全 文 ：失眠是临床常见病、 多发病， 随着社会各种压
力的增加， 发病率越来越高。 现代医学对本病治疗
多以镇静安眠为主， 但有一定的副作用， 中医药治
疗有独特优势， 疗效较好［1］。 夜交藤性平无毒， 味
甘微苦， 入心、 肝经， 有引阳入阴， 调和阴阳， 养
心安神的功效， 故临床常用于治疗失眠 ［2］。 目前有
关夜交藤提取物与失眠之间的研究还不是很多， 特
别是对中枢神经系统影响的研究甚少。 故本研究拟
从线粒体的功能和结构改变的途径来探讨夜交藤提
取物对失眠大鼠大脑皮层神经元的改善作用， 现报
道如下。
1 材料与方法
1． 1 动物及分组 SPF 级 9 月龄 SD 大鼠 56 只，
体质量 350 g 左右， 雌雄各半， 广州中医药大学实
验动物中心， 合格证号： SCXK （粤） 2013－0020。
随机分为 7 组， 每组 8 只， 即正常对照组、 模型
组、 安定治疗组、 褪黑素治疗组和夜交藤提取物
低、 中、 高剂量治疗组。
1． 2 主要试剂和仪器 夜交藤提取物 （西安赛奥
生物技术有限公司， 批号： 20110805， 含夜交藤甙
98．5 mg ／ g、 夜交藤蒽醌 39．8 mg ／ g、 夜交藤黄酮
44．3 mg ／ g）； 对氯苯丙氨酸 （PCPA） 为美国 Sigma
公司产品； 安定 （上海医药集团有限公司信谊制药
总厂， 批号： 111005）； 褪黑素片 （汤臣倍健公司，
批号： 20111202）； ATPase 试剂盒为南京建成生物
工程研究所产品 ； IX71 倒置荧光显微镜 （日本
Olympus 公司）， 5430R 低温超高速离心机 （德国
Eppendorf 公司 ） ， 酶标仪 （瑞士 Tecan 公司 ，
Tecan sunrise）； Tecnai G2 20 透射电子显微镜 （英
国 Philips公司）。
1． 3 模型制作 失眠模型复制采用 PCPA 腹腔注
射的方法［3］， 除正常组注射生理盐水外， 其余组每
天 13 ∶ 00按 3 mL ／ kg腹腔注射 PCPA混悬液 （浓度
为 0．1 g ／ mL）， 连续 3 d。
1． 4 药物与给药 造模同时各组开始灌胃， 灌胃
量为 1 mL， 连续治疗 10 d。 正常对照组和模型组
给予生理盐水， 安定按文献给予 0．92 mg ／ kg灌胃［4］，
褪黑素按照 10 mg ／ kg 灌胃 ［5］。 夜交藤提取物低、
中、 高剂量治疗组 （中药低、 中、 高剂量组） 参考
文献［6］分别按 3、 6、 12 g ／ kg剂量进行灌胃。
1． 5 线粒体制备 实验结束后各组大鼠经 100
mg ／ L水合氯醛 （350 mg ／ kg） 腹腔注射麻醉， 迅速
断头取脑并立即置入冰冷的生理盐水中， 洗净血
污， 剥离皮层并于 2 mL 的分离介质中剪碎， 迅速
转移至玻璃匀浆管中 （1 min 之内完成）， 电动匀
收稿日期： 2013－04－02
作者简介： 许晓伍 （1975－）， 男， 副教授； E－mail： xujf868＠gzucm．edu．cn
通讯作者： 陈群， 女， 教授， 博士研究生导师； E－mail： chenqun＠gzucm．edu．cn
夜交藤提取物对失眠大鼠额叶皮层神经元线粒体结构和功能的影响
许晓伍 1， 陈群 2， 郝木峰 1， 马春媚 1， 谭海智 3
（1． 广州中医药大学基础医学院解剖学教研室， 广东广州 510006； 2． 广州中医药大学基础医学院中医诊断学教研室，
广东广州 510006； 3． 广州中医药大学针灸推拿学院针灸专业 2008 级本科生， 广东广州 510006）
摘要：【目的】 探讨夜交藤提取物对失眠大鼠额叶皮层神经元线粒体超微结构和功能的影响。 【方法】 选用 9 月龄 SD 大鼠， 采
用对氯苯丙氨酸 （PCPA） 对大鼠进行造模后， 随机分为正常对照组， 模型组， 安定治疗组（剂量为 0．92 mg ／ kg） ， 褪黑素治
疗组（剂量为 10 mg ／ kg） 和夜交藤提取物低、 中、 高剂量治疗组（剂量分别为 3、 6、 12 g ／ kg） ； 分别采用透射电子显微镜和
荧光显微镜观察线粒体的超微结构变化和膜电位改变， 并测定线粒体 ATP 酶含量。 【结果】夜交藤提取物治疗后大鼠额叶皮层
神经元线粒体超微结构趋于好转； 同时随着夜交藤提取物剂量的增加， 线粒体 Na＋－K＋－ATPase、 Ca2＋－Mg2＋－ATPase 的含量
