全 文 ：第 16 卷 1 期
2(X) 8 年 2 月
应用基础与工程科学学报
JO URNA L OF BA S IC SC E IN CE A ND EN G N E IER IN G
V ol
.
16
,
N o
.
l
R必川呵 2X() 8
文章编号 : 1加 5伪30( 2o 8 ) 01 闷洲H 3折 中图分类号 : 9R 31 . 71 文献标识码 : A
色谱指纹图谱在区分 3 种
引种松果菊中的应用
李梦龙` , 林 源` , 刘仲义,
( 1
. 四川大学化学学院 , 四川成都 61 以又讲 ; 2 . 四川省食品药品检定所 , 四川 成都 61 的 36)
摘要 : 用高效液相色谱一二极管阵列检测 ( H PLC 一DDA )技术 , 建立 了同时满足不
同品种松果菊指纹图谱测定要求的色谱条件 , 以及紫花松果菊花的色谱指纹图
谱模型 . 用 D AD 最大值化技术和蒸发光散射检测器 ( E比D )评估检测结果并验
证指纹图谱的信息量. 用采集的色谱一光谱信息和对照品推断及确定特征成分 .
紫花松果菊花模板的色谱峰个数达到总个数的 8 % , 信息量达到总量的 63 % .
该研究提出评估指纹图谱模板质量的思路 , 并为区分易混淆的植物药材提供了
一种新的合理 、 可靠的方法模式.
关健词 : 松果菊 ;指纹圈谱模型 ; DA D 最大值化技术 ;高效液相色谱·燕发光散射检测器
松果菊属植物具有增强机体免疫功能以及对抗各种感染的作用 ,原产于美洲 ,是印地
安人的传统药材〔` 〕 . 我国北京 、江苏 、安徽等地区均有引种载培 . 该属植物共有 8个种及数
个变种 . 在药材市场流通 的主要为紫花松果菊 (及人
~
n p “ , u aer )及狭叶松果菊
( cE h
~
a
. 。卿 t如阮 )和淡紫松果菊 (hcE ~ aP alt )全草〔’ “ 〕
. 由于引种的基源不同 ,
其内在药用物质基础存在较大差异 . 但以上 3 种植物在形态 、性状 、显微结构上却较相似 ,
因此在流通市场中经常出现混淆品种和药材混合出售的现象 . 这种现象对合理 、安全用药
带来困难 . 文献已经报道的区分方法有花粉形态区分法 [’l 、 D N A 指纹分析法〔’ 」、 HPcL 单
一活性成分鉴别及 G c 一M s 对其根部的多元数据分析〔6“ 〕 ,而这些方法都不是建立在松果
菊属植物多种有效成分的基础上的 ,不能很好地反应松果菊属植物的内在物质基础 .
本文建立了色谱指纹图谱的测定方法 ,用 HPL C 指纹图谱技术对不同产地 、 不同品
种 、不同部位的松果菊样品的多个活性成分进行综合评价 , 筛选出花为建模对象 , 合成出
紫花松果菊的标准指纹图谱模型 ,并用此模型准确的区分不同品种 . 这种区分方法的优点
是能较完整地表达测定对象的物质基础 ,且方法的信息量大 ,特征性强 , 本方法可用于基
地种植和全草收购的品种识别 .
研究中 ,开发了最大值化处理技术评估指纹图谱信息量的方法 ;开发了以 E比D 为检
测器和紫外检测器分别记录色谱图进行分析比较 , 相互验证 ,进一步评估信息量的方法 .
本文还对中药指纹图谱实验研究的效率和指纹图谱模板的质量评价方法进行了探索 .
收稿日期 : 2 0( 拓习3一 1 ;修订日期 : 2X() 7伪一 19
荟金项目: 四川省重点指纹图谱项目( 03 KW的 3)
作者简介 :李梦龙 ( l% 2一 ) ,男 ,教授 ,博士生导师 .
DOI : 10. 16058 /j . i ssn. 1005 -0930. 2008. 01. 014
料 应用基础与工程科学学报 Vo l. 1 6
1 实验
1
.
1 仪器和试剂
色谱系统 1 : W at e rs 公司 2 690 型高效液相色谱仪 , 9 6 二级管阵列检测器 ; 色谱系
统 2 : A igl en t 公司 n 0 高效液相色谱仪及色谱工作站 ( Che m tS at ion ) , A lt ec h公司的蒸发
光散射检测器 ( ESL D ) . SB52 0 超声波清洗器 (上海 Bar sn on 公司) .
