全 文 ：·实验研究·
＊国家自然科学基金（Ｎｏ．８１２６０６７９）
△通讯作者 宁夏医科大学药学院（银川７５０００４）
白胡椒和黑胡椒配伍清除羟基自由基和超氧阴离子作用研究＊
李　莉　赵启鹏△　平顶山学院医学院（平顶山４６７０００）
　摘　要　目的：通过研究白胡椒和黑胡椒配伍清除羟基自由基和超氧阴离子作用，阐明白胡椒和黑胡
椒的配伍意义。方法：分别用６５％乙醇、８０％乙醇、９５％乙醇提取白胡椒和黑胡椒，维生素Ｃ
做阳性对照，采用邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲法测定其抗氧化作用，得出最佳提取乙醇浓
度，后用最佳乙醇浓度提取白胡椒和黑胡椒配比物（配比为１∶１、１∶２、１∶３、３∶１、２∶１、１
∶０、０∶１）。结果：白胡椒和黑胡椒清除羟基自由基最佳提取乙醇浓度为６５％，白胡椒和黑
胡椒１∶３配比清除羟基自由基最强；白胡椒和黑胡椒清除超氧阴离子最佳提取乙醇浓度为
８０％，白胡椒和黑胡椒１：１配比清除超氧阴离子最强。结论：白胡椒和黑胡椒等量使用可以
从清除超氧阴离子实验中得到支持；白胡椒和黑胡椒不同比例配伍能增加作用效果。
　主题词　白胡椒／药效学　黑胡椒／药效学
　【中图分类号】　Ｒ２８２　【文献标识码】　Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１４．１１．０７１
　　胡椒（Ｐｉｐｅｒ　ｎｉｇｒｕｍ　Ｌ．）属胡椒科（Ｐｉｐｅｒａｃｅａ），多年生常绿
藤本植物，原产于印度，是世界重要的热带香辛料作物，在医学
工业和食品工业都有广泛用途。成熟的胡椒果晒干后果皮皱
缩变黑为黑胡椒，成熟果实脱皮后称为白胡椒。胡椒性热，味
辛，有温中散寒、下气、消痰之功效。胡椒含胡椒碱、水芹烯、丁
香烯等成分，具有除臭、防腐和抗氧化作用。
《回回药方》成书于元朝中、后期，是一部回族医药典籍，是
研究中国回医药学的重要文献之一［１］。《回回药方》中有许多
治疗脑卒中的药方，其中大多数药方中均有白胡椒和黑胡椒，
且用量相同，本研究旨在采用体外抗氧化方法研究两者之间不
同的配比对抗氧化作用的影响。
１　材料与方法　１．１　药品与试剂　白胡椒、黑胡椒（购
自海南文昌）；维生素Ｃ（批号１００９０４２６，西安利君有限责任公
司生产）。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液 （５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　８．２）；ＰＢＳ粉末
（批号：２０１００８１７，天津市光复科技发展有限公司生产）；邻二氮
菲（批号：２０１１０１２４，天津市大茂化学试试厂生产）；３０％过氧化
氢（批号：２０１００９１５，国药集团化学试剂有限公司生产）；硫酸亚
铁晶体（批号：２０１１０１２１，天津市光复科技发展有限公司生产）；
邻苯三酚（批号：２０１００４２５，天津市大茂化学试试厂）；９５％乙醇
（批号：２００９０１１０，天津市科密欧化学试剂有限公司生产）；无水
乙醇（批号：２０１０１１０８，天津市瑞金特化学品有限公司生产）。
１．２　主要仪器　中草药粉碎机（ＦＷ１７７型，天津市泰斯特
仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（ＨＨ－２型，金坛市鸿科仪器
厂）；超声波清洗器（ＫＱ－５００ＤＡ 型，昆山市超声仪器有限公
司）；台式离心机（ＴＧＬ－１６Ｇ型，上海安亭科学仪器厂）；可见紫
外分光光度计（岛津 ＵＶ－２５５０型）；电子分析天平 （岛津 ＡＥＵ－