也显著增加 （P＜0．05）。 【结论】 夜交藤提取物可能通过改善线粒体的超微结构和增加 Na＋－K＋－ATPase、 Ca2＋－Mg2＋－ATPase 的
含量而改善失眠。
关键词： 夜交藤提取物 ／药理学； 失眠 ／中药疗法； 线粒体 ／超微结构； 疾病模型， 动物； 大鼠
中图分类号： R285．5 文献标志码： A 文章编号： 1007 － 3213 （2013） 06 － 0872 － 04
广州中医药大学学报
Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
2013 年 11 月第 30 卷第 6 期
November 2013，Vol． 30，No． 6872
浆， 分离介质稀释， 离心， 所得沉淀用分离介质悬
浮， 制成1 mL 混悬液。 装在离心管中于碎冰中保
存。 全程冰上操作， 提取完成后立即测定。 线粒体
蛋白含量以考马斯亮兰 （Bradford） 法［7］进行测定。
1． 6 线粒体的超微结构观察 动物实验结束灌注
后取脑， 留取大脑额叶皮层直径 3 mm 的组织块，
放入混合固定液中隔夜固定。 修 1 mm × 1 mm × 1
mm 大小组织块， 以体积分数 2．5％戊二醛和 1％四
氧化锇酸双重固定 ， 漂洗 ， 丙酮逐级脱水 ，
Epon812 包埋， 半薄切片光学定位， 超薄切片厚度
为 50 nm， 醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后于透射电
镜下观察。 每只大鼠观察 1张铜网， 每张铜网由左
上角至右下角斜线上下移动， 随机拍摄 5张照片。
1． 7 线粒体 Na ＋ －K ＋ －ATPsae， Ca2 ＋ －Mg2 ＋
－ATPase 活力测定 各组大鼠实验结束后断头处
死， 迅速在冰盘上取大鼠脑部皮质， 暂时保存待
测。 用滤纸吸干大脑皮质外部残血， 精确称质量，
加入冰生理盐水， 制备成组织匀浆。 取组织匀浆用
普通离心机离心， 弃沉淀取上清， 再低温离心， 沉
淀物为线粒体 （线粒体的提取按试剂盒要求操作，
中性红—詹纳斯绿 B 染色鉴定线粒体）， 线粒体
Na＋－K＋－ATPase、 Ca2＋－Mg2＋－ATPase 严格按照南京
建成生物工程研究所的试剂盒操作步骤进行测定，
ATP 酶活力单位为微摩分子磷 （毫克蛋白·小时）
［μmolPi ／ （mgprot·h）］ ［8］。
1． 8 统计方法 测定结果数值采用均数 ± 标准差
（x ± s） 来表示， 利用 SPSS 10．0 统计软件进行单
因素方差分析 （one－way ANOVA）， 方差齐性时用
LSD或 S－N－K进行比较， 方差不齐时用 Tamhane’s
T2检验， 以 α＝0．05为检验水准。
2 结果
2． 1 各组线粒体超微结构观察 图 1 结果显示：
9 月龄正常大鼠造模后额叶皮层线粒体明显肿胀，
嵴大部分断裂且出现边集化甚至空泡化， 说明线粒
体功能下降明显； 经安定和褪黑素治疗后线粒体肿
胀明显减轻， 线粒体比较完整； 而夜交藤提取物低
剂量治疗后线粒体肿胀有所减轻， 但体积仍较正常
组增大， 线粒体嵴仍有部分断裂， 线粒体不完整；
夜交藤提取物中剂量和高剂量治疗后线粒体较为完
整， 体积和正常组比较不大， 嵴基本无断裂。
2． 2 各组线粒体 Na＋－K＋－ATPase， Ca2＋－Mg2＋－
ATPase 活力测定 表 1 结果显示： 与正常对照组
比较， 模型组线粒体 Na＋－K＋－ATPase、 Ca2＋－Mg2＋－
ATPase 活力显著降低 （P＜0．05）。 与模型组比较，
除夜交藤低剂量治疗组外其余各组均有提高， 差异
均有统计学意义 （P＜0．05）。
a．正常对照组 b．模型组 c．安定治疗组 d．褪黑素治疗组
e．中药低剂量组 f．中药中剂量组 g．中药高剂量组
图 1 各组大鼠额叶皮质神经元线粒体超微结构比较 （透射电镜， ×15 000）
Figure 1 Comparison of mitochondrial ultrastructure of frontal cortex of insomnia mice in various groups
许晓伍， 等． 夜交藤提取物对失眠大鼠额叶皮层神经元线粒体结构和功能的影响第 6 期 873
表 1 各组大鼠额叶皮质神经元线粒体 Na＋－K＋－ATP，
Ca2＋－Mg2＋－ATPase 活力比较 （x ± s）
