全 文 ：香 草 兰[Vanilla fragrans (salisb.)Amess (V.
planifolia)]是一种兰科香料作物， 素有 “食品香料
之王” 的称誉， 广泛应用于食品和化妆品行业[1]。
香草兰于 20世纪 60年代被引入我国海南和云南
(西双版纳)， 因其经济价值高一度被大力推广种植。
但是由于生产前期投入高、 病害发生严重等原因，
香草兰种植面积在近年来呈下降趋势[2]。 香草兰根
(茎)腐病是香草兰上危害最严重的病害之一。 该病
害全年均可发生， 在多雨季节(7～10月份)发生较
重， 严重时可导致减产50%以上。 近年来， 该病害
的爆发流行已经成为限制香草兰产业发展的重要瓶
颈之一。
对于香草兰根(茎)腐病的病原物， 国内外仅有
少量报道。 1927年Tucker首先报道了该病害， 并
将病原物命名为尖孢镰刀菌香草兰致病变种(Fusari-
umbatatatisWr. Var.Vanillae Tucker)[3]。 1963年
香草兰根(茎)腐病病原菌鉴定及其致病性测定①
高圣风② 刘爱勤③ 桑利伟 孙世伟 苟亚峰
(中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533)
摘 要 香草兰根(茎)腐病是香草兰上重要病害之一， 目前国内外尚未有基于 rDNA-ITS序列的分子鉴定和系统
发育树分析的报道。 本研究从海南省万宁市的兴隆、 长丰和南林等地的病样中分离获得了9个菌株， 经过柯赫氏
法则验证、 形态学鉴定和分子鉴定， 病原菌被鉴定为尖孢镰刀菌， 表明海南省万宁市地区的香草兰根(茎)腐病病
原菌是尖孢镰刀菌(Fusarium. oxysporum)。 然后， 基于 rDNA-ITS序列构建了系统发育树并对菌株的致病性进行
了测定， 结果发现9个菌株在系统发育树中被聚类为遗传距离明显的 2个分枝， 而且分枝Ⅱ的致病性要高于分枝
Ⅰ。 本研究为香草兰根(茎)腐病病原物快速鉴定提供依据， 对香草兰根(茎)腐病防治决策有一定的参考意义。
关键词 香草兰根(茎)腐病 ； Fusarium oxysporum ； 病原鉴定 ； 进化树 ； 致病性
分类号 S435.73
Identification and Pathogenicity Evaluation of Fusarium Rot Disease of Vanilla
GAO Shengfeng LIU Aiqin SANG Liwei SUN Shiwei GOU Yafeng
(Spice and Beverage Research Institute, CATAS, Wanning, Hainan, 571533, China)
Abstract Vanilla fusarium rot is adevastating disease. Few molecular identification and phylogenetic
analysis based on rDNA-ITS sequences of the pathogen were reported. In this study, 9 isolates were
obtained from 3 towns, Xinglong, Changfeng and Nanlin, of Wanning city in Hainan province. Kochs
postulatestest, identifications of morphology and rDNA-ITS sequences blast were performed, results prove
that the pathogen is Fusarium oxysporum. Then the phylogenetic tree was constructed based on the
sequences of rDNA-ITS and the pathogenicity of the pathogens were determined, results show that strains
were clustered into 2 clades with apparently genetic distance in the phylogenetic tree, and the pathogenicity
of the cladeⅡwas stronger than that of the cladeⅠ . This study is useful for us to understand of vanilla
fusarium rot disease from the perspective of molecular and might be conducive to the disease control.
