全 文 ：实验研究
乌骨藤提取物体外对人肠癌细胞增殖实验研究■
朱萱萱＊ 赵路华＊＊ 严士海＊ 张忠华＊ 邵南齐＊
摘 要:目的:研究乌骨藤提取物对体外培养的人肠癌细胞(lovo)增殖的影响。方法:用两种方法(A 、B)制备乌骨藤提取物 , 采
用不同浓度的乌骨藤提取物分别作用于培养的 lovo 细胞 ,通过细胞形态学和 MTT 法检测乌骨藤提取物对 lovo细胞增殖的影
响。结果:乌骨藤提取物 A 对细胞的最大无毒浓度大约为 0.648mg ml;药物浓度在 0.389mg ml、0.648mg ml、1.08mg ml、
1.8mg ml、3mg ml时的抑制率分别为 6.58%、8.24%、13.02%、59.69%、66.23%;用回归法求出乌骨藤提取物 A 对 lovo细胞
增殖的半数抑制浓度为 1.625mg ml。乌骨藤提取物 A对细胞的最大无毒浓度大约为 0.648mg ml;药物浓度在 0.389mg ml、
0.648mg ml、1.08mg ml 、1.8mg ml 、3mg ml时的抑制率分别为 14.49%、15.48%、29.69%、63.26%、64.05%;用回归法求出
乌骨藤提取物 B对 lovo细胞增殖的半数抑制浓度为 1.84mg ml。结论:乌骨藤提取物对体外培养的人肠癌细胞(lovo)的增殖
有明显抑制作用。
关键词:乌骨藤提取物;人肠癌细胞;M TT 法;细胞形态学
中图分类号:R285.5 文献标识码:B 文章编号:1006-0979(2008)03-0046-03
乌骨藤是萝摩科牛奶菜属植物通光藤[ Marsdenia tena-
cissima(Roxb.)Wight et Am.] 的藤茎 , 始载于《滇南本
草》 [ 1] 。含有多种甾体酯苷 、生物碱 、 有机酸 、多糖 、 树脂及
色素等多种化学成分[ 2] 。乌骨藤临床主要用于抗肿瘤 , 但对
用于治疗肝癌 、肺癌 、 胃癌的报道较多。本实验通过细胞形
态学 、噻唑蓝(MTT)比色法 , 检测乌骨藤提取物对人结肠腺
癌细胞的抑制率及 IC50 值 , 为临床应用乌骨藤抗人结肠腺
癌提供参考。
1 实验材料
1.1 实验用药及试剂:乌骨藤提取物 , TA+MH>90%由中
国药科大学提供。 RPMI Medium1640:GIBCO 公司 , Cat.
No.31800.022.碳酸氢钠:上海虹光化工厂 , 批号:051227。
链霉素:大连美罗大药厂 , 批号:050707。青霉素:山东鱼抗
医药股份有限公司 ,批号:051227。胎牛血清:北京元享圣马
研究所 ,批号:050320。胰蛋白酶:上海伯奥生物技术有限公
司 ,批号:050401。 MT T:Sigma 公司 细胞培养板:丹麦
NUNC 公司。
1.2 实验用细胞株:Lovo:(人结肠腺癌细胞株)南京市鼓楼
医院提供。
1.3 实验用仪器:CO 2 培养箱:Heraeus 公司。捷达形态学
图像分析系统:SW-CJ-IP净化工作台:苏州安泰空气技术
有限公司。微孔滤膜:MILLEX GP , EXP , 2009-03 酶标仪:
瑞士 TECAN 公司 , 型号 SUNRISE。
■江苏省科技厅自然科学基金 BK2005100资助
＊江苏省中医院(210029)
＊＊中国药科大学
2007年 8月 3日收稿
1.4 实验药物的配制:乌骨藤提取物 A药:精密称取乌骨藤
提取物 0.5g , 加入到 5ml完全培养液中 , 超声振荡 , 溶解 ,
0.22um 微孔滤器过滤除菌 , 配成 100mg ml药物溶液。用完
全培养液把乌骨藤提取物 A 药 , 按 1:0.6 倍比稀释成
5.0mg ml、 3.0mg ml、 1.8mg ml 、 1.08mg ml 、 0.648mg ml、
0.389mg ml、0.233mg ml不同浓度备用。
乌骨藤提取物 B 药:称取乌骨藤提取物 0.5g , 加入到