Table 1 Comparison of mitochondrial Na ＋－K ＋－ATPase，
Ca2＋－Mg2＋－ATPase activities in frontal cortex of insomnia
mice in various groups
①P＜0．05， 与正常对照组比较； ②P＜0．05， 与模型组比
较； ③P＜0．05， 与中药低剂量组比较； ④P＜0．05， 与中药中
剂量组比较
组别 N Na＋－K＋－ATPase
中药高剂量组 8 22．03 ± 4．63②
Ca2＋－Mg2＋－ATPase
15．43 ± 4．02②
正常对照组 8 44．69 ± 3．25 27．01 ± 5．25
模型组 8 9．05 ± 1．96① 9．22 ± 2．44①
安定治疗组 8 37．74 ± 6．92②③④ 22．38 ± 3．30②③④
褪黑素治疗组 8 35．06 ± 8．40②③④ 20．36 ± 4．64②③④
中药低剂量组 8 14．80 ± 3．88 14．19 ± 3．86
中药中剂量组 8 18．54 ± 4．02② 14．96 ± 2．08②
b ／ （×10－2， μmol·mg－1·h－1）
3 讨论
正常睡眠是在心神的主导下， 阴阳之气自然而
规律转化的结果。 这一规律遭到破坏， 就可能导致
失眠。 “寐本乎阴， 神其主也， 神安则寐， 神不安
则不寐” （《景岳全书》）。 《类证治裁·不寐》 中亦
说： “阳气自动而之静， 则寐； 阴气自静而之动，
则寤； 不寐者， 病在阳不交阴也。” 因此， 失眠病
机总属阳盛阴衰， 阴阳失交［9］。 治疗上应以安神为
基本法则。 中药治疗失眠已取得确切疗效， 研究显
示中医药可抑制大脑皮层兴奋性， 促进大脑皮层兴
奋和抑制过程的平衡， 从而改善睡眠［10－11］。
现代医学认为： 失眠主要由于内在因素或外界
条件的变化， 使大脑皮层兴奋与抑制的平衡失调而
引起。 失眠主要的病理基础是大脑皮质内抑制过程
的减弱［12］； 神经衰弱导致失眠， 脑电图 （EEG） 显
示皮层兴奋性增强［13］； 采用氦氖激光血管内照射可
使失眠患者神经系统兴奋和抑制过程恢复平衡， 从
而改善症状， 可避免因服用镇静催眠药物所产生的
副作用［14］。
线粒体作为细胞正常生理活动的能量工厂， 其
基本功能是通过氧化磷酸化以 ATP 的形式为细胞
生命活动提供 95％的能量。 当细胞受到内外因素
干扰时， 线粒体反应最早， 变化最敏感、 也最明
显， 是决定细胞由可逆到不可逆改变的关键细胞
器［15］， 故采用线粒体作为观察指标。 脑内神经元功
能的维持必须通过线粒体的氧化磷酸化产生 ATP
获取能量［16］， 当线粒体功能不足、 ATP 生成减少
时， 神经元结构的完整性就受到影响， 其功能便不
可避免地发生退变。 其中， Na＋－K＋－ATP 酶和 Ca2＋－
Mg2＋－ATP 酶是广泛分布在生物膜的酶系统， 它们
对维持细胞的正常生理功能起着极其重要的作
用［14］。
夜交藤是中医临床常用的养心安神药， 多与其
他药物配伍治疗各种失眠症［17－19］， 但有关其对失眠
的影响的实验研究不多［20－23］， 也无研究观察对失眠
大鼠皮层线粒体的影响。 本研究结果显示夜交藤提
取物可以改善失眠模型大鼠皮层线粒体的超微结构
改变， 使线粒体肿胀减轻， 嵴断裂减少， 且随着剂
量增大， 改善趋于明显。 同时， 在 Na＋－K＋－ATPase
和 Ca2＋－Mg2＋－ATPase活力检测中也发现夜交藤提取
物也可增加失眠大鼠皮层线粒体上述 2 种酶的含
量， 但尚不足以恢复到正常水平； 随着夜交藤提取
物治疗剂量的增加， 皮层线粒体 ATP 酶含量的也
趋于增加， 呈现一定的剂量效应关系。
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【责任编辑： 黄玲】
Effects of Ramulus Polygoni Multiflori Extracts on Mitochondrial Structure
and Function in Frontal Cortex Neurons of Insomnia Rats
XU Xiaowu1， CHEN Qun2， HAO Mufeng1， MA Chunmei1， TAN Haizhi3
（1． Dept． of Anatomy， School of Basic Medical Science， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006 Guangdong，
