全 文 ：第 42 卷 第 11 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 42 No． 11
2014 年 11 月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Nov． 2014
1)国家自然科学基金(30972083) ;吉林省科技发展计划项目
(20090574)。
第一作者简介:李璐，女，1990 年 11 月生，吉林农业大学生命科
学学院，硕士研究生。
通信作者:胡薇，吉林农业大学生命科学学院，副教授。E －
mail:huwei9002@ 126． com。
收稿日期:2014 年 4 月 1 日。
责任编辑:程 红。
MiＲNA － 93 － 5p对 VEGF的转录调控及其与
梅花鹿茸细胞增殖的关系1)
李璐 李婷 李沐 吴炎 齐琳 崔东明 胡薇
(吉林农业大学，长春，130118)
摘 要 为了探讨 miＲNA － 93 － 5p对梅花鹿血管内皮生长因子(VEGF)的转录调控作用及其与鹿茸细胞生
长的关系，分离了鹿茸顶端软骨组织细胞，利用 Trizol 试剂法提取细胞总 ＲNA，反转录合成 cDNA。根据 GenBank
已发表的相关序列设计梅花鹿 VEGF基因的 3端非编码区部分序列(3UTＲ)特异引物并进行克隆，构建 VEGF基
因的 3UTＲ野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的 miＲNA
－ 93 － 5p模拟物转染鹿茸软骨细胞，MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting 分析 VEGF 蛋白的表
达丰度。结果表明:成功获得了鹿茸组织 VEGF基因的 3UTＲ序列，野生型序列长度为 356 bp，突变体长度为 336
bp。荧光素酶活性检测结果表明，转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低，而转染突变体组细胞荧光素酶活性
无明显变化。MTT法和 Western blotting结果显示，鹿茸细胞的体外增殖受到抑制，VEGF蛋白的表达水平下降，且
呈时间依赖性。
关键词 鹿茸细胞;miＲNA － 93 － 5p;血管内皮生长因子;转录调控;细胞增殖
分类号 Q786
Transcription Ｒegulation Effect of miＲNA-93-5p on VEGF Gene and Its Ｒelationship with Antler Cell Prolifera-
tion /Li Lu，Li Ting，Li Mu，Wu Yan，Qi Lin，Cui Dongming，Hu Wei(Jilin Agricultural University，Changchun
130118，P． Ｒ． China)/ / Journal of Northeast Forestry University． － 2014，42(11)． － 146 ～ 149
We isolated the cartilage cells from antler tip and extracted cells total ＲNA by Trizol reagent to explore the effect tran-
scriptional regulation of miＲNA-93-5p on vascular endothelial growth factor (VEGF)and the relationship with the growth
of antler cells，and synthesized cDNA by reverse transcription． With the published relative sequence in GenBank，we de-
signed and cloned the specially primers of 3’UTＲ of sika deer VEGF gene，constructed dual luciferase reporter gene vec-
tors of VEGF gene 3’UTＲ containing wild-type or mutant sequence，and detected the relative activity of luciferase． We
detected the changes of the in vitro proliferation of cartilage cells by MTT after transfected cartilage cells using miＲNA-93-