绿原酸 、 咖啡酸和松果菊昔对照品购于中国药品生物制品检定所 ,菊芭酸工作参照品
购于湖南师范大学仁’ 〕 ,纯度大于 98 . 5% . 乙睛和甲醇 ( iF hs er 公司 ,色谱纯 ) ;水为二次蒸
馏水 ;三氟乙酸和磷酸均为分析纯 .
1
.
2 植物样本
为了使收集到的样品具有代表性 ,每个样品的数量除花卉样品不少于 25 09 外 ,根 、茎
和叶样本均不少于 I k ;g 选择了不同产地的样本 ;对同一产地取不同生长条件的松果菊
根 、 茎 、 叶和花混合后作为样本 ,在选择花为样品时 ,在每株松果菊上 、 中和下各取三朵 . 由
于在高温高湿条件下干燥 ,松果菊中的酚酸就会损失〔’ 〕 . 样品经 自然风干 ,使用前在 40 ℃
的烘箱中烘干 48 h ,粉碎混匀过 40 目筛后作为测试样品 . 由于无法收集到原生长地的样
品 , 只对我国引种的样品进行研究 . 26 种测试样品的来源和取样部分 ,见表 1 .
表 l 松果菊属试验样品
Ta ble 1 T e s t
e d s am p les
o f cE hiacn
e a n
编号 样品名称 产地 部位 晨踩) 编号 样品名称 产地 部位 孟喋)
l 紫花松果菊 北京怀柔 根 2侧又 (2) 14 紫花松果菊 安徽桐城 叶 2X() 5 ( l)
2 紫花松果菊 北京怀柔 茎 2《X又 (2) 巧 紫花松果菊 安徽桐城 花 2X() 5 ( l)
3 紫花松果菊 北京怀柔 叶 2《X又 ( 2 ) 16 紫花松果菊 成都 花 2X() 5 ( l)
4 紫花松果菊 北京怀柔 花 2以又 ( 2) 17 淡紫松果菊 北京怀柔 花 2以又 ( l)
5 紫花松果菊 北京怀柔 花 2以只 ( l) 18 淡紫松果菊 北京怀柔 根 2X() 5 ( l)
6 紫花松果菊 北京怀柔 花 2的5( l) 19 淡紫松果菊 北京怀柔 茎 2印 5 ( l)
7 紫花松果菊 江苏 花 2(X阵 ( l) 加 淡紫松果菊 北京怀柔 叶 2X() 5 ( l)
8 紫花松果菊 江苏 根 2X() 5 ( l) 21 淡紫松果菊 北京怀柔 花 2X(] 5 ( 1)
9 紫花松果菊 江苏 叶 2X() 5 ( l) 2 2 狭叶松果菊 北京怀柔 花 2《X抖 ( l)
10 紫花松果菊 江苏 花 2X() 5 ( l) 2 3 狭叶松果菊 北京怀柔 根 2X() 5 ( l)
1 紫花松果菊 安徽桐城 花 2 0( 抖 ( l) 24 狭叶松果菊 北京怀柔 茎 2X() 5 ( l)
12 紫花松果菊 安徽桐城 根 2X() 5 ( l) 25 狭叶松果菊 北京怀柔 叶 2X() 5 ( l)
13 紫花松果菊 安徽桐城 茎 2X() 5 ( l) 2 6 狭叶松果菊 北京怀柔 花 2X() 5 ( l)
1
.
3 对照品溶液和供试品溶液的制备
分别精确称取对照品适量 , 以甲醇习 . 1% 磷酸水溶液 ( 40 : 60 , v/ v )为溶剂制成每毫升
含绿原酸 、 咖啡酸 、松果菊昔和菊芭酸各 0 . 0巧5 、 0 . 02 、 0 . 01 65 和 0 . 0 18 m g 的溶液作为对
照品溶液 .
准确称取各测定样品约 0 . 40( 刃 g , 置 25 m L 容量瓶中 ,加溶剂 甲醇习 . 1% 磷酸水溶液
( 40
:
60
,
v/
v
) 20 m L
, 超声三次 , 每次 10 m in , 冷却至室温 , 用溶剂定容至刻度 , 混匀 , 经
0
.
