必建 , 杨　波 , 张　霞 , 王绍明
(石河子大学生命科学学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室 , 新疆石河子 832003)
摘要:利用 SSR共显性标记位点对新疆准噶尔盆地羽毛针禾(Stipagrosits pennata(Trin.)De Winter)居群进行了交配
系统研究。采用20 个家系共160个子代样品测定了该居群花粉库基因频率 、固定指数(F)、多位点异交率(tm)和单
位点异交率(ts)。结果显示该居群异交率处于较高的水平(tm=0.839), 多位点异交率与单位点异交率差异较显著
(tm -ts=0.178), 固定指数(F)的估计值大于 0(F=0.158), 表明该居群以异交为主 ,但双亲近交较明显。这可能是
受居群密度 、风力等因素影响的结果。
关键词:羽毛针禾;交配系统;异交率;SSR
中图分类号:Q503　　　　文献标识码:A　　　　
　　导致植物濒危的因素很多 ,居群的生殖生物学
特点(包括生殖方式:有性 、无性或兼性;交配系统:
自交或异交;传粉和受精;生殖能力;种子散布方式
等)是原因之一[ 1] 。交配系统是生物有机体通过有
性繁殖将基因从一代传递到下一代的模式 ,包括控
制配子结合以形成合子的所有属性[ 2] 。作为连接两
个有性世代之间的桥梁 ,它也决定了后代群体的基
因型分布和种群动态 ,了解交配系统成为研究居群
水平基因传递以及进化机制与过程的前提[ 3] 。研究
交配系统对探讨物种的濒危机制有着重要的意义 。
羽毛针禾(Stipagrosits pennata(Trin.)De Winter)
属于禾本科(Graminae)针禾属(Stipagrostis Nees),在
我国主要分布在新疆准噶尔盆地 ,为生于荒漠的共
建种。羽毛针禾繁育系统同时具有有性繁殖(自交
或异交均能产生种子)和无性繁殖(老根上的不定芽
长成新植株)。
目前国内外对羽毛针禾的研究主要集中在形态
学 、生态学 、传粉生物学等方面 ,而从 DNA 水平上
研究羽毛针禾的交配系统还未见报道 。异交率
(outcrossing rate)是交配系统的特征参数[ 4] 。国内对
异交率的估测主要是以等位酶 、RAPD为主 ,由于等
位酶本身是编码区 ,受环境选择压影响较大 ,不易发
生变异 ,对于多样性较低的物种 ,尤其是对于高度克
隆植物居群很可能缺乏用于研究交配系统的酶位点
上的变异[ 5] 。而 RAPD分析则稳定性不高 ,其结果
往往不可靠 。
因此 ,有必要选择更具变异性 、稳定性更可靠的
DNA水平上的分子标记。SSR标记技术则具有多态
性好 、重复性好 、稳定可靠等特点 ,因此笔者应用
SSR技术分析羽毛针禾的交配系统。通过对交配系
统的初步研究 ,为深入研究其种群扩张及[ 6]进化机
制与过程奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料羽毛针禾(Stipagrosits pennata(Trin.)
De Winter)取自新疆准噶尔盆地 。羽毛针禾果实为
颖果 ,内有 1颗种子 。
2006年 7月从 1个羽毛针禾居群(炮台镇)收集
果实 ,由于羽毛针禾单株果实数量较少 ,因此将每个
繁殖个体上所有果实全数采集 ,各个体的果实分开
包装。
将采集到的羽毛针禾果实迅速带至石河子大学
生命科学学院实验室以备萌发。每株的种子置于花
盆中 ,在 20℃下萌发 ,经过 25d ,萌发率达到 85%以
上 。
待长出幼叶约 5cm 后 ,取来自 20个家系的 160
DOI :10.13880/j.cnki.65-1174/n.2008.06.003
个子代样品进行分子分析 。
野外考察及取样时间为 2006年 7月份 ,凭证标
本存于石河子大学标本馆(SHI)。
1.2　DNA提取
供试材料羽毛针禾 DNA 的提取方法采用 SDS
法[ 6] 。
1.3　SSR引物的筛选
由于对针禾属植物研究的甚少 ,直接利用其基
因组 DNA进行微卫星引物的设计是很困难的 。但
微卫星引物大都在同科属植物间具有保守性 。本研
究便利用微卫星引物这一特性进行 SSR-PCR 扩增
实验 。
选自水稻基因组 DNA 的微卫星引物 23对[ 7] ,
由上海生物工程公司合成 ,然后进行筛选。筛选的
标准是能扩增出清晰的特异性谱带 。
筛选所得的微卫星引物用于本次实验的 DNA
扩增分析 。
1.4　SSR-PCR扩增
PCR反应体系其反应体积为 25μL ,主要成分
为:1 ×反应缓冲液 、Mg2+ 2.5mmol/L 、dNTPs 0.1
mmol/L 、SSR双引物各 0.4μmol/L、Taq DNA 酶 1.0
U 、模板 50ng 。
DNA 扩增在 PCR 扩增仪(MyCyclerTM Thermal
Cycler)上进行。
反应程序为:94℃预变性 5min ,接着进行 94℃
变性 45s ,50℃退火 45s ,72℃延伸 1min ,反应 35个循
环 ,最后 72℃延伸10min。
1.5　电泳检测
取PCR扩增产物 6μL ,加 1.2μL加样缓冲液 ,在
10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离 ,以每泳道电流
1mA电泳 6h左右 。
分子量标准物(Marker)为 pUC19DNA/Mspl
Marker(上海生工)。用凝胶成像系统拍照 、存档 ,待