２１０型）。
１．３　实验方法　１．３．１邻二氮菲法［２］：邻二氮菲－Ｆｅ２＋是
常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还
原状态的改变。羟自由基是强氧化剂，作为反应物，Ｈ２Ｏ２／
Ｆｅ２＋体系可通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟自由基，邻二氮菲－Ｆｅ２＋水
溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Ｆｅ３＋后，其５１０ｎｍ最大吸收
峰消失。当反应体系中存在·ＯＨ清除剂时，该氧化过程受到
抑制，Ａ５１０ｎｍ则降低不明显，故可通过５１０ｎｍ处 Ａ值比较抗氧
化剂清除·ＯＨ的能力。
Ｆｅ２＋＋ Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ３＋ ＋·ＯＨ＋ＯＨ－；Ｆｅ２＋ ＋邻二氮菲→
Ｆｅ２＋ －邻二氮菲（λｍａｘ５１０ｎｍ）；·ＯＨ ＋Ｆｅ２＋ －邻二氮菲→
Ｆｅ３＋ －邻二氮菲。
在１０ｍＬ试管中依次加入１．５ｍｍｏｌ／Ｌ邻二氮菲无水乙醇
１．０ｍＬ、ＰＨ值为７．４的ＰＢＳ缓冲液２．０ｍＬ和蒸馏水１．０ｍＬ，
充分混匀，加入１．５ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４溶液１．０ｍＬ ，边加入边摇
匀，再加入０．０１５％Ｈ２Ｏ２溶液１．０ｍＬ，置于３７℃水浴中反应
６０ｍｉｎ，以体积比为２∶１的缓冲液和双蒸水做参比液，在
５１０ｎｍ波长处测其吸光度Ｄ１。
按上述操作步骤，用１．０ｍＬ双蒸水代替１．０ｍＬ　０．００１５％
Ｈ２Ｏ２，在５１０ｎｍ测其吸光度Ｄ２；用不同浓度的样品代替１．０ｍＬ
双蒸水，以体积比为２∶１的缓冲液和双蒸水做参比液，在
５１０ｎｍ波长处测其吸光度Ｄ３，每次加样品充分摇匀。具体操
作步骤见下表一。按下列公式计算清除率。抑制率（％）＝１００
×（Ｄ３－Ｄ１）／（Ｄ２－Ｄ１）Ｄ３、Ｄ１、Ｄ２分别为加入加样品、不加样
表１　黑、白胡椒清除·ＯＨ自由基操作表
试剂
测定管１
（Ｄ１）
测定管２
（Ｄ２）
测定管３
（Ｄ３）
调 零 管
邻二氮菲无水乙醇
溶液（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
１ — １ —
ＰＢＳ缓冲液
（ｐＨ　７．４）
２　 ２　 ２　 ４
双蒸水 １　 １　 ０．６　 ２
样　品 — — ０．４ —
ＦｅＳＯ４溶液
（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
１　 １　 １ —
Ｈ２Ｏ２（０．００１５％） １ — １ —
双蒸水 — １ — —
　　注：置于３７℃水浴中反应３０ｍｉｎ
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品、不加样品和 Ｈ２Ｏ２体系的吸光度值。
１．３．２邻苯三酚自氧化法［３］：邻苯三酚在弱碱性环境下发生
自氧反应生成Ｏ２－·，邻苯三酚自氧化产物最大吸收波长为３００
ｎｍ，而Ｏ２－·清除剂能使其产物在３００ｎｍ处吸收峰受到抑制，随
着３００ｎｍ处Ａ值的变化来比较Ｏ２－·清除剂的清除能力。
邻苯三酚自氧化法产生Ｏ２－·。取５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓
冲溶液 （ｐＨ　８．２）４．５ｍＬ，立即加入预热的３ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚
０．５ｍＬ，迅速摇匀后倒入比色皿，以不加邻苯三酚溶液作对照，
在３００ｎｍ下每隔３０ｓ测定一次Ｄ值，重复三次，取平均值，连续
测定 ｍｉｎ，计算线性范围内邻苯三酚自氧化速率。
按上述步骤在加入邻苯三酚之前，分别加入样品溶液０．
１ｍＬ，相应减少双蒸水的量，同样以不加入邻苯三酚溶液作对
照，在３００ｎｍ下测吸光度值，一吸光度和时间作图表示邻苯三
酚自氧化得抑制情况。具体操作步骤见下表二。根据公式计
算抑制率。
抑制率（％）＝１００×（Ｄ３＿Ｄ４）／Ｄ３
Ｄ３为邻苯三酚自氧化吸光度值，Ｄ４为加入样品液后邻苯
三酚自氧化吸光度值。
表２　黑、白胡椒清除Ｏ２－·自由基操作表
试剂
对照管
（Ｄ１）
测定管
（Ｄ３）
对照管
（Ｄ２）
样品测定管
（Ｄ４）
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液
（５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　８．２）△
４．５　 ４．５　 ４．５　 ４．５
样品 — — ０．２　 ０．２
邻苯三酚（３ｍｍｏｌ／Ｌ）▲ — ０．５ — ０．５
双蒸水 ０．７　 ０．２　 ０．５ —
浓盐酸 ０．５　 ０．５　 ０．５　 ０．５
　　注：△置于３７℃水浴２０ｍｉｎ，▲置于３７℃水浴４ｍｉｎ
　　２　结　果　２．１　乙醇最佳浓度的选取　用６５％、
８０％、９５％乙醇提取白胡椒黑胡椒，用紫外分光光度计测定，数
据如下。
２．１．１不同溶剂提取物对羟基自由基清除作用：
表３　黑、白胡椒不同浓度乙醇提取物
对羟基自由基清除作用的影响
抑制率（％） ６５％乙醇提取物 ８０％乙醇提取物 ９５％乙醇提取物
白胡椒 ４４．８０　 ３７．１０　 ２８．９６
黑胡椒 ５７．９２　 ４６．１５　 ３２．１２
维生素Ｃ 　 ８０．５４
由表３可知，６５％乙醇提取物抑制率羟基自由基较好，并且黑
胡椒抑制羟基自由基较好。
２．１．２不同溶剂提取物对超氧阴离子清除作用：
表４　黑、白胡椒不同浓度乙醇提取物
对超氧阴离子清除作用的影响
抑制率（％） ６５％乙醇提取物 ８０％乙醇提取物 ９５％乙醇提取物
白胡椒 １２．２３　 ２７．８５　 ３．３７
黑胡椒 ８．５８　 １８．２８　 ６．１９
维生素Ｃ 　 ８２．９８ 　
由表４可知，８０％乙醇提取物抑制超氧阴离子较好，并且白胡
椒抑制超氧阴离子较好。
２．２　白胡椒和黑胡椒互配对羟基自由基、超氧阴离子的
影响
２．２．１白胡椒和黑胡椒互配对羟基自由基的影响：用６５％
乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，结果表明，白胡椒：
黑胡椒为１∶３的比例清除羟基自由基作用最佳。
表５　白胡椒和黑胡椒互配对
清除羟基自由基作用的影响
白胡椒∶黑胡椒 抑制率（％）
１∶３　 ７８．７１
１∶２　 ６３．８５
１∶１　 ６８．２７
２∶１　 ６１．０４
３∶１　 ６５．４６
１∶０　 ４９．８０
０∶１　 ５９．０４
维生素Ｃ　 ８７．５５
　　２．２．２白胡椒和黑胡椒互配对超氧阴离子的影响：用８０％
乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，结果表明，白胡椒：
黑胡椒为１∶１的比例清除超氧阴离子的作用最佳。
表６　白胡椒和黑胡椒互配对
清除超氧阴离子作用的影响
白胡椒∶黑胡椒 抑制率（％）
１∶３　 ３６．０８
１∶２　 ４７．２１
１∶１　 ５６．３６