5p mimics，and analyzed the expression abundance of VEGF protein by western blotting． We obtained 3’UTＲ sequence of
VEGF from antler tissue． The length of wild-type sequence is 356 bp and the length of mutant sequence is 336 bp． Lucifer-
ase activity detection indicates that the luciferase activity of the wild-type plasmid transfected cells is reduced，whereas mu-
tant cells have no obvious change of luciferase activity． By MTT assay and western blotting，antler cells are inhibited in
vitro and the expression level of VEGF protein decrease along with the time increase．
Keywords Antler cells;miＲNA-93-5p;Vascular endothelial growth factor;Transcriptional regulation;Cell prolif-
eration
鹿茸是雄鹿顶部未骨化且密生茸毛的幼角，每
年周期性的脱落与再生，是哺乳动物中唯一可以完
全再生的器官。鹿茸生长速度极快，在快速生长期
可达到 12． 5 mm /d［1 － 2］。新生的鹿茸中具有极其丰
富的血管，随着鹿茸的生长，血管也迅速延伸，以提
供鹿茸生长时所需的营养物质［3 － 4］。血管内皮生长
因子(VEGF)是一种具有高度生物学活性的功能性
糖蛋白，可以使皮肤血管的通透性明显增加［5］。
Kumar等［6］研究发现 VEGF 及其受体(VEGFＲ)能
特异地促进细胞分裂、增殖及迁移，促进血管内皮细
胞的有丝分裂，在肿瘤新生血管生成过程中起着至
关重要的作用。Clark等［7］曾报道 VEGF 及 VEGFＲ
在皮肤、间充质层细胞、软骨细胞和初角茸的骨中都
有广泛地表达。MicroＲNA(miＲNA)是一种广泛存
在的内源性非编码蛋白质的单链小 ＲNA，可以通过
与靶标基因 mＲNA 3非编码区上的靶点结合，介导
mＲNA降解或抑制 mＲNA 转录后水平的表达，从而
导致靶标蛋白表达量的下降［8 － 9］。近十年来的研究
发现，miＲNA 在胚胎发育及细胞的增殖、分化和凋
亡等多种生命活动中发挥着重要作用［10］。Lei
等［11］曾报道 miＲNA能特异性识别 VEGF 靶基因 3
非编码区序列，抑制靶基因的翻译，在蛋白表达的过
程中起着精细的调节作用。但是，目前关于鹿 miＲ-
NA的研究国内外报道甚少。因此，本研究从 ＲNA
组学的角度，以鹿茸顶端组织为研究对象，探讨
miＲNA对 VEGF基因表达的调控及其对鹿茸细胞
增殖的影响，以期更深入地探讨细胞生长因子在鹿
茸生长调节机制方面可能具有的重大意义。此外，
还可以促进我国鹿科动物 miＲNA 研究的开展和不
断深入。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试鹿茸:2013 年 6 月，梅花鹿二杠锯茸采自
长春市农科院鹿场一头 3 岁左右的东北梅花雄鹿。
主要试剂:限制性内切酶 HindⅢ与 EcoＲⅠ购自
大连宝生物工程公司;胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质
酸酶及二甲基亚砜(DMSO)购自 Sigma;高糖 DMEM
培养基购自 Gibco;胎牛血清(FBS)购自天津市灏洋
生物制品科技有限责任公司;HP 转染试剂购自
Ｒoche;MTT购自 Solarbio;双荧光素酶报告基因载
体、miＲNA模拟物购自广州市锐博生物科技有限公
司;Dual － Luciferase Ｒeporter Assay System购自 Pro-
mega;SYBＲ GＲEENⅠ荧光定量 PCＲ 试剂盒购自天
根生化科技有限公司;Western及 IP细胞裂解液购自
碧云天生物技术公司;兔抗人 VEGFA 抗体、羊抗兔
IgG －HＲP购自北京博奥森生物技术公司;ECL 发光
显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1． 2 方法
鹿茸软骨细胞培养:按照 Li 等［12］的取材方法，
