全 文 ：文章编号:0490-6756(2001)03-0421-04
西红花愈伤组织的诱导与花柱愈伤组织
的继代 、悬浮培养
赵军 ,徐莺 ,颜钫 ,唐琳 ,陈放
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘要:以西红花的球茎 、叶片和花柱为外植体诱导愈伤组织.叶片诱导培养形成白色膨大组织 , 球茎培养得到
松散型白色愈伤组织 ,诱导球茎愈伤的培养基为 5mg/ L 6-BA+8mg/ L NAA ,在球茎愈伤组织中的紫外部分没有检测
到西红花甙 、西红花醛和西红花苦甙.在花柱愈伤组织中检测到西红花醛 , 适合于继代和悬浮培养 , 经悬浮培养后 ,
在培养液中可检测到西红花醛和西红花苦甙 ,悬浮培养有利于次生代谢的积累.
关键词:西红花(Crocus sativus L);花柱愈伤组织;继代培养;悬浮培养
中图分类号:Q 813 文献标识码:A
西红花别名番红花 、藏红花 ,为鸢尾科番红花属植物 ,以其独特的药理作用和养颜 、保健之功效而久负盛
名 ,在我国有着悠久的使用历史 ,但只能取柱头作药用 ,资源短缺 ,一直是西红花开发应用中的重要限制因
素.许多重要药用植物如人参 、紫草 、黄连等植物细胞悬浮培养都十分成功[ 1] ,为解决某些药用植物资源短缺
的问题提供了一条可借鉴的途径 ,因此我们就西红花做了这方面的工作 ,为进一步深入研究和工厂化生产奠
定基础.
1　材料与方法
1.1　材料
西红花(Crocus sativus L)球茎来源于本实验室栽培基地.叶片 、花柱来自于 25 ～ 45mm顶芽的球茎.
1.2 方法
1.2.1愈伤组织培养　取西红花每个重约 3g和 8g的球茎 ,用牙刷清洗表面 ,流水冲洗 40min ,转入 70%酒精
内灭菌 8min ,再在 0.2%升汞中灭菌8min ,然后用无菌水冲洗4 ～ 5次 ,切为厚3mm ,约0.5cm2 大小的样片 ,接
种于诱导培养基上.
取25 ～ 45mm顶芽 ,剥去外层叶鞘 ,清水漂洗 ,用 70%酒精灭菌10min ,再用0.1%升汞灭菌10min ,无菌水
冲洗 4 ～ 5次 ,剥去叶鞘 ,取幼叶基部白色部位进行诱导培养.
在25℃黑暗条件下诱导愈伤组织 ,于 15℃, 20℃, 25℃光照和黑暗情况下进行愈伤组织继代培养.在
20℃下进行悬浮培养.
1.2.2成份检测　参照《中华人民共和国药典》(95年版)的方法[ 2] ,用岛津 UV2100型紫外-可见光谱仪 ,在
200 ～ 500nm 范围内检测悬浮培养液中的主要成份:于 253nm处检测西红花苦甙 ,于 325nm 处检测西红花醛 ,
于432nm和 458nm处检测西红花甙.
2　结果分析
2.1 球茎 、叶片 、花柱愈伤组织的诱导
收稿日期:2000-11-8
基金项目:国家医药科学技术博士点创新基金;国家自然科学基金
作者简介:赵军(1968-),男 ,四川大学生命科学学院 98级博士生.
＊通讯联系人
2001年 6月
第 38卷第3期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Jun.2001
Vol.38　No.3
　　试验结果表明 ,由各外植体诱导愈伤组织的表现是不一样的.重 8g 的球茎不易诱导愈伤组织 ,在接种 2
星期后即全部褐化.重3g 无侧芽的球茎接种一个月后 ,切口处表面裂开 ,长出松散型颗粒状愈伤组织 ,这种
愈伤组织诱导率极低 ,紫外检测不到西红花甙 、西红花醛 、西红花苦甙 3种成份 ,继续继代生长一个月 ,部分
愈伤组织形成致密 、光滑突起的表面 ,有分化趋势.接种有侧芽的重 3g 的球茎切块没有诱导出愈伤组织 ,但
芽眼处可萌发出卵圆形表面光滑的白色突起 ,继续继代后生长为或球状 、或阔形叶片状 、或锥状 、或丛芽状的
组织.