China； 2． Dept． of Diagnostics of Traditional Chinese Medicine， School of Basic Medical Science， Guangzhou University of Chinese
Medicine， Guangzhou 510006 Guangdong， China； 3． Undergraduate Candidate in 2008， Clinical Medical School of Acupuncture， Massage
and Rehabilitation， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006 Guangdong， China）
Abstract： Objective To explore the effect of Ramulus Polygoni Multiflori extracts on mitochondrial ultrastructure
and function in the frontal cortex neurons of insomnia rats． Methods Nine－month－old rats were randomly divided
into normal control group， model group， antipsychotic treatment group （0．92 mg ／ kg）， melatonin treatment
group （10 mg ／ kg） and low－， middle－and high－dose Ramulus Polygoni Multiflori extracts treatment groups
（3， 6， 12 g ／ kg， respectively）． Insomnia rat model was induced with para－chlorophenylalanine （PCPA） ．
The mitochondrial ultrastructure features and membrane potential changes were observed under electron
microscope and fluorescence microscope ， respectively． ATP enzyme content in the mitochondria was also
determined． Results The mitochondrial ultrastructure pathological changes in the prefrontal cortex neurons of
insomnia rats were relieved after treatment with Ramulus Polygoni Multiflori extracts． With the increase of the
dose of Ramulus Polygoni Multiflori extracts， the contents of Na＋－K＋－ATPase and Ca2＋－Mg2＋－ATPase also were
increased （P＜0．05） ． Conclusion Ramulus Polygoni Multiflori extracts can relieve insomnia probably through
improving mitochondrial ultrastructure and through increasing the mitochondrial contents of Na ＋－K＋－ATPase and
Ca2＋－Mg2＋－ATPase．
Key words： Ramulus Polygoni Multiflori extracts ／ pharmacology；
Insomnia ／ TCD therapy；
Mitochondria ／ ultrastructure；
Disease models， animal； Rats
许晓伍， 等． 夜交藤提取物对失眠大鼠额叶皮层神经元线粒体结构和功能的影响第 6 期 875