使用高温消毒处理的手术刀在离鹿茸顶端 5 cm 处
沿垂直鹿茸生长轴方向切断。采用酶消化法，将分
离出的鹿茸软骨组织剪成 1． 0 mm3 的小块，用胶原
酶Ⅰ和透明质酸酶 37 ℃消化 1． 5 h，再加入胶原酶
Ⅱ继续消化 3 h。当观察到大量细胞从组织块中游
离出来时，1 000 r·min －1离心 5 min。将离心收集
的细胞与组织块加入含 10% FBS 的 DMEM 培养液
中，置于培养箱中 37 ℃、5%的 CO2 继续培养。
鹿茸软骨细胞总 ＲNA 提取与双链 cDNA 的
合成:待鹿茸软骨细胞丰度达到 80%以上时收集
细胞，按照 Trizol操作手册提取细胞样品总 ＲNA，
1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以提取的总
ＲNA为模板，在逆转录酶 AMV 作用下反转录合成
双链 cDNA。
梅花鹿 VEGF基因 3非编码区(3UTＲ)野生型
及其突变体序列的克隆与分析:参照 GenBank 中相
关序列，设计 VEGF 基因 3UTＲ 野生型及其突变体
序 列 特 异 性 引 物 (VEGF 3 UTＲ － F:
CCGCTCGAGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCG。
VEGF 3UTＲ － Ｒ:GAATGCGGCCGCTGTGGGTGGGT-
GTGTCTACAGGAA-
TC。VEGF 3 UTＲ － mut － F:GCGCAGATG-
TAGCGGGGTCCGG。VEGF 3UTＲ － mut － Ｒ:GAC-
CCCGCTACATCTGCGCACAG。)。以 cDNA 为模板
进行 PCＲ扩增，利用 DNA 凝胶回收试剂盒回收产
物，将回收产物连接到 pMD18 － T载体上，转化大肠
杆菌 DH5α 中，涂板并于 37 ℃培养。挑取转化菌
落，接种于 LB液体培养基，37 ℃振荡培养过夜，提
取质粒并将鉴定正确的重组质粒送北京三博远志生
物技术有限责任公司进行序列测序。
双荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶活性检
测:将 VEGF基因 3UTＲ 野生型及其突变体序列分
别连入双荧光素酶报告基因载体，构建重组质粒
pmiＲ － PB － ＲeportTM Vector － VEGF － 3UTＲ，再将
重组质粒与 miＲ － 93 － 5p 模拟物(mimics)共同转
染鹿茸软骨细胞。培养 24、48、72 h 后收集 6 孔培
养板中各组细胞，加入 PLB 充分裂解，13 000 r·
min －1离心 5 min，收集上清液。按照 Dual － Lucifer-
ase Ｒeporter Assay System 试剂盒说明书进行操作，
再加入 LAＲⅡ溶液，490 nm波长下测定各孔光吸收
值，即萤火虫荧光素酶的活性测定值 M1。最后加入
Stop＆Glo Substrate，490 nm 波长下再次测定各孔光
吸收值，即海肾荧光素酶活性的测定值 M2。荧光素
酶的表达量以 M1 /M2 的比值表示。每次 3 个重复。
Stem － loop SYBＲ Green荧光定量 PCＲ检测:待
鹿茸软骨细胞汇合度达到 80%时，将 miＲ － 93 － 5p
模拟物转染细胞，培养 24、48、72 h 后收集细胞;提
取细胞总 ＲNA，反转录合成 cDNA;以 cDNA 为模
板，PCＲ 分别扩增 miＲ － 93 － 5p 及内参基因 U6。
上样体系，2． 5 × ＲealMasterMix 10． 0 μL，模板 1． 00
μL，上游引物 1． 00 μL，下游引物 1． 00 μL，20 ×
SYBＲ Solution 1． 25 μL，ＲNase free H2O 补充至 25．
00 μL。PCＲ条件，94 ℃ 2 min→(94 ℃ 20 s→58 ℃
20 s→68 ℃ 20 s)40 个循环，每个样品重复 3 次。数
据处理采用 2 － ΔΔCt相对定量的方法。
miＲ －93 － 5p对鹿茸细胞体外增殖影响的 MTT
法检测:取生长汇合度为 80%的鹿茸软骨细胞制成
细胞悬液接种于 96 孔板中，细胞贴壁后转染 miＲ －
93 － 5p 模拟物，培养 24、48、72 h 后，向培养板中加
入 5 g·L －1MTT溶液 20 μL，37 ℃孵育 4 h，弃去上
清液。每孔加入 200 μL DMSO，酶标仪 490 nm波长
下测定各孔光吸收值(OD值)。
蛋白质的免疫印迹分析:将细胞汇合度为 80%
的鹿茸软骨细胞接种于 6 孔板中，24 h 后转染 miＲ
－93 － 5p模拟物，待培养 24、48、72 h后分别收集细