Keywords vanilla fusarium rot ; Fusarium oxysporum ; pathogen identification ; phylogenetic tree ;
pathogenicity
① 基金项目： 海南省自然科学基金项目 （No.314136）。
收稿日期： 2014-11-13； 责任编辑/凌青根； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 高圣风(1982～)， 男， 博士， 助理研究员， 研究方向为热带特色香料饮料作物病害生物防治； E-mail: gsfkl@163.com。
③ 通讯作者： 刘爱勤， 女， 研究员， 研究方向为热带特色香料饮料作物病虫害防控； E-mail: Laq3680@163.com。
Vol．35, No．1
2015年1月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第35卷第1期
Jan． 2015
39- -
2015年1月 第35卷第1期热带农业科学
Gordon将其重命名为尖孢镰刀菌香草兰专化型 F.
oxysporum Schl. sp. Vanillae(Tuck)Gordon [4]。 在
1969年Alcornero和Santi认为香草兰根(茎)腐病
是由尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌(F.
solani)混合侵染而引起的[5]。 2010年Pinaria等人
从印度香草兰产区分离了542株镰刀菌， 涵盖镰刀
菌属的12个种， 发现仅尖孢镰刀菌对香草兰具有
致病性[6]。 在国内， 1986年， 黄伙平对福建香草兰
根腐病病原进行了鉴定， 认为病原物是尖孢镰刀菌
香草兰专化型[7]。 1998年， 阮兴业等人对云南省西
双版纳和海南省的香草兰病害进行了综合报道， 认
为两地的香草兰根(茎)腐病属 2种镰刀菌(尖孢镰刀
菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌)混合侵染导致， 其中尖
孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原菌[8]。 2011年，
刘爱勤等人对海南的香草兰病害进行调查， 发现香
草兰根(茎)腐病危害重大， 其病原物鉴定结果与阮
兴业等人相同[9]。 但是， 在以上报道中， 病原物鉴
定仅采用传统鉴定方法， 没有涉及利用核糖体基因
转录间隔序列(Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，
rDNA-ITS)对香草兰根(茎)腐病菌进行辅助鉴定。 在
美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotech-
nology Information， NCBI)网站的GenBank中能够搜索到
一些香草兰根(茎)腐病菌 rDNA-ITS序列， 其来源
菌株均被鉴定为尖孢镰刀菌或者尖孢镰刀菌香草兰
转化型， 但没有找到相关的文章报道。
为了进一步了解香草兰根(茎)腐病病原物， 本
课题组在海南省万宁市兴隆、 长丰和南林三个地方
采集香草兰根(茎)腐病样本， 进行病原菌分离纯
化、 形态学鉴定、 分子鉴定、 系统发育树构建、 致
病性分析等工作。
1 材料和方法
1.1材料
本研究微生物培养所用培养基为马铃薯葡萄糖
琼脂培养基(PDA)[10]； 病害样本采集于海南万宁的
兴隆、 长丰和南林等地； 所用的试剂盒包括天根生
化科技(北京)有限公司的 “快速 DNA提取扩增套
装”、 “DNA纯化回收” 试剂盒和宝生物工程(大
连)有限公司 “pMD 18-T Vector Cloning Kit”；
所用的仪器主要有 ： 恒温振荡器(NBS， Inonova
44R)、 光学显微镜(Olympus， BX51)、 生物培养箱
(Percival， E-30B)、 水 平 电 泳 仪 (Tanon，
EPS2000)、 凝胶成像仪(LongGene， LG2020D)和台
式离心机(Heal Force， Neofuge 18R)。
1.2方法
1.2.1病害样本采集和病原菌分离、 纯化
2014年3～4月， 分别于海南万宁的兴隆、 长
丰和南林等地采集香草兰根(茎)腐病病害样本。 在
发病严重的园块中选择处于发病初期且病害症状典
型的茎蔓， 用剪刀剪下收集， 每园块采集样本1～
2个。 然后进行病原物分离纯化。 将病样冲洗干净
后， 在超净工作台中用 30%次氯酸钠消毒 5 min，