5mIPBS 中 ,超声振荡 , 使之溶解 , 配成 100mg ml药物溶液 ,
高温灭菌。用完全培养液把乌骨藤提取物 B 药 ,按 1:0.6 倍
比稀 释 成 5.0mg ml、 3.0mg ml、 1.8mg ml 、 1.08mg ml、
0.648mg ml、0.389mg ml、0.233mg ml不同浓度备用。
环磷酰胺:按 1:0.6 倍比用完全培养液把环磷酰胺稀释
为 12mg ml、0.6mg ml、7.68mg ml、6.14mg ml、4.92mg ml、
3.93mg ml 、3.15mg ml、2.52mg ml不同浓度备用。
2 实验方法与结果
2.1 提取物对 Lovo细胞增殖的影响:取接种 Lovo 细胞的
培养板 , 吸去 96 孔板内旧的培养液 , 取上稀释的药物 , 加
入到孔内 , 100ul 孔 , 同时设空白对照 , 然后置于 37℃, 5%
CO2 培养箱内继续培养 , 定时观察细胞生长情况。结果见表
1～ 表 3。
观察标准:-无细胞形态改变 、+25%细胞病变 、++
50%细胞病变 、+++75%细胞病变 、++++100%细胞病
变。
表 1所示 ,加入乌骨藤提取物 A 药培养 24h 后观察 , 浓
度≤0.648mg ml时几乎无细胞形态改变;浓度为 3.0mg ml
时细胞形态发生≥75%的改变;乌骨藤提取物 A 药对 Lovo
细胞的最大无毒浓度约在 0.648mg ml之间。
46 内蒙古中医药
DOI :10.16040/j.cnki.cn15-1101.2008.05.065
表 1 乌骨藤提取物 A药对 Lovo 细胞增值的影响(24h)
浓度(mg ml) 细胞形态
5 ++++++++++++++++++++++++
3 ++++++++++++++++++++++++
1.8 ++ +++ +++ ++ +++ +++
1.08 ++ + - + - +
0.648 - - - - - -
0.389 - - - - - -
0.233 - - - - - -
0 - - - - - -
浓度(mg ml) 形变孔数/总孔数
计算资料
已知数据 组次 形变率(P)
3 6/ 6 Dm=3 1 1
1.8 6/ 6 Xm=0.4771 2 1
1.08 4/ 6 n=6 3 0.6667
0.648 0/ 6 k=5 4 0
0.389 0/ 6 i=0.2218 5 0
IC50=lg-1[ lgXm-i(p-0.5)] =lg-1 [ 0.4771-0.2218(2.
6667-0.5)] =0.9912mg ml采用孙氏综合法计算 , 提取物 A
药 24h 对 Lovo 细胞的 IC50为 0.9912mg ml。
表 2:乌骨藤提取物 B对 Lovo细胞增值的影响(24h)
浓度(mg ml) 细胞形态
5 ++++++++++++++++++++++++
3 +++ ++++++++++++++++++++
1.8 +++ +++ +++ ++ +++ +++
1.08 + + - ++ + +
0.648 - - - - - -
0.389 - - - - - -
0.233 - - - - - -
0 - - - - - -
表 2所示 ,加入乌骨藤提取物 B 药培养 24h 后观察 , 浓
度≤0.648mg ml时几乎无细胞形态改变;浓度为 3.0mg ml
时细胞形态发生≥75%的改变;乌骨藤提取物 B 药对 Lovo
细胞的最大无毒浓度约在 0.648mg ml之间。
浓度(mg ml) 形变孔数/总孔数
计算资料
已知数据 组次 形变率(P)
3 6/ 6 Dm=3 1 1
1.8 6/ 6 Xm=0.4771 2 1
1.08 5/ 6 n=6 3 0.8333
0.648 0/ 6 k=5 4 0
0.389 0/ 6 i=0.2218 5 0
IC50=lg-1[ lgXm-i(p-0.5)] =lg-1 [ 0.4771-0.2218(2.