胞，加入细胞裂解液，12 000 r·min －1离心 20 min。
BCA法测定蛋白质量浓度，并将所有样品调至质量
浓度一致。SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，将
蛋白胶转移到 PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭
741第 11 期 李 璐等:MiＲNA － 93 － 5p对 VEGF的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系
2 h，TBST洗膜 3 次，再将 PVDF 膜置于含一抗兔抗
人 VEGFA抗体(1∶ 200)的封闭液中温浴 2 h，TBST
洗膜 3 次，加入羊抗兔的 IgG － HＲP 二抗(1∶ 500)
中，室温孵育 2 h，TBST洗膜后，进行 ECL法显色。
统计学分析:试验数据采用 SPSS 13． 0 统计学
软件进行独立样本 t检验，判断其统计学意义，以平
均值 ±标准差表示。
2 结果与分析
2． 1 鹿茸组织总 ＲNA提取结果
采用 Trizol 法提取鹿茸组织总 ＲNA，经 1． 5%
琼脂糖凝胶电泳验证，提取 ＲNA 呈现 28、18、5 s 3
条带，总 ＲNA提取成功，可进行后续试验(图 1)。
图 1 鹿茸组织总 ＲNA提取电泳图
2． 2 梅花鹿 VEGF 基因 3UTＲ 野生型及其突变体
序列的克隆
以鹿茸软骨细胞 cDNA 为模板，利用 VEGF 3
UTＲ及其突变体引物序列进行 PCＲ扩增，并对重组
质粒 pMD －18T － VEGF 3UTＲ(包括野生型及其突
变体)进行双酶切鉴定。PCＲ 及酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳检测，结果与预期大小一致，野生型为 356
bp，突变型为 336 bp(图 2 ～图 3)。
1． PCＲ鉴定产物;2．双酶切产物;M． DNA Marker(DL2000)。
图 2 VEGF 基因 3UTＲ 野生型序列 PCＲ 扩增结果及双酶
切鉴定结果
2． 3 荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测结果见表 1。与阴性对照组
比较，转染组荧光素酶活性下降，其中 48 h 最为明
显，证明该转染体系稳定有效。将 VEGF 3UTＲ 上
预测的结合位点突变后，与阴性对照组比较，荧光素
酶活性未产生明显地变化，证实预测的 VEGF 3
UTＲ上具 miＲ －93 － 5p的结合位点。
1． PCＲ鉴定产物;2．双酶切产物;M． DNA Marker(DL2000)。
图 3 VEGF基因 3UTＲ 突变体序列 PCＲ 扩增结果及双酶切
鉴定结果
表 1 荧光素酶检测结果
组 别 阴性对照组 miＲ － 93 － 5p转染组
24 h野生型 1． 127 3 ± 0． 041 9 0． 993 0 ± 0． 018 7
24 h突变体 1． 199 1 ± 0． 031 4 1． 184 7 ± 0． 022 0
48 h野生型 1． 115 6 ± 0． 036 3 0． 692 7 ± 0． 021 1
48 h突变体 1． 123 0 ± 0． 025 6 1． 156 0 ± 0． 012 1
72 h野生型 1． 197 6 ± 0． 040 8 0． 871 2 ± 0． 013 2
72 h突变体 1． 113 3 ± 0． 044 0 1． 097 2 ± 0． 009 6
注:表中数据为平均值 ±标准差。
2． 4 Stem － loop 荧光定量 PCＲ 检测 miＲ － 93 － 5p
的表达水平
鹿茸软骨细胞转染 miＲ － 93 － 5p 模拟物 24、
48、72 h后，miＲ －93 － 5p相对表达水平分别为 296．
45、683． 74、157． 39。与正常细胞组(10． 93)、阴性
对照组(8． 89)相比，转染组表达水平明显升高，且
48 h表达水平最高，进一步验证了 miＲ － 93 － 5p 可
以在细胞内稳定而高效地表达。
2． 5 鹿茸软骨细胞体外增殖 MTT法检测
利用 MTT 法对转染后鹿茸软骨细胞的生长状
态进行观察。由表 2 可知，鹿茸软骨细胞的增殖在
转染 miＲ － 93 － 5p 后发生显著变化，与正常细胞组
及阴性对照组相比，转染 miＲ － 93 － 5p 组鹿茸软骨
细胞的增殖速度变缓，体外细胞的增殖受到抑制。
表 2 转染 miＲ － 93 － 5p对鹿茸软骨细胞增殖的影响
组 别 正常细胞组 阴性对照组 miＲ －93 － 5p转染组