70%酒精消毒 30s， 无菌水清洗 3次后将病健交界
处切成小块放在PDA培养基[10]上。 将PDA平板置于
26℃恒温培养箱中培养3d。 待平板中长出菌落后，
从菌落边缘挑取菌丝转接于新的 PDA平板中培养，
重复转接5次进行纯化。
1.2.2形态学鉴定
将分离得到的菌株接种到 PAD平板上 ， 在
26℃恒温条件下培养4d后观察菌落形态， 并用单
反相机(Canon EOS550D)拍照。 培养 14 d后用光学显
微镜(OlympusBX51)在 400倍视野下观察菌丝、 分生
孢子和厚垣孢子形态， 用 Image-Pro Plus 6.1图
像分析软件进行图像采集和分析。
1.2.3柯赫氏法则验证
将分离得到的菌株接种到PDA平板上， 在26℃
恒温条件下培养2周后将培养基打成直径0.5cm的
菌块备用。 将土壤和椰糠在121℃条件下灭菌30min，
冷却后装入花盆中备用。 将健康的香草兰茎蔓(去除
嫩梢)后剪成 50cm长度定植在花盆上， 每盆 2株。
用消毒过的大头针在香草兰茎节气生根基部刺3个
深约 0.3cm的伤口。 将准备好的菌块放置于伤口
上， 用无菌水脱脂棉保湿， 用无菌 PDA块作为对
照。 在室温条件下培养3周后观察结果。 从发病茎
秆中再次分离病原物， 将分离菌株与接种菌株进行
比较。
1.2.4基因组 DNA提取和 rDNA-ITS 序列扩增
本研究所用引物为真菌 rDNA-ITS区通用引物
ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TC-
CTCCGCTTATTGATATGC-3′)。 该引物扩增区间为： 部
40- -
高圣风 等 香草兰根(茎)腐病病原菌鉴定及其致病性测定
分 18SrDNA、 ITSⅠ区 -5.8SrDNA-ITSⅡ区和部分
28SrDNA。 引物由深圳华大基因科技服务有限公司
合成。 基因组DNA提取和ITS序列扩增使用天根生
化科技(北京)有限公司的 “快速DNA提取扩增套装”
试剂盒进行。 基因组提取方法和PCR扩增体系均参
照说明书进行。 PCR程序为： 94℃45s， (94℃30s，
52℃30 s， 72℃30 s)×30个循环， 72℃10min，
12℃10min。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后
在紫外凝胶成像仪下观测和拍照。
1.2.5rDNA-ITS 区序列的克隆、 测序和 BLAST
比对
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后， 将大小
约500 bp的目标条带用天根生化科技(北京)有限公
司的 “DNA纯化回收试剂盒” 进行纯化回收。 回收
产物通过宝生物工程(大连)有限公司 “pMD 18-T
Vector Cloning Kit” 进行TA克隆， 然后转入Es-
cherichia coli TOP10感受态细胞中。 通过菌落
PCR筛选出阳性克隆子后送到深圳华大基因科技服
务有限公司测序。 测序结果在 NCBI网站的基本局
部比对搜索工具(The Basic Local Alignment Search Tool,
BLAST)进行序列比对分析， 根据 ITS序列的同源性
对分离菌株进行鉴定。
1.2.6致病性测定
接种菌块与香草兰苗的准备与本文1.2.3小节
相同。 用消毒过的手术刀片在香草兰茎上横切1个
深约 0.3cm的伤口， 将准备好的菌块放置于伤口
上， 用无菌水脱脂棉保湿， 以无菌 PDA块作对照，
每个处理10株。 在室温条件下培养 3周后统计病
斑长度。 使用SPSS16.0对数据进行单向比较(One-
way ANOVA)分析。
1.2.7系统发育树的构建
除了本研究获得的9个香草兰根(茎)腐病菌株
外， 其它12个菌株的rDNA-ITS序列均从 GenBank
下载获得。 以2株大豆猝死病病原菌 F. solani(登陆
号分别为AF125027和AF124995)为外群， 首先用Clustal
X 2.1软件进行序列比对分析， 然后使用MEGA6.06
软件采用 Neighbor-joining计算方法和 boot-
strap检验方法(1000次重复)进行系统发育树构建。
2 结果与分析
2.1病害样本采集和病原菌分离、 纯化
共从海南万宁的兴隆、 长丰和南林等地采集香
草兰根(茎)腐病病害样本 12个。 从病害样本中分
离纯化出菌株9个， 菌株编号及其来源详见表l。
2.2形态学鉴定
9个菌株在 PDA平板上培养 4d后， 其菌落形
态十分一致： 菌落正面气生菌丝呈白色棉絮状(图
1A)， 菌落背面中心区域略带紫红色(图 1B)。 培养