8333-0.5)] =0.9111mg m 采用孙氏综合法计算 , 提取物 B
药 24h 对 Lovo 细胞的 IC50为 0.9111mg ml。
表 3:环磷酰胺对 Lovo细胞增值的影响(24h)
浓度(mg ml) 细胞形态
12 ++++ +++ ++++++++++++++++
9.6 +++ ++ +++ +++ +++ +++
7.68 ++ + - + + ++
6.14 - + + - - -
4.92 - - - - - -
3.93 - - - - - -
3.15 - - - - - -
2.52 - - - - - -
0 - - - - - -
表 3 所示 ,加入环磷酰胺培养 24h 后观察 , 浓度≤6.14mg ml
时几乎无细胞形态改变;浓度为 12.0mg ml时细胞形态发生
≥75%的改变;环磷酰胺对 Lovo 细胞的最大无毒浓度约在
6.14mg ml之间。
浓度(mg ml) 形变孔数/总孔数
计算资料
已知数据 组次 形变率(P)
12 6/ 6 Dm=12 1 1
9.6 6/ 6 Xm=1.0792 2 1
7.68 5/ 6 n=6 3 0.8333
6.14 2/ 6 k=5 4 0.3333
4.92 0/ 6 i=0.0969 5 0
IC50=lg-1 [ lgXm - i(p -0.5)] =lg-1 [ 0.0792 -0.0969
(3.1667-0.5)] =6.62mg ml采用孙氏综合法计算 , 环磷酰
胺 24h 对 Lovo 细胞的 IC50为 6.62mg ml。
2.2 乌骨藤提取物对 Lovo细胞增殖的影响:(M TT 法)
2.2.1 取接种 Lovo 细胞的培养板 , 吸去 96 孔板内旧的培
养液 ,取以上稀释的药物 , 加入到孔内 , 100ul/孔 ,同时设空白
对照 ,然后置于 37℃。 5%CO2 培养箱内继续培养 , 24h 后做
MTT 实验。
2.2.2 MTT 实验:每孔加入 MTT 溶液(5mg ml)20ul ,
37%,继续孵育 4h ,终止培养 ,小心吸去孔内培养上清液 , 每
孔加入 150ulDMSO , 振荡 10min , 使结晶物充分溶解。选择
450nm 波长 ,在酶联检测仪上测定各孔光吸收值。数据统
计:采用 SPSS.12.0 统计:用方差分析率比较组间差异;用回
归法求出 IC5 0结果见表 4-6。
表4 乌骨藤提取物 A药对 Lovo细胞增值的影响(MTT 法)
浓度(mg ml) OD值 抑制率(%) IC50(mg ml)
0 0.716±0.097
0.389 0.669±0.078 6.58
0.648 0.657±0.062 8.24
1.08 0.623±0.070 13.02 1.625
1.8 0.289±0.046 59.69
3 0.242±0.046 66.23
表 4 所 示 :乌骨 藤 提取 物 A 药 对 Lovo 细 胞的 IC50 为
1.625mg ml。
472008年第 3期
表 5 乌骨藤提取物 B 药对 Lovo细胞增值的影响(MTT 法)
浓度(mg m l) OD值 抑制率(%) IC50(mg m l)
0 0.716±0.097
0.389 0.613±0.074 14.49
0.648 0.605±06066 15.48
1.08 0.504±0.128 29.67 1.84
1.8 0.263±0.009 63.26
3 0.258±0.030 64.05
表 5 示:乌骨藤提取物 A 药对 Lovo 细胞的 IC50为 1.84mg
ml。
表 6:环磷酰胺对 Lovo细胞增值的影响(MTT 法)
浓度(mg ml) OD 值 抑制率(%) IC50(mg ml)
0 0.664±0.051
4.92 0.506±0.040 23.85
6.14 0.443±0.021 33.36 8.35
7.68 0.368±0.042 44.65
9.6 0.235±0.030 64.61
12 0.225±0.016 65.11
表 6 所示:环磷酰胺对 Lovo细胞的 IC50为 8.35mg ml。
MTT 法实验结果所示:(1)乌骨藤提取物 A 药对 Lovo