２∶１　 ４９．０９
３∶１　 ３０．３５
１∶０　 ２９．３７
０∶１　 ２６．７１
维生素Ｃ　 ８５．８７
　　３　讨　论　本研究参照对陈文学［４］、王颖［５］等人黑胡椒
和白胡椒研究。研究表明，黑、白胡椒清除羟基自由基的最佳
乙醇提取浓度为６５％，而清除超氧阴离子的最佳乙醇提取浓度
为８０％。这与陈文学［４］等人对白胡椒黑胡椒互配最佳乙醇浓
度研究的结果有所不同，他们用油脂抗氧化值的检测方法，最
佳乙醇浓度为８０％。这说明，方法对最佳乙醇浓度的选取有一
定的影响。白胡椒清除超氧阴离子的能力略优于黑胡椒，黑胡
椒清除羟基自由基的能力略高于白胡椒。这与王颖［５］等人对
黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力进行比较
研究结果有所差异。他们用水蒸气蒸馏提取黑胡椒和白胡椒
精油，研究表明黑胡椒精油在清除羟基自由基和超氧阴离子的
能力都强于白胡椒精油。我们用超声波提取法提取黑胡椒和
白胡椒，所用的是乙醇提取液，这种不同之处可能导致了研究
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结果出现的差异。白胡椒∶黑胡椒为１∶１的比例清除超氧阴
离子的作用最佳，与《回回药方》中二者等量使用相符；而白胡
椒∶黑胡椒为１∶３的比例清除羟基自由基作用最佳。黑、白
胡椒等量配伍使用的更深入的机制有待进一步研究。
参考文献
［１］　冯彩琴，牛　阳，杨　东，等．《回回药方》防治脑系疾
病的剂型及用药规律探析［Ｊ］．宁夏医科大学学报，２０１１，３３
（２）：１０３－１０４．
［２］　Ｂｅｎｚｉｅ　ＩＦ，Ｓｔｒａｉｎ　ＪＪ．Ｔｈｅ　ｆｅｒｒｉｃ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ
ｐｌａｓｍａ（ＦＲＡＰ）ａｓ　ａ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｏｆ“ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｐｏｗｅｒ”：ｔｈｅ
ＦＲＡＰ　ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，２３９（１）：７０－７６．
［３］　赵咏梅，赵银萍，李宝茹．三种中成药抗氧化活性的
测定［Ｊ］．陕西中医，２０１１，３２（２）：２２１－２２３．
［４］　陈文学，豆海港，仇厚援，等．胡椒抗氧化产物提取条
件的研究［Ｊ］．热带农业科学，２００５，２５（２）：１－３．
［５］　王　颖，姜子涛，李　荣，等．黑胡椒和白胡椒精油抗
氧化性能及清除自由基能力的比较［Ｊ］．中国调味品，２００９，３４
（５）：５０－５８．
（收稿２０１４－０２－１２；修回２０１４－０３－２０）
＊陕西省科技厅资助项目（２０１２ｋ１９－０５－０４）
△陕西中医学院（咸阳７１２０４６）
地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血后ＳＤＦ－１蛋白的影响＊
王　倩△　 范文涛△　 贺又舜　湖南中医药大学（长沙　４１０２０８）
　摘　要　目的：探讨地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血后ＳＤＦ－１蛋白的影响。方法：ＳＤ雄性大鼠７５只，
随机分为模型组、地黄饮子高剂量组、地黄饮子中剂量组、地黄饮子低剂量组、伪手术组，每
组１５只。观察局灶性脑缺血后各组脑梗死面积、ＢｒｄＵ阳性细胞数量、ＳＤＦ－１蛋白含量的变
