全 文 ：水田七群体的ＩＴＳ基因片段序列研究
赵月梅１，２
（１．商洛学院生物 医药工程系，陕西 商洛 ７２６０００；
２．中国中医研究院 商洛中药材ＧＡＰ科研工程中心，陕西 商洛 ７２６０００）
摘 要：利用ＩＴＳ序列分析技术，对采自云南、广西、贵州共４个水田七居群共４０个样品进行遗传多样性研
究。结果表明：４个水田七居群各有一个独有单倍型，居群之间无共享单倍型，遗传多样性主要存在于居群之
间且可能与纬度有关，与地理距离关系不大。
关键词：水田七；ＩＴＳ序列；遗传多样性
１ 引言
水田七为薯蓣科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）蒟蒻薯属
（Ｔａｃｃａ）水田七的干燥块茎，是一种重要的中药
材，能够清热解毒，散瘀止痛。主要用于咽痛、牙
痛、胃热痛、痈肿、肠炎、肺结核以及烫、烧伤；带状
疱疹；跌打损伤；外伤出血等，内服外敷皆可［１］。
目前国内外已有部分学者对其化学成分进行了研
究，分离出了氨基酸，甾族皂苷类、黄酮、花青色素
和多种甾族苦味物质［２－３］；制剂方面水田七已经
制成了注射液，胶囊等；彭菲等［４］在原植物形态、
药材性状、显微特征及紫外光谱等几方面对水田
七进行了研究。水田七主要分布于广东、广西、贵
州、湖南、江西和云南等地区，老挝、越南和泰国也
有分布。由于该物种及其所在的属均具有潜在的
药用价值和生境破碎化、片段化等原因，使得该类
植物居群数量日渐缩小，甚至已接近濒危，大都被
列为稀有保护植物［５］。
转录间隔区（ＩＴＳ）存在于高度重复的核糖体
ＤＮＡ中，位于１８Ｓ和２６Ｓ基因之间，由５．８Ｓ基因
分为ＩＴＳ１和ＩＴＳ２两个区段，ＩＴＳ序列变异较
快，可以提供丰富的变异位点和信息位点，已经证
实它是许多植物类群系统分类与进化的重要分子
标记［６］，研究通过对分布最广的云南，贵州，广西
桂林，广西南宁３省区共４个居群４０个水田七样
品的ＩＴＳ序列变异性的比较来研究这些水田七
样品在进化上的亲缘关系，以期为该物种的合理
利用和保护提供理论依据。
２ 材料与方法
２．１ 材料来源
研究选取了云南普洱，贵州荔波，广西南宁，
广西桂林四个水田七主要分布区的共４０个样品，
采样时尽量选取其新鲜的叶片，用硅胶快速干燥
后带回实验室备用。材料具体来源见表１。
收稿日期：
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２０１１－０９－０１
通过三元二次肥效方程，可求得当地６６７ｍ２
最大施肥量为氮５．７８ｋｇ、磷４．２４ｋｇ、钾２．５４
ｋｇ，产量为４ ０７３ｋｇ／６６７ｍ２；最佳经济收入施肥
量为每６６７ｍ２ 氮３．０３ｋｇ、磷４．５２ｋｇ、钾１．２４
ｋｇ，产量为３ ８２４ｋｇ／６６７ｍ２。
３ 结论
在湟源县布置青蒜苗“３４１４”肥效试验，探索
不同氮、磷、钾肥施用量对青蒜苗产量及经济效益
的影响，结果表明：
（１）随着氮、磷、钾肥施用量的增加，青蒜苗产
量均有增加。该区青蒜苗施用氮肥增产效果最为
显著，增产率为３４．４２％，磷肥增产率为５．０８％，
钾肥为１６．９６％。
（２）在青蒜苗生产实践中，氮、磷、钾肥要合理
搭配使用，在当地生产条件下要使青蒜苗生产取
得最佳经济效益，推荐施肥量为每６６７ｍ２ 施纯氮
３．０３ｋｇ，纯五氧化二磷４．５２ｋｇ，纯钾１．２４ｋｇ。
参 考 文 献：
［１］ 幕芳，殷振江，段长林等．长武小麦对氮磷钾肥的利
用效果及推荐施肥量的研究［Ｊ］．陕西农业科学，
２０１０，（６）：６－９．
［２］ 王圣瑞，陈新平，高照祥等．“３４１４”肥料试验模型拟
合的探讨［Ｊ］．植物营养与肥料学报，２００２，８（４）：
４０９－４１３．
·７１１·２０１２（２） 陕 西 农 业 科 学
表１ 水田七居群信息
编号 种群缩写 取样数 地理位置 海拔 （ｍ） 单倍型组成
１ 广西南宁 １０ ２２°５３＇Ｎ，１０１°５６＇Ｅ ３００－４００ Ｈ１
２ 广西桂林 １０ ２４°４７＇Ｎ，１１０°２９＇Ｅ １２０－３５０ Ｈ２
３ 贵州荔波 １０ ２５°１６＇Ｎ，１０７°４３＇Ｅ ３００－４００ Ｈ３
４ 云南普洱 １０ ２２°１０＇Ｎ，１００°５１＇Ｅ ３５０－４５０ Ｈ４
２．２ ＤＮＡ的提取
ＤＮＡ 提取采用 ＣＴＡＢ 法提取全基因组
ＤＮＡ［７］，将ＤＮＡ溶于ＴＥ溶液中，终浓度大约为
５０ｎｇ／ｕｌ。
２．３ ＩＴＳ序列的扩增与测定
ＰＣＲ扩增反应在 ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）
９７００型ＰＣＲ仪上进行。ＩＴＳ片段扩增反应程序
采用：９７℃预变性３ｍｉｎ，９５℃变性２ｍｉｎ，５４℃退
火１．５ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ。３２个循环后，７２℃