14d后， 挑取少量菌丝于载玻片上， 在显微镜400
倍视野下观察分生孢子形态， 9个菌株的观察结果
一致： 可以观测到小型分生孢子(图 1C中虚线箭头所
示)、 大型分生孢子(图1C中实线箭头所示)和厚垣孢子
(图1D中箭头所示)。 经Image-ProPlus 6.1图像分析
软件测量得出小型分生孢子大小约为(2.3～4.5)μm
×(5.0～15.5)μm， 大型分生孢子(3.0～5.8)μm×
(4.0～15.0)μm， 厚垣孢子直径约为5.5～13.0μm。
分生孢子和厚垣孢子的形态特征与刘爱勤等人[11]所
述 F. oxysporum 的形态特征一致。 因此， 将这9个
菌株编号 菌株编号 采集地点
VFO01 VFO51南林
VFO02 VFO52南林
VFO13 VFO64南林
VFO23 VFO65南林
VFO39
采集地点
兴隆
兴隆
兴隆
长丰
长丰
表1 本研究从香草兰病样中分离的菌株编号及采集地点
图1 分离菌株的菌落(A和B)、 分生孢子(C)
和厚垣孢子(D)形态
41- -
2015年1月 第35卷第1期热带农业科学
M - 1 2 3 4 5 M - 6 7 8 9bp
2000
1000
750
500
250
图3 rDNA-ITS区片段PCR扩增电泳图
说明： M即Mark； -为清水对照； 1～9为本研究获得的9个菌株。
A
图4 9株病原菌对香草兰的致病性分析
说明： 病斑长度显示为 “平均值±标准偏差”； 采用 Fishers
LSD tests， 含有相同字母的处理间差异不显著， P＜0.05。
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
病
斑
长
度
/c
m
VF
00
1
VF
00
2
VF
01
3
VF
02
3
VF
03
9
VF
05
1
VF
05
2
VF
06
4
VF
06
5
bc
a
ab
c
bc
ab ab
bc
abc
B
图2 病原物的柯赫氏法则鉴定
说明： A.对照； B.接菌植株的发病症状； C.田间植株的发病症
状； D.从接菌处理植株病斑中分离出的菌株菌落形态。
菌株鉴定为 F. oxysporum。
2.3柯赫氏法则验证
将从田间病害样本中分离出的菌株回接到
香草兰上3周后， 对照茎蔓(图 2A)没有发病，
接菌茎蔓出现褐色皱缩的病斑(图 2B)， 其症
状与田间的香草兰根(茎)腐病(图 2C)一致 。
而且从发病茎蔓中能够分离出与接种菌株形
态一致的菌株(图 2D)。 依照柯赫氏法则， 认
为分离得到的 9株真菌是香草兰根(茎)腐病
的病原菌。
2.4rDNA-ITS序列鉴定
以 9个菌株的 DNA为模板 ， 使用通用引物
ITS1和 ITS4进行 PCR扩增， 9个菌株均能够扩增
出大小约 500 bp的目的片段(图 3)。 测序结果表
明， 扩增片段大小均为544bp。 BLAST比对结果表
明， 测序片段与 GenBank中的许多尖孢镰刀菌的
ITS序列大小相同、 相似度≥99%。 这些相似度高的
菌株有： 尖孢镰刀菌瓜类专化型(登录号： AY188919)，
尖孢镰刀菌古巴专化型(登录号： HQ694500)、 尖孢镰刀
菌萎蔫专化型(登录号： AF322075)， 等等。 结合形态学
鉴定结果认为， 该9株病原菌均是尖孢镰刀菌。
2.5致病性分析
将 9个菌株接种到香草兰茎蔓伤口上 3周后，
接菌处理的香草兰茎蔓上有褐色皱缩病斑(图4A)，
该症状与田间香草兰根(茎)腐病症状一致。 病斑长
度测量后采用 Fishers LSD tests方法进行显著
性分析(P＜0.05)(图4B)发现： 所有9个菌株均对香
草兰有致病能力， 致病性最强的是VFO02菌株(病斑
平均长度为 3.49cm)， 致病性最弱的是 VFO23菌株(病
斑平均长度为2.06cm)。
42- -
高圣风 等 香草兰根(茎)腐病病原菌鉴定及其致病性测定
2.6系统发育树构建
将测序获得的 9个 rDNA-ITS片段序列， 与从
Genbank中下载的12个序列进行比对分析， 构建系
统发育树(图 5)。 其中所有尖孢镰刀菌被聚类在同
一分枝， 与茄腐镰刀菌外群有着明显的进化距离。
其中尖孢镰刀菌分枝再次分为 2个分枝。 分枝Ⅰ
(CladeⅠ)由13个菌株组成， 包括5个本研究获得
的菌株(VFO01、 VFO23、 VFO39、 VFO64和VFO65)， 3个以香
草兰为寄主的菌株(F. oxysporum f. sp. vanillae22ma140， 哥
伦比 亚 ； F. ox ysporum KKK 19， 印 度 ； F. oxysporumf.sp.