45 林m 滤膜过滤 ,弃去初滤液 ,取续滤液作为供试品溶液 .
李梦龙等 :色谱指纹图谱在区分 3种引种松果菊中的应用
1
.
4 色谱条件
液相色谱条件 : ( l) 色谱柱 : Sh i s eia 。 el s色谱柱( 50 2m m x 4 .6 n i
.
d
,
5卿 ) ; ( 2 )流
动相 : A 为含 0 . 2 % 的三氟乙酸水溶液 , B为含 0 . 1% 的三氟乙酸的乙睛溶液 . 线性梯度程
序为 : 开始 10% B ; 0- 35而 n , 10% 一2 5% B , 3 5一4 5而 n , 25%一 o% B ; 45一 o而 n ,
50%一70% B保持 3 m i n ; 53一55而 n , 70% 一 10% B . 流速 : l m l/ m i n ;柱温 : 30℃ ; ( 3 )检测
参数 :以D 二极管阵列检测的波长范围为 21 0一闷加 n m 、 光谱带宽 4mn 、 分辨率 4 . S lun ;
E璐D检测的蒸发室温度为 110 ℃ 、气体流速 3 . ZU m in ;紫外检测器的检测波长 : 329 n m ;
进样量为加泌 . 在此条件下得到的色谱图如图 1 .
0
.
1 8
0
.
1 6
0
.
14
0
.
1 2
0
.
1 0
0
.
0 8
.0 04
.0 02
O.0
1
。
5
… 入
8 10 12 14 16 18 20 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 3 2 34 3 6 38 6 8 l 0 l 2 l 4 l 6 l 8 2 0 2 2 2 4 2 6 28 30 32 3 4 36 3 8 40 4 2 4 4 46
. n l n
(a)
下n , n
向
A
. 绿原酸 ( e hl o功g e n ic 二 id ) ; B . 咖啡酸 ( c以fe ie ac id ) ; C . 松果菊昔 ( ec h in a e o s i de ) ; D . 菊芭酸 ( e ic ho ir e ac id )
图 I H卫LC一 D AD 混合对照品 ( a )和淡紫松果菊的花 ( b)
iF g
.
1 H p LC
一
DA D of s atn d
a ld m议ot 此 ( a ) 阴 d fl o w e r of .E 州 l汕 ( b)
模型的建立与样品的测定
精确量取用各供试品溶液 20 泌 和对照品溶液 , 注人色谱系统 1 ,按 1 . 4 色谱条件分
别测定 ,记录色谱图至 5 m in . 积分各色谱峰面积 ,得各样品的指纹图谱 . 根据三种松果菊
的根 、茎 、叶和花的色谱指纹图谱分别比较结果 , 以花的信息量最大 ,特征成分的种类最
多 . 提取各紫花松果菊花的色谱指纹图谱 8 批 , 用《中药色谱的指纹图谱评价系统》软件
(国家药典委员会 20( 抖 A )进行色谱峰自动匹配后 , 以中位数法合成指纹图谱模板 . 以合
成指纹图谱为模板 ,用相似度软件 ( 国家药典委员会 2 (X阵B ,下同 , 简称中药指纹图谱相似
度软件 )计算各个品种花的相似度 .
2 结果与讨论
2
.
1 样品代表性
建立中药的指纹图谱模板 ,植物样本的代表性直接影响指纹图谱模板的整体性和实
用性 . 国家药品监督局 20( X) 年印发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行 ) 》技
术法规对指纹图谱提出“ 实验不少于 or 个批号 20 个数据” 的要术 , 以样品的批次和实验
次数来表达研究结果的有效性 . 为了提高实验研究的效率 ,本研究中还注重样本的取样量
和多个取样点的混合 ,使每个子样本的统计性更强 ,这种思路与实际生产中以吨为单位的
批量投料相匹配 , 以合理的色谱试验次数保证研究结果的有效性 . 实验证明植物的花最具
代表性 ,这与形态区分法以花为样本的实践经验一致闭 . 植物生长期也是导致无固定取
样标准的另一个原因 ,如根 、茎和叶的生长周期可以是一个月或者两个月甚至更长时间 ,
应用基础与工程科学学报 Vl o .16
不同生长期的样本内在物质基础相差也很大 ,而且不好辨认其生长期同样会增加取样难
度 . 与根 、 茎和叶的生长周期相比 ,花的盛花期很短 ,物质基础差异不大 ,且特征成分的种
类多 ,活性成分相对稳定 ,所以本文选用花为样本建立紫花松果菊指纹图谱模板 .