延伸７ｍｉｎ。扩增反应采用２０μｌ的反应体系：包
括３０－６０ｎｇ的模板ＤＮＡ，２μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ，０．５
单位的 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶（５Ｕ／μｌ），１．５μｌ的
ＭｇＣｌ２ （２５ ｍｍｏｌ／ｌ），１．５ μｌ 的 ｄＮＴＰｓ（１０
ｍｍｏｌ／ｌ），正反向引物各２μｌ（５μｍｏｌ／ｌ），再添加
蒸馏水至２０μｌ。采用通用引物ＩＴＳ５：（５＇－
ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ － ３＇），
ＩＴＳ４：（５＇－ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３
＇），引物由上海生物工程公司合成。扩增得到的
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用上海
生物工程技术服务有限公司的纯化试剂盒纯化，
纯化产物经测序反应（测序引物与ＰＣＲ引物相
同），洗涤，变性后依据双脱氧链终止法［８］在
ＡＢＩ３７３０型自动测序仪上进行测序。为避免误差
所有片段均采用双向测序。
２．４ 序列分析
采用ＢＩＯＥＤＩＴ［９］进行序列查看；用 Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ２．０［１０］进行序列比对并人工校正，用 ＤＮＳＰ计
算单倍型类型、单倍型多样性（ｈ）和核苷酸多样
性（π）；用 ＭＥＧＡ ４．０［１１］进行系统发育分析，并以
自展法进行检测，共循环１ ０００次，采用邻接法
（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建严格一致树。然后用
Ｋｉｍｕｒａ双参数模型构建单倍型之间序列差异的
矩阵。
表２ 水田七４种单倍型ＩＴＳ变异位点信息
Ｓｉｔｅ １３ ４１ ４８ １１０ ２１０ ３４６ ４５３ ４９６ ５２３ ５４３ ５９５ ６０７ ６０８－６０９ ６４４ ６５３ ６７０ ６７８ ６９４－６９６
Ｈ１ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ ＴＣ － Ｇ Ｔ Ｇ ＧＣＡ
Ｈ２ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ － －－ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ －
Ｈ３ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ － －－ － Ａ Ｃ Ｇ －
Ｈ４ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ ＴＣ － Ｇ Ｔ Ｇ ＧＣＡ
３ 结果与分析
３．１ 水田七ＩＴＳ序列多态性分析
对水田七ＩＴＳ片断测序，获得７２２ｂｐ碱基
对。Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ 碱基的平均含量为 ２１．５％，
１９．４％，３０．３％，２８．８％ 其 中 Ｇ＋Ｃ 含 量 为
５９．１％，４０个样本共检测到多态性核苷酸变异位
点２１个（占全部碱基数目的２．９１％），简约信息
位点１４个（表２），序列中７个插入／缺失，其
余均为碱基之间的转换或颠换，转换／颠换（Ｒ）
为５．８。
３．２ 个体间的多态性分化，遗传距离及系统树构建
根据对４个居群共４０个样本的分析，共产生
４种单倍型，单倍型 Ｈ１分布于广西南宁居群，Ｈ２
分布于广西桂林居群；Ｈ３分布于贵州荔波居群，
Ｈ４分布于云南普洱居群，单倍型之间的核苷酸
变异率为０．３％－１．６％（表３），平均１．１％，单倍
型多样性（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）指数和核苷酸多
样性 （Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）指数分别为：ｈ＝
０．８５７和π＝０．００９８６；由 ＭＥＧＡ４．０生成的 ＮＪ
树可知（图１）：４个单倍型中，分布于广西南宁的
Ｈ１和云南普洱的 Ｈ４聚为一支，逐步与贵州荔波
·８１１· 陕 西 农 业 科 学 ２０１２（２）
居群 Ｈ３聚类，最后与广西桂林居群 Ｈ２聚类。
表３ 水田七各单倍型间基因序列差异
１ ２ ３ ４
１Ｈ１
２Ｈ２ ０．０１６
３．Ｈ３ ０．０１１ ０．０１３
４．Ｈ４ ０．００３ ０．０１４ ０．０１０