转染 24 h 0． 547 6 ± 0． 009 8 0． 519 6 ± 0． 028 9 0． 339 3 ± 0． 024 7
转染 48 h 0． 515 2 ± 0． 027 5 0． 489 0 ± 0． 011 3 0． 202 0 ± 0． 018 7
转染 72 h 0． 526 5 ± 0． 016 2 0． 499 8 ± 0． 033 5 0． 257 2 ± 0． 026 5
注:表中数据为平均值 ±标准差。
2． 6 miＲ － 93 － 5p 转染鹿茸软骨细胞后 VEGF 表
达的 Western blotting检测
利用Western blotting检测转染 miＲ －93 － 5p后
鹿茸软骨细胞 VEGF 蛋白的表达水平。结果显示，
与内参 GAPDH 相比，正常细胞组与阴性对照组无
明显变化，转染组蛋白表达水平随着时间的延长逐
841 东 北 林 业 大 学 学 报 第 42 卷
渐降低，说明 miＲ － 93 － 5p 在一定程度上抑制了
VEGF蛋白的表达，见图 4。
1．正常细胞;2．阴性对照;3．转染 24 h;4．转染 48 h;5．转染 72 h。
图 4 转染 miＲ － 93 － 5p 后鹿茸软骨细胞 VEGF 蛋白表达
的 Western blotting检测
3 结论与讨论
鹿茸是我国名贵的传统中药，其药用价值多少
年来一直受到人们的青睐。鹿茸拥有令人惊奇的生
物学现象:其具有惊人的生长速度，但却没有任何癌
变的迹象;鹿茸是唯一能够完全再生的哺乳动物器
官，每年能够完全再生一次［13］。因此，鹿茸已经成
为很好地研究再生的医学模型，为人类提供了唯一
的探讨生长调控过程的机会。有研究表明，这一现
象是生长中的鹿茸顶端存在血管化的软骨，而有别
于其它典型的无血管化软骨。但血管在软骨生长中
的机制以及促使鹿茸快速生长的因素至今为止仍不
太为人所知。还有研究显示，在鹿茸顶端前软骨和
软骨组织检测到 VEGF 及其受体的表达，这一发现
与 VEGF 在鹿茸血管生成中的作用是一致的。
VEGF的生物学特性主要表现在:增加微血管的通
透性，促进血管内皮细胞的分裂和增殖，进而导致新
生血管的生成，VEGF 主要是通过与其受体的结合
发挥生物学作用［14］。
MicroＲNA是所有小分子非编码 ＲNA中研究得
最多也最为深入的。它是真核生物细胞中存在的一
类小调控 ＲNA，它们基于与靶 mＲNA 序列互补，可
以降解靶 mＲNA和抑制蛋白质翻译，从而对生物体
基因表达起到精细调节的作用。miＲNA 的功能主
要是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生过程
有关的基因的表达。在动物的全部基因中，miＲNA
参与了 30%左右基因的表达调控，包括大多数生
长、发育、癌症发生等生理机制［15 － 16］。目前，对鹿
miＲNA 的鉴定、表达谱分析及功能研究知之甚少，
而 miＲNA介导的表达调控方式是基因表达调控机
制中不可缺少的重要组成部分，发现和鉴定特定组
织细胞发育阶段中特定非编码 ＲNA 及其在基因表
达调控中的具体作用是当前及今后一段时间内功能
基因组学研究的热点之一。因此，鉴于鹿茸独特的
生理作用，本课题首先在克隆获得 VEGF 基因 3
UTＲ序列的基础上，利用生物信息学软件分析其 3
UTＲ序列中存在的 miＲNA 位点共 31 个，再结合本
课题组以往制备的鹿茸顶端不同组织 miＲNA 芯片
结果，筛选出 9 种可调控 VEGF基因的靶 miＲNA，发
现其中 miＲNA －93 － 5p 是鹿茸顶端不同组织中差
异表达最明显的。据此，选择 miＲNA －93 － 5p 进行
后续的研究。同时，荧光素酶活性检测系统进一步
验证了 VEGF 是 miＲNA － 93 － 5p 调控的靶基因。
在此基础上，将人工合成的 miＲNA模拟物转染至鹿
茸细胞后模拟内源性 miＲNA 发挥作用。MTT 法检
测结果表明，与对照组比较，转染 miＲ － 93 － 5p 的
细胞增殖受到抑制，VEGF 蛋白的表达水平有所下
降，且呈时间依赖性。这些结果证明了 miＲNA － 93
－ 5p对 VEGF具有一定的调控作用，进而对鹿茸软
骨细胞的体外增殖具有抑制作用。
近年来，国内外众多学者对鹿茸角可完全再生
这一特殊的动物学生命现象给予了高度的关注。而
相对于其他哺乳动物来说，鹿 miＲNA的研究相对较
少。本研究发现，在鹿茸软骨细胞的快速生长中，
miＲNA可以抑制 VEGF 的表达。从 ＲNA 水平上探
讨了 miＲNA在鹿茸生长发育中的调控作用。不仅保
存了鹿这一我国珍贵物种的基因资源，也为从根本上
阐明鹿茸生长的分子机理提供了新的参考依据。
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