VanillaeML-8-1， 中国云南)， 以及5个其他专化型菌株
(F. oxysporum f.sp. Pisi Arg3； F. oxysporum f. sp.cubense E13；
F. oxysporum f. sp. vasinfectum Ag149-I； F. oxysporum f. sp. ci-
ceris FOC153； F. oxysporum f. sp. melonis MA3)。 分枝Ⅱ
(CladeⅡ)由 5个菌株组成， 包括 4个本研究获得
的菌株(VFO02、 VFO13、 VFO51和 VFO52)和 1个以香草兰
为寄主的尖孢镰刀菌(F. oxysporum Fo235)。 比较
9株病原菌的致病能力(见图 4)， 发现分枝Ⅱ中 4
个菌株的病斑长度均大于分枝Ⅰ的 5个菌株， 但
是 2个分枝间只有部分菌株的差异达到了显著水
平。 并且两个分枝间有着明显的进化距离， 说明香
草兰根(茎)腐病病原菌的变异度较广。
3 讨论
前人对香草兰根(茎)腐病的病原物种类存在分
歧， 一种观点认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化
型； 另一种观点认为尖孢镰刀菌香草兰专化型是主
要病原物， 茄腐镰刀菌也是该病害的病原物。 本研
究对海南省万宁市地区的香草兰根(茎)腐病进行采
样， 分离得到了9株病原菌， 综合形态学和分子方
法鉴定结果认为， 该 9株病原菌均是尖孢镰刀菌。
该结果与第一种观点一致。 在本研究构建的系统发
育树中， 9个病原菌菌株均与茄腐镰刀菌有着相当
的遗传距离， 也支持这些菌株均是尖孢镰刀菌的观
点。 鉴于尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌均是很多种植物
的病原物且往往病害症状相近， 本研究不排除茄腐
镰刀菌也是香草兰病原菌的可能性。 无论如何， 本
研究对了解海南省万宁地区的香草兰根(茎)腐病病
原菌， 尤其是以分子的角度对尖孢镰刀菌进行辅助
鉴定和系统发育树分析， 有一定的参考价值。
本研究分离获得的9个香草兰根(茎)腐病病原
菌株在系统发育树上被聚类为遗传差异明显的2个
分枝， 说明该病原菌的 rDNA-ITS区序列的遗传变
异度很大。 在进化树中， 9株香草兰根(茎)腐病病
原菌被分散的分别聚类于 F. oxysporum 各转化型之
间， 且遗传距离跨度较大。 其原因可能有 2方面：
(1)香草兰是国外引进物种， 其病原物可能既存在
国外群体又包含本土群体； (2)目前国内外对该病
害病原物的研究极少， 缺乏
可参考的 ITS序列。 此外，
F. oxysporum 的rDNA-ITS区
序列变异度非常大， 即使在
研究较为透彻的香蕉枯萎病
菌上也难以通过 rDNA-ITS
序列对生理小种进行分类
[12-13]。
通过比较病原菌接种后
香草兰茎蔓上形成的病斑长
度， 可以看出系统发育树中
分枝Ⅱ的的致病能力要强于
分枝Ⅰ， 这说明该病害病原
菌群体中有可能存在2个致
病能力不同的分枝。 本研究
只是小样本数量的盆栽试验， 并且2个分枝间的致
病性差异没有全部达到显著水平， 这个观点还需要
更多数据支持。
图5 基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树
43- -
2015年1月 第35卷第1期热带农业科学
参考文献
[1]Purseglove J W, Brown E G, Green C L, et al. Speces
[Vol(2)][M]. Harlow, UK and Newyork USA, Longman
Group Ltd, 1981: 447-813.