2
.
2 HP LC 条件的优化
信息量最大化 、 特征性和重复性是评价标准指纹图质量的关键指标 ,测试样品溶液的
制备方法 ,色谱分离和检测条件的正确性是它们的主要影响因素 , 是本项研究的重要
部分 .
测试样品溶液的制备时 , 为了保证被测成分提取完全和特征成分提取中的稳定 ,实验
研究的重点是溶剂和提取方法的选择与优化 ,选择超声提取 ( 125 W )能满足提取要求 ,且
被测成分稳定 ,方法简单、 快速 ,经超声提取时间和不同比例的甲醇一水 (0 . 1% 磷酸 )提取
酚酸的效果考察 , 当超声时间为 30 im n 时 , 甲醇一水 ( 0 . 1% 磷酸 ) 的比例为 4D : 60 ( v/ v ) 的
时候不同极性的化合物均能被有效的提取 ,且色谱图的信息量也比较大 ,稳定性最好 . 是
最适合的提取溶剂和供试品溶剂 .
实验分别选用了 Waet sr 、 A l t e e h 和 Sh i s e id o 的 e 18 色谱柱 ( 2 50 m m x 4 . 6 m m i . d ,
5林m ) ,用相同的流动相洗脱 ,相互比较 , 以 hS ise ido 色谱柱的分离度和稳定性最好 . 实验
证明 ,保证样品实现良好分离的基本条件是流动相中有机溶剂的比例及加人酸的种类和
数量 . 研究中发现使用三氟乙酸比文献报道中使用磷酸产生的分离效果更好 . 同时此种流
动相对 UV 和 E巧D 检测器兼容 ,保证了指纹图谱信息量评价的可比性 , 本色谱条件同时
满足不同松果菊品种的根 、茎 、 叶和花的分离要求 .
为了选择合理的检测波长并评价指纹图谱的信息量 , 曾利用 W at e sr DA D 检测器采集
色谱一光谱信息 , 由各色谱成分的光谱图可知 , 主要色谱成分中最大吸收为 32 9 n m 的峰为
总峰个数的 54 % , 其它色谱成分最大吸收分散 . 利用该软件特有的 Max 一p lot 功能 , 将色谱
信息最大值化 , 即提取各色谱成分最大吸收波长时的色谱图 . 积分主要色谱成分的峰面
积 ,计算总面积 ( 艺A ) 及主要色谱成分总个数 (艺N ) , 与检测波长为 329 n m 的指纹图
谱的主要色谱成分的总面积 ( 艺rA ) 和主要色谱成分总个数 ( 艺Nr )进行比较 · 选紫花
松果菊的花为例 , 当选择波长 329 n m 时 : 艺A r/ 艺A = 63 % ) ; 色谱成分总个数 :
艺N r/ 艺N 二 ( 8 % ) · 与其它波长比较是最佳值 ,所以 329 n m 为最终选定的检测波长 ·
紫外检测器为特征型检测器 , 没有紫外吸收的成分可能出现漏检而丢失信息 , 因
E巧 D 为灵敏度较高的质量型检测器 , 曾在相同的分离条件下使用 E巧D记录色谱图 ,对
色谱图进行分析比较 , 同紫外检测器进行相互验证 , 由 E璐 D 检测到的主要成分 , 除各色
谱峰响应值存在差别外 ,主要色谱峰个数与 HPL C 一D A D 检测到的个数基本一致 . 说明信
息量满足指纹图谱的信息量的要求 .
2
.
3 指纹图谱评价
2
.
3
.
1 方法学评价 依 1 . 3方法配制供试品溶液 , 在 1 . 4 所述条件下测定 ,取同一供
试品溶液 , 分别在 O 、 2 、 4 、 8 、 16 和 24 h 分别进样检测 , 计算绿原酸 、 咖啡酸 、 松果菊普和菊
芭酸的保留时间和峰面积的相对标准偏差 ( RS D ) ,结果均小于 2 . 0% . 结果显示供试品的
指纹图谱在 24 h 内基本稳定 . 以紫花松果菊的花为样品平行配制 6 份溶液同法测定 ,计算
李梦龙等 : 色谱指纹图谱在区分 3 种引种松果菊中的应用
色谱指纹图谱相似度的RS D ,结果为 0 . 1% .