图１ 基于ＩＴＳ区基因序列构建无根ＮＪ树
４ 讨论
研究利用ＩＴＳ序列变异得知该序列４种单
倍型的碱基平均的转换／颠换（Ｒ）为５．８，说明该
物种ＩＴＳ序列变异非常显著，一般认为所分析序
列的转换颠换比值小于２．０时，此基因序列突变
已经达到饱和状态，受到进化噪音的影响可能性
较大，系统分析时需要进行加权分析［１２］；笔者研
究中转换颠换比值为５．８，远大于２．０，因此ＩＴＳ
基因适合于该物种的居群序列分析；序列中Ｇ＋
Ｃ含量达到５９．１％，说明该序列保守性很强；单
倍型间的核苷酸平均变异率为１．１％，处于较中
等偏低的遗传变异水平；单倍型多样性为０．８５７，
且居群之间无共享单倍型，居群之内单倍型多样
性为０，因此水田七的遗传多样性多来自于居群
之间，而许多研究表明地理隔离是影响物种居群
间遗传多样性的重要因素［１３］。利用 ＭＥＧＡ４．０
构建ＮＪ树得知水田七居群遗传结构的特点：云
南普洱居群（Ｈ４）和广西南宁居群（Ｈ１）亲缘关系
最近，贵州荔波居群（Ｈ３）居中，广西桂林居群
（Ｈ２）和前三者的亲缘关系比较远；而地理位置上
来看：①普洱和南宁之间的地理距离远大于桂林
和南宁之间的地理距离，②普洱和南宁纬度接近，
桂林纬度较高。而荔波居群无论遗传距离还是地
理位置均位于中间位置。由此可见分布于滇、
黔、桂地区的水田七遗传结构和纬度的关系较大，
但和地理距离无显著联系。
研究表明ＩＴＳ序列适用于水田七物种种内
不同居群之间的遗传关系，因此该序列对于研究
该属的其他物种种内，种间的系统发育和物种鉴
定都具有一定的参考意义。水田七作为一种重要
的中药材，与属内其他物种形态上的相似性使其
很难正确鉴定到种，现代分子生物学的发展不仅
为其准确可靠的鉴定提供了方便的技术手段，也
可以为该物种制定保护政策提供理论依据。如研
究中四个居群变异均存在于居群之间，所以在制
定保护政策时要尽量兼顾到更多的小居群，以保
持其较高的遗传多样性。
参 考 文 献：
［１］ 冉先得．中华药海下册［Ｍ］．哈尔滨：哈尔滨出版
社，１９９３．
［２］ Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｒ Ｄ，Ｔｉｗａｒｉ Ｋ Ｐ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａ－
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｔａｃｃａ ａｓｐｅｒａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，
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［３］ 陈仲良，王保德，陈民勤．箭根薯（Ｔａｃｃａ）苦味成分
的研究 ［Ｊ］．化学学报，１９９８，４６（１２）：１ ２０１．
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ｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ
Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
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［１１］ Ｔａｍｕｒａ Ｋ，Ｄｕｄｌｅｙ Ｊ，Ｎｅｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＧＡ４：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）
ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅ－
ｖｏｌｕｔｉｏｎ．，２００７．２４：１ ５９６－１ ５９９．
［１２］ ＫＮＩＧＨＴ Ａ，ＭＩＮＤＥＬＬ Ｄ Ｐ．Ｓｕｂｓｔｉｔｉｏｎｓ ｂｉａｓ，
ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙ－
ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｅａ＇ｓ ｖｉｐｅｒ［Ｊ］．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉ－
ｏｌｏｇｙ，１９９３，４２（１）：１８－３１．
［１３］ Ｓｌａｔｋｉｎ Ｍ Ｇｅｎｅ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３６，７８７－７９２．
·９１１·赵月梅：水田七群体的ＩＴＳ基因片段序列研究