[2]欧阳欢.香草兰产业发展历程和展望[J].农业与技
术， 2006， 26(1)： 66-68.
[3]Tucker C M. Journal of Agricultural Research[J].
35(12): 1112-1136.
[4] Gordon W L. Pathogenic strains of Fusariumoxyspo-
rum[J]. Canadian Journal of Botany, 1965, 43(11):
1 309-1 318.
[5] Aleone R san iago, Almag. Fusaria pathogen to
vanill[J]. Pl. Dis Rept. 1969, 53(11): 854-557.
[6] Pinaria A G, Liew E C, Burgess L W. Fusarium
species associated with vanilla stem rot in In-
donesia[J]. Australasian Plant Pathology, 2010,
39(2): 176-183.
[7]黄伙平.香荚兰根腐病研究Ⅰ-病原菌鉴定及其生物学
特性[J].亚热带植物通讯， 1986(1)： 7-11.
[8]阮兴业， 陈建斌， 朱有勇.香荚兰病害研究综述[J].
云南农业大学学报， 1998， 13(1)： 139-144.
[9]刘爱勤， 桑利伟， 谭乐和， 等.海南省香草兰主要病虫
害现状调查[J].热带作物学报， 2011， 32(10)： 1957-
1962.
[10]郭立佳， 彭 军， 杨腊英， 等.大蕉枯萎病病原菌的
分离 、 鉴定和致病性测 定[J].热 带 作 物学 报 ，
2013， 4(1)： 105-110.
[11]刘爱勤.热带特色香料饮料作物主要病虫害防治图谱
[M].北京： 中国农业出版社， 2013： 43-45.
[12]吕伟成， 张绍升.香蕉枯萎病菌 1号和 4号生理小种
rDNA-ITS的比较[J].福建农林大学学报(自然科学
版)， 2009， 38(3)： 231-233.
[13]王文华， 曾会才.香蕉枯萎镰刀菌的核糖体 DNA-ITS
区段序列分析[J].安徽农业科学 ， 2007， 35(27)：
8440-8442.
(上接第38页)
中国南方果树， 2000， 29(3)： 23-25.
[12]陈珍莉， 吴青兰， 车秀芬.海南香蕉主要病害的田间
识别及防治[J].中国热带农业， 2008(4)： 46-47.
[13]吉训聪.香蕉叶斑病的发生及防治[J].植物医生 ，
1999， 12(4)： 24.
[14]巫锡奎， 刘志均， 陈君志， 等.广西香蕉叶斑病病原
菌研究[J].广西农业科学， 1990(4)： 24-27.
[15]林善海， 黄思良， 谭丽萍， 等.广西香蕉真菌性叶斑
病病原菌种群结构分析[J].植物保护 ， 2011， 37
(5)： 181-183.
[16]王璧生， 刘惠怡， 刘朝祯， 等.广东香蕉叶斑病的发
生与鉴定[J].广东农业科学， 1990(3)： 33-36.
[17]王璧生， 罗启浩.广东香蕉的主要病害及其防治[J].
中国南方果树， 1997(3)： 33-36.
[18]谢艺贤， 符悦冠.热带作物种质资源抗病虫性鉴定技
术规程[M].北京： 中国农业出版社， 2009.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
44- -