将幼叶接种一个月后 ,叶基部均发生膨大 ,再在各种激素组合的 MS培养基上继代后 ,有的继续膨大 ,但
膨大速度极为缓慢 ,再继代也没有形成愈伤组织;有的膨大物形成棉花状愈伤组织 ,无法继续培养.
花柱愈伤组织的诱导周期长 ,来源于花柱诱导出的柱头状物的初继代产物.这种愈伤组织在(25±1)℃
和高激素浓度的 6-BA和 NAA的培养基上很易于形成 ,形成的愈伤组织呈浅黄色 ,不易于分化 ,易于进行悬
浮培养.
球茎愈伤组织的诱导结果见表 1 ,使用MS+5mg/L 6-BA+8mg/L NAA最有利于诱导球茎愈伤组织 ,可形
成大块愈伤 ,其它培养基只能形成小块或略有启动 ,2 ,4-D不利于球茎愈伤组织的诱导.
表 1　西红花球茎愈伤组织的诱导结果
　　　　培养基(MS) 出愈情况
5mg/ L 6-BA+NAA1+5 mg/L 2 , 4-D 一般
5mg/ L 6-BA+NAA3+3 mg/L 2 , 4-D 一般
5mg/ L 6-BA+NAA5+1 mg/L 2 , 4-D 较好
5mg/ L 6-BA+NAA1+8 mg/L 2 , 4-D 一般
5mg/ L 6-BA+8 mg/ L NAA 好
2.2　花柱愈伤组织的继代
6-BA和 NAA浓度的高低 ,对花柱愈伤组织继代的影响不同.其结果如表 2(培养温度(25±1)℃.
表 2　花柱愈伤组织的继代培养＊
　　　　培养基(MS) 光照 12h/ d 黑暗
0.5mg/ L 6-BA+0.2mg/ L NAA - +
2mg/ L 6-BA+0.2mg/ L NAA - +
2mg/ L 6-BA+1mg/L NAA + +
3mg/ L 6-BA - +
5mg/ L 6-BA+5mg/L NAA ++ ++
　　　　　　　　＊“ -”表示死亡;“ +”表示继代良好
在低激素浓度时 ,黑暗条件下花柱愈伤组织的继代培养好于光照下的继代培养.而高激素浓度时 ,光照
和黑暗条件下的继代培养结果无差异 ,且在任何高浓度 6-BA ,NAA 的培养基上均可良好地继代.
在低激素浓度时 ,使用 3mg/L 6-BA不加任何生长素培养时黑暗条件下培养 ,其愈伤组织仍能生长且在
紫外部分可检测到西红花醛 ,但西红花醛含量低于 2mg/L 6-BA+1mg/L NAA 黑暗条件下培养的愈伤组织
(如图 1).
　　当花柱愈伤组织在 15 ～ 25℃范围内继代培养时 ,对于由高浓度 6-BA 和NAA对继代愈伤组织的生长影
422 四川大学学报(自然科学版) 第 38卷
响不明显 ,20℃下生长较好 ,虽然启动时间较 25℃时慢 ,但后期生长旺盛 ,存活时间长 ,有利于次生代谢的积
累.由成份检测表明 ,愈伤组织次生代谢与生长活力紧密相关 ,生长活力最旺盛的时期也是次生代谢积累最
大的时期 ,分别取继代 25d和 40d的愈伤组织检测西红花醛的含量 ,两者之间差异不大 ,25d的继代愈伤生长
活力更旺盛.
图 1　西红花愈伤组织成份紫外检测图谱
A.培养基 3mg/ L 6-BA;　B.培养基 2mg/ L 6-BA+1mg/L NAA
2.3 花柱愈伤组织悬浮培养
　　根据成份检测和愈伤组织生长活力的情况 ,取继代 25 ～ 30d的花柱愈伤组织进行细胞悬浮培养 ,我们选
择20℃下黑暗培养条件.将 2 g 的愈伤组织接种于 30mL液体的容量瓶中 ,于 100r/min震荡培养 24h ,用纱布
过滤后再继续培养 ,培养 2个星期后取其上清液检测成份.悬浮液中始终没检测到西红花甙 ,只检测到西红
花醛和西红花苦甙 ,继代愈伤组织只检测到西红花醛.悬浮培养后各成份含量以 2mg/L 2 ,4-D+1mg/L 6-BA
培养的效果最好(表 3),且低浓度激素水平更有利于次生代谢积累.