分析 。
1.6　数据统计分析
植物交配系统的测定有多种方法 ,可以利用具
有遗传基础的表现型测定[ 8] ,多位点混合交配系统
测定模型[ 9 ,10] ,以及亲本分析法[ 11] 。
本研究中采用多位点混合交配系统测定模型测
定羽毛针禾种群的交配系统 ,该方法是目前使用最
普遍的方法 。分别采用该模型测定多位点异交率
(tm)和单位点异交率(ts)[ 9 , 12] 。
该模型通过最大似然程序可以同时得到 3个参
数:Newton-Raphson法估算异交率 、期望最大法估算
花粉库等位基因频率 、后代矩阵法估算母株基因型。
本项研究所采用的程序为加拿大 K.Ritland教
授编制的MLTR程序。
在花粉库等位基因频率估算中 ,假定花粉库与
胚珠库等位基因频率相同。单个位点异交率的差异
采用χ2检验进行 , x2=∑n
i=1Ii(ti -t),其中 Ii 为第 i
个位点异交率方差的倒数 , i和 t 分别指第 i 个位点
的异交率及其均值 , n 为位点数 ,自由度为 k =n-
1
[ 13] 。
2　结果
2.1　微卫星引物筛选的结果
经过对所引用的 23对来自水稻的微卫星引物
进行 SSR-PCR扩增 ,按照筛选的标准即能扩增出清
晰的特异性谱带进行筛选。
结果有 8对引物的扩增结果比较理想 ,它们是
RM11 ,RM19 , RM167 ,RM205 , RM215 , RM230 , RM289 ,
RM335(表 1)。
这 8对来自水稻的微卫星引物可以用来进行羽
毛针禾 SSR-PCR扩增实验 。
表 1　所用有效引物名称及序列
引物名称 引物 序列
RM11 tctcctcttcccccgatc atagcgggcgaggcttag
RM19 caaaaacagagcagatgac ctcaagatggacgccaaga
RM167 gatccagcgtgaggaacacgt agtccgaccacaaggtgcgttgtc
RM205 ctggttctgtatgggagcag ctggcccttcacgtttcagtg
RM215 caaaatggagcagcaagagc tgagcacctccttctctgtag
RM230 gccagaccgtggatgttc caccgcagtcacttttcaag
RM289 ttccatggcacacaagcc ctgtg cacgaacttccaaag
RM335 gtacacacccacatcgagaag gctctatgcgagtatccatgg
2.2　等位基因频率和异交率
本研究所选用的 8对引物在本次研究中的等位
基因频率及其标准差(SD)见表 2。
采用 MLTR软件对羽毛针禾居群多位点异交率
(tm)和单位点异交率(ts)进行测定 ,结果显示 ,异交
在羽毛针禾居群中占据比较优势地位(tm =0.839±
0.053;ts=0.661±0.059)(表 3)。
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表 2　SSR标记位点名称与等位基因频率及其标准差
SSR
Locus/allele 等位基因频率 标准差
SSR
Locus/ allele 等位基因频率 标准差
RM11　　1 0.186 0.052 RM215　　2 0.272 0.067
RM11　　2 0.143 0.048 RM215　　3 0.209 0.049
RM11　　3 0.175 0.050 RM215　　4 0.276 0.067
RM11　　4 0.197 0.062 RM230　　1 0.220 0.061
RM11　　5 0.136 0.046 RM230　　2 0.243 0.045
RM11　　6 0.164 0.051 RM230　　3 0.216 0.056
RM19　　1 0.234 0.052 RM230　　4 0.187 0.059
RM19　　2 0.315 0.066 RM230　　5 0.132 0.047
RM19　　3 0.238 0.057 RM289　　1 0.199 0.053
RM19　　4 0.207 0.057 RM289　　2 0.206 0.062
RM167　　1 0.196 0.043 RM289　　3 0.191 0.054
RM167　　2 0.214 0.055 RM289　　4 0.143 0.042
RM167　　3 0.172 0.061 RM289　　5 0.153 0.051
RM167　　4 0.226 0.064 RM289　　6 0.109 0.043
RM167　　5 0.191 0.051 RM335　　1 0.189 0.057
RM205　　1 0.286 0.048 RM335　　2 0.225 0.053
RM205　　2 0.191 0.038 RM335　　3 0.189 0.065
RM205　　3 0.274 0.061 RM335　　4 0.135 0.048
RM205　　4 0.249 0.061 RM335　　5 0.263 0.063
RM215　　1 0.237 0.048
表 3　多位点异交率 、单位点异交率及固定指数
指标 数值 标准差 SD
固定指数 0.158 0.044
多位点异交率 0.839 0.053
单位点异交率 0.661 0.059
近交指数 0.178 0.026
3　讨论
最近 SSR标记被较广泛地用于有花植物的异