化。结果：地黄饮子能有效减轻脑水肿，减少脑梗死面积，大剂量组和中剂量组疗效较好。
对大鼠ＢｒｄＵ阳性细胞的数量比较，在ＣＡ１区和ＣＡ３区、ＤＧ区，地黄饮子高剂量组与模型
组比较，差异具有非常显著性。各组大鼠脑内ＳＤＦ－１蛋白含量测定，地黄饮子高剂量组和
中剂量组与模型组比较有非常显著差异。结论：地黄饮子能促进脑缺血后大鼠神经功能恢
复，减轻脑水肿，减少脑梗死面积。促进ＳＤＦ－１蛋白含量的升高，通过ＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４信号
通路进一步促进海马区神经干细胞增殖，并迁移至缺血损伤区域分化成神经元，修复缺血区
损伤。
　主题词　地黄饮子　局灶性脑缺血　 动物，实验　大鼠
　【中图分类号】　Ｒ７４３　【文章标识码】　Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１４．１１．０７２
　　脑卒中在我国是第一死亡原因和致残原因，严重影响患者
生存质量，给社会和家庭带来巨大的经济和精神负担，但如何
降低死亡率和致残率的问题尚未解决［１］。最新研究表明内源
性神经再生障碍是影响脑卒中神经功能恢复的主要机制，虽然
脑缺血可促进部分内源性神经干细胞增殖，只有非常少的一部
分约０．２％最终分化为神经元［２］。如何促进内源性神经再生？
中药促进神经再生的作用机制及作用靶点是什么？这些问题
如不解决，会影响脑卒中神经功能恢复，进一步制约治疗方法
的优化。因此，开展中药促进神经再生作用机制及作用靶点的
研究有重要理论意义与实际应用价值。
以前的研究发现，脑缺血损伤导致脑组织水肿，产生自由
基，细胞内钙超载，最终坏死，此过程包括大量的基质细胞衍生
因子的释放－１（ＳＤＦ－１），包括多种细胞因子和炎性细胞因子，内
源性神经干细胞发挥诱导的迁移和分化为神经细胞［３］。局部
缺血的脑组织损伤，一方面炎症介导的炎性细胞粘附增强，另
一方面增加损伤区域对神经干细胞的捕获能力，从而促进缺血
区神经修复。本文探讨地黄饮子对局灶性脑缺血损伤后ＳＤＦ－
１的影响。
１　实验材料　１．１　动　物　ＳＤ雄性大鼠７５只，分别来
自西安交通大学医学实验动物中心，清洁级，体重２３０～２５０ｇ，
动物许可证号：ＳＣＸＫ２０１２－００３。
１．２　药　物　中药地黄饮子以《黄帝素问·宣明论方》所
载地黄饮子药味和比例配制：熟地黄、白茯苓、菖蒲各１２ｇ，巴
戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、炮附子（先煎）、麦门冬各１５ｇ，五味
子、官桂、远志各１０ｇ。
根据２０１０年版《中国药典》选择中药材饮片：药材饮片购
买于陕西省西安市中药饮片有限责任公司，饮片经陕西中医学
院药学院中药鉴定学教研室鉴定为道地药材。按组方配伍比
例精确称取，加入１２倍重量的自来水，先泡４０ｍｉｎ，再大火煎煮
１０ｍｉｎ，小火煎煮３０ｍｉｎ，留取药液；再次加入１２倍重量的自来
水，再大火煎煮１０ｍｉｎ，小火煎煮３０ｍｉｎ，留取药液；然后将２次
所取药液混合，装入容量瓶成为地黄饮子煎剂。在旋转蒸发仪
蒸发浓缩后，定容装入玻璃冻干瓶冷凝干燥，干燥条件：－５５℃，
真空度：＜１０Ｐａ，时间：２４ｈ。计算冻干粉获得率，最后装入密
闭玻璃容器中密封保存。
１．３　主要试剂及仪器　５－溴－２－脱氧尿苷（ＢｒｄＵ），大鼠抗
ＢｒｄＵ单克隆抗体，ＳＡＢＣ检测试剂盒，二氨基联苯胺（ＤＡＢ）染
色试剂盒，ＲＩＰＡ裂解液。ＴＰ－１０００型动物电子天平，电子分析
４６５１ 陕西中医２０１４年第３５卷第１１期