细胞的 IC5 0为 1.625mg ml。(2)乌骨藤提取物 B 药对 Lovo
细胞的 IC5 0为 1.84mg ml。
3 讨 论
乌骨藤 , 性味苦 , 微寒 , 具有消炎 、清热解毒 、止咳平喘 、
散结止痛等功效 , 可治疗肺炎 、慢性支气管炎 、咳喘等。现代
药理研究表明 ,乌骨藤含有的独特化学成分具有免疫调节 、
保肝利尿 、败毒抗癌等作用 , 以制备而成的中药消癌平 ,对胃
癌 、肝癌等各种肿瘤具有良好的疗效 , 是一种很有前途的抗
肿瘤中药。本实验用两种方法(A、B)制备乌骨藤提取物 , 采
用1:0.6 倍比稀释不同浓度分别作用于培养的 Lovo 细胞 ,
通过细胞形态学和 M TT 法检测乌骨藤提取物对 Lovo 细胞
增殖的影响 ,实验结果表明:乌骨藤提取物 A 对细胞的最大
无毒浓度大约为 0.648mg ml;药物浓度在 0.389mg ml、
0.648mg ml、1.08mg ml 、1.8mg ml、3mg ml时的抑制率分别
为 6.58%、8.24%、13.02%、59.69%、66.23%;用回归法求
出乌骨藤提取物 A 对 LOvo 细胞增殖的半数抑制浓度为
1.625mg ml。乌骨藤提取物 A 对细胞的最大无毒浓度大约
为 0.648mg ml;药物 浓 度 在 0.389mg ml、 0.648mg ml、
1.08mg ml 、1.8mg ml 、3mg ml时的抑制率分别为 14.49%、
15.48%、29.69%、63.26%、64.05%;用回归法求出乌骨藤
提取物 B对 Lovo 细胞增殖的半数抑制浓度为 1.84mg ml。
乌骨藤提取物对体外培养的人结肠腺癌细胞(Lovo)的增殖
有明显抑制作用 , 对人结肠腺癌细胞的增殖抑制活性呈剂
量 、时间依赖关系 , 即细胞增殖抑制率随着药物浓度和时间
的增加而增加。实验中用两种不同的方法处理乌骨藤提取
物 ,分别作用于 LoVo 细胞。结果表明 ,两种不同方法配置的
乌骨藤提取物 ,对 LoVo 细胞增殖都具有明显的抑制作用 , 两
种不同方法配置的乌骨藤提取物之间没有显著性差别 ,说明
乌骨藤提取物中抗癌有效成分的耐热性较好。
以上研究为临床应用乌骨藤抗人结肠腺癌提供理论依
据。
参考文献
[ 1] 陈奇.中药药理实验方法学[ M ] .人民卫生出版社 ,
113—115.
[ 2] 司徒镇强.吴军正.细胞培养[ M] 第一版.世界图书出
版西安公司 , 1996.4.186—187.
[ 3] 成旋 ,张舒.MTT 法评价国产氧氟沙星对兔角膜上皮细
胞体外毒性的初步研究[ J] .中国新药杂志 , 1999 , 8(6):
378—379.
[ 4] 丰俊东 ,徐晓玉.川芎螓含药血清对人肝癌细胞 2 增殖
的抑制作用[ J.中草药 , 2005 , 36(4):551—553.
[ 5] 高寅飞 ,马海乐 , 王振斌 , 等.蜂胶的超临界 CO2 萃取物
的体外抗肿瘤作用[ J] .食品研究与开发 , 第 27(7):1—
3.
[ 6] 俞发荣 , 连秀珍.甘肃猫儿眼提取物对人 LGC—7910 细
胞毒性作用及机制[ J].甘肃科学学报 , 2005 , 17(4):26—
28.
[ 7] 司红丽 ,王建娜 , 王跃虑 , 等.狗舌草黄酮类化合物对 3
种肿瘤细胞的药物敏感试验[ J].药物生物技术 , 2003 , 10
(4):229—231.
确定半相合供者淋巴细胞输注治疗高危非霍奇金氏淋巴瘤
最佳时间和浓度的实验研究
罗 纯＊
摘 要:目的:寻找半相合供者淋巴细胞输注(DLI)抗高危非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的 DLI最佳时间和最佳浓度 , 为临床应用
提供实验依据。方法:通过测定不同时间 , 加入不同浓度的半相合供者淋巴细胞(DLs)后淋巴瘤细胞的凋亡率 , 确定淋巴瘤细
胞培养过程中加入半相合 DLs的最佳时间及最佳浓度。结果:淋巴瘤细胞培养过程中加入半相合 DLs 的最佳时间为培养后
24 小时 ,最佳浓度为 2.5×105/ ml。结论:临床实践中 ,在高危 NHL 患者化疗结束 24 小时后给予患者浓度 2.5×105/ ml的半
48 内蒙古中医药