交率检测[ 14～ 16] 。本研究选择 SSR标记对羽毛针禾
进行自然居群异交率的检测说明 , SSR标记可以提
供丰富的信息进行异交率的研究 。在实验过程中
SSR标记具有操作简单 、快速 ,共显性等优点 ,为研
究交配系统带来了方便。本研究对羽毛针禾居群的
异交率进行了估测 ,结果显示羽毛针禾居群异交率
处于较高水平(tm =0.839),但多位点异交率与单位
点异交率差异较大(tm -ts =0.178),固定指数估计
值大于 0(F =0.158),说明在所分析的居群中异交
相对于自交来讲占据较大优势 ,可以说羽毛针禾的
交配系统是以异交为主 ,自交为辅的交配模式 。但
比起具有较高异交率的其它植物来讲 ,其异交率比
较低 ,如 Pascarella[ 17]报道美洲植物(Ardisia escallo-
nioides)的异交率超过 1 ,陈小勇等[ 18]发现 2个红凉
伞(Ardisia crenata var.bicolor)居群的多位点异交率
都大于 1。这可能与居群密度高低有关 ,自交亲和
的物种在居群密度低时 ,亲缘关系较远的植株提供
的花粉少 ,近交和自交的机会多 ,从而使异交率降
低 。居群密度大时 ,邻近植物间的联系加大 ,异交水
平高[ 19] 。学者们[ 10 ,19～ 21]的研究中均发现异交率与
植物密度正相关。羽毛针禾居群的分布相对集中在
一个块状的区域 ,这种集中的分布很可能使不同基
因型植株之间的联系加大 ,从而使得异交水平提高。
羽毛针禾具有一个很重要的分布特点即植株聚
集分布和克隆生长 ,这就使得羽毛针禾的近交(自
交)所占的比例大大提高 。而在开花时的夏季风使
得羽毛针禾不同基株间的交配更加频繁和容易 ,因
此提高了居群的异交率 。汪小凡和陈家宽[ 5 ,22]对泽
泻科慈姑属的两种克隆植物小慈姑(Sagittaria pota-
mogetifolia Merr.)和矮慈姑(Sagittaria pygmaea)进行
了研究 ,发现小慈姑的异交率明显高于矮慈姑 ,个别
居群达到 90%以上 。他们认为小慈姑通过珠芽克
隆生长所导致的空间遗传异质性远不及具匍匐茎的
矮慈姑 ,所以异交率受克隆生长影响程度稍低。羽
毛针禾的克隆繁殖靠根蘖形成新的植株 ,根蘖克隆
生长的空间遗传异质性程度可能不是太高 ,因此异
交率受克隆生长影响程度可能并不是太强 。羽毛针
663第 6期　　　　　　　　　　　　　　齐妍婷 ,等:羽毛针禾交配系统的 SSR分析　　　　　　　　　　　　　　　
禾居群有较高的异交水平 ,它可能是多种因素作用
的结果 ,本文只是分析了一些可能的情况 ,至于哪些
因素具体影响着羽毛针禾的交配系统 ,还需要大量
的实验验证和进一步深入的研究。
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SSR Analysis for Mating System in Stipagrostis Pennata
QI Yan-ting , DENG Bi-jian , YANG Bo , ZHANG Xia , WANG Shao-ming
(College of Life Sciences , Shihezi University / Xinjiang BINGTUAN Key Laboratory of Oasis Eco-Agriculture , Shihezi , Xinjing 832003 , China)
Abstract:Mating system in an open-pollinated breeding population Stipagrostis pennata was estimated by the codominant
SSR makers.A total of 160 individuals of S.pennata were investigated by using of 8 pairs of SSR primers.The multi-lo-
cus outcrossing rate(tm)was 0.839 and the single-locus outcrossing rate(ts)was 0.661.The multi-locus outcrossing rate
did not significantly differ from the single-locus outcrossing rate(tm -ts =0.178).The fixation index(F)was 0.158.
The estimations of tm , ts and F clearly indicate that outcrossing is predominant in the open-pollinated breeding popula-
tion S.pennata ,but the inbreeding is obvious.This is possibly influenced by factors such as plant density ,wind power
and so on.
Key words:Stipagrostis pennata;mating system;outcrossing rate;SSR
664　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