表 3　西红花愈伤组织悬浮培养紫外吸收值
培养基 西红花醛 西红花苦甙(Abs) (Abs)
3mg/ L 6-BA+5mg/L NAA 4.16 2.50
5mg/ L 6-BA+2.5mg/L NAA+2.5 mg/L2 , 4-D 3.76 3.10
1mg/ L 6-BA+2mg/L 2 , 4-D 9.96 6.84
1mg/ L 6-BA+2mg/L NAA 4.60 4.18
0.5mg/ L 6-BA+2mg/L 2 , 4-D 4.42 3.80
0.5mg/ L 6-BA+2mg/L NAA 4.28 3.59
5mg/ L 6-BA+5mg/L NAA 2.66 2.32
由图 2表明 ,在悬浮培养液中 ,有西红花醛和西红花苦甙 ,而继代愈伤组织中仅有西红花醛 ,说明悬浮培
养有利于次生代谢的积累.
3　讨论
研究结果表明 ,由 3mg/L 6-BA黑暗条件下继代花柱的愈伤组织好于光照条件下的愈伤组织;由 3mg/L
6-BA不加任何生长素与2mg/L 6-BA+1mg/L NAA培养得到的西红花醛比较 ,可能得出黑暗条件下NAA
423第 3期 赵军等:西红花愈伤组织的诱导与花柱愈伤组织的继代 、悬浮培养
图 2　西红花紫外吸收图谱
　NA:天然柱头;SU:悬浮培养;SS:继代培养
有利于西红花愈伤组织次生代谢积累的结论;我们在诱
导西红花雄蕊柱头状物时也曾发现 ,低温黑暗培养似乎
有利于内源 NAA 的积累 ,再则 ,高浓度的 6-BA ,NAA 又
易于继代花柱愈伤组织.由以上结果可得出如下结论:在
黑暗条件下有利于刺激西红花内源生长素 NAA的分泌 ,
从而影响到培养物的生长和次生代谢;生长素 NAA与西
红花花柱愈伤组织继代生长及主要成份的变化存在着相
关性.上述结果有待进行更详细的研究.
目前对西红花生物合成研究手段之一是加入前体物
西红花酸 ,再通过悬浮培养的方法合成西红花甙 ,由悬浮
细胞吸收西红花酸并将其糖基化并转化为西红花
甙[ 3 ,4] .由我们的实验结果表明 ,继代的愈伤组织可合成
西红花醛 ,经悬浮培养后 ,细胞生长活力旺盛 ,在悬浮液
中可检测到西红花醛和西红花苦甙 ,这一结果不但证明
悬浮培养有利于次生代谢的积累 ,而且说明西红花醛和
西红花苦甙在生物合成上存在密切的相关性.因此 ,可应用这一悬浮体系 ,加入前体物西红花酸 ,以进一步研
究西红花甙的生物合成.
参考文献
[ 1] 于荣敏.中国药用植物细胞工程研究进展[ J] .沈阳药科大学学报 , 1995 , 12(1):59-63.
[ 2] 中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典(95 年版)[ M] .广东科技出版社·化学工业出版社 , 95.8.
[ 3] Dufresne C.Glycosylation of encapsulated crocetin by a Crocus sativus L.cell culture[ J] .Enzyme andMicrobial Technology , 1999 , 24:
453.
[ 4] Sarma K S , et al.Chemical and sensory analysis of saffron produced through tissue cultures of Crocus sativus[ J] .Plant Cell , Tissue and
Organ Culture , 1991 , 26(1):11.
INDUCTION OF CALLUS AND SUBCULTURE AND SUSPENSION CULTURE OF STYLE
CALLUSOF SAFFRON(CROCUS SATIVUS L)
ZHAO Jun , XU Ying , YAN Fang , TANG Lin , CHEN Fang
(College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 ,China)
Abstract:With corms , leaves and styles of Crocus sativus L as explants , callus was inducted.White expanding tis-
sue was inducted from leaf culture.White loose callus was inducted from corm culture in medium 5mg/L 6-BA+8mg/L
NAA.None of crocin , safranal and picrocrocin was tested from this white loose callus.Safranal was tested in style callus
and it was suitable for subculture and suspension culture.Safranal and picrocrocin were tested after suspension culture.
Suspension culture was favorable to the accumulation of secondary metabolism.
Key words:Crocus sativus L;style callus;subculture;suspension culture
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