380642
日之事妈
图 2 紫花松果菊花的光谱图
iF g
.
2 SeCP atr of fl
o w e o of .E p呷~
2
.
3
.
2 指纹图谱质 , 评价 指纹图谱的质量水平主要表现是信息量 ,特征性和已知化
学结构的色谱成分的数量 . 关于信息量在检测条件中已有已论述 . 本指纹图谱中已明确药
效的色谱成分有绿原酸 、咖啡酸 、 松果菊昔和菊芭酸 ,绿原酸具有抗脂质过氧化 、 抗菌 、 抗
诱变剂的作用〔’ O J ;松果菊昔有抗菌 、抗病毒、抗脂质过氧化等作用〔“ 一 l3] ;菊芭酸能够增强
免疫功能 、 抗发炎 , 并具有抑制透明质酸酶 ,保护胶原蛋白 l 的作用 [’ -31 ` 〕 . 这些成分的药
效与松果菊的功效一致 ,它们应是指纹图谱的特征成分 . 从 D A D 检测结果提取出的光谱
图 (图 3 )中可知 ,与绿原酸 、咖啡酸 、 松果菊昔和菊首酸色谱峰的光谱图相似的成分占总
信息量的 92 % . 从这些色谱成分的光谱图相似 ,可推断出它们应是咖啡酸系列衍生物 . 有
此高比例己知类型的特征成分 ,也大大提高了本指纹图谱的质量水平 .
2
.
4 淡紫松果菊和狭叶松果菊与紫花松果菊指纹图谱模板的相似度分析
对松果菊指纹图谱按照保留时间进行匹配后 ,运用中药指纹图谱相似度软件 , 以紫花
松果菊花合成的指纹图谱为参考标准计算不同品种松果菊指纹图谱的相似度 ,从相似度
计算结果可以看出不同产地的紫花松果菊样品具有高度的相似性 , 与模板的相似度都大
于 0 . 985 ;淡紫松果菊的两个样品与紫花松果菊模板的相似度都为 0 . 991 ;狭叶松果菊与
紫花松果菊模板的相似度就比较的低 ,仅为 0 . 7 2 和 0 . 546 . 从相似度计算结果能很好的
区分紫花松果菊和狭叶松果菊 . 紫花松果菊和淡紫松果菊的相似度高 ,但特征成分的比值
存在显著差异 , 以绿原酸为参考峰 , 计算各特征成分相对峰面积比 ,结果如表 2 . 由表可
知 ,判断淡紫松果菊的参数应是相似度大于 0 . 95 且菊营酸与绿原酸的比值低于 or .
表 2 松果菊花的特征成分的相对峰面积比
T ab l e 2 T h e elr at i ve ep ak ~
of hc ~
et ir ist
c
ep ak
s in if o w e r of CE 从acn 己a s ep c i es
样品编号
4 5 6 7 10 11 15 16 17 2 1 2 2 26
的08137L.O住4
化合物
绿原酸
咖啡酸
松果菊昔
菊芭酸
1
.
0
0
.
8 3
0 8 2
7 7
.
3
1
.
0
0
.
2 7
0
.
4 1
3 8
.
8
1
.
0
0
.
26
0
.
4 5
4D
.
5
1
.
0
0
.
2 8
0
.
2 6
2 9
.
7
1
.
0
0
.
2 5
0 2 3
2 9
.
8
1
.
0
0
.
45
0 2 1
3 1
.
5
1
.
0
0
.
10
0
、
14
8
.
8
1
.
0
0
.
2 8
0
.
13
0
.
27
1
. 的
0
.
0 5
0
.
27
0
.
80
…o.72,且,二0月矛018?L.07
应用基础与工程科学学报 V o l . 16
3 结论
研究结果表明 ,利用指纹图谱技术 ,合成指纹图谱为模板 , 以合成指纹图谱为模板 ,用
相似度软件计算各个品种花的相似度 ,能很好的区分狭叶松果菊 . 用指纹图谱的特征成分
菊芭酸与绿原酸的比值 ,能进一步区分出淡紫松果菊和紫花松果菊.
致谢 感谢北京 、 江苏、 安徽等各种植基地为本研究提供植物样本 .
参 考 文 献
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