全 文 ：楔形角叉菜的抗氧化及保护线粒体作用Δ
李兴泰1 , 张淑梅2 , 沈佳莉3 ,王艳颖1＊
(1.大连民族学院生命科学学院 ,辽宁 大连 116600;2.大连自然博物馆 ,辽宁 大连 116001;
3.大连民族学院卫生所 , 辽宁 大连 116600)
摘　要:目的 观察楔形角叉菜水提液及多糖是否具有清除超氧阴离子(O ·-2 )、抗氧化 、保护线粒体作用。方
法 以 Fe2+-L-半胱氨酸(L-Cys)体系体外诱发鼠肝 、脑线粒体及匀浆脂质过氧化并导致线粒体肿胀。以还原
型辅酶 I-吩嗪硫酸甲酯-氮蓝四唑(NADH-PMS- NBT)系统产生 O · —2 ,用分光光度法测定脂质过氧化产物丙
二醛(MDA)含量 、线粒体肿胀度和 O · —2 的清除情况。结果 楔形角叉菜水提液及多糖可明显抑制 MDA 生成
及线粒体肿胀 , 并能明显清除 O · —2 , 且呈剂量效应关系。结论 楔形角叉菜水提液及多糖具有清除超氧阴离
子 、抗氧化及保护线粒体功能 , 多糖为楔形角叉菜抗氧化 、保护线粒体的活性成分。
关键词:楔形角叉菜;线粒体;抗氧化剂;超氧阴离子
中图分类号:R931.711 , R965　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2007)06-0032-04
Antioxidation of Chondrus yendoi and its protective effect on
mitochondria
LI Xing-tai1 ,ZHANG Shu-Mei2 , SHEN Jia-li3 , WANG Yan-y ing1
(1.College of L i f e S cience , Dalian N at ional it ies Universi ty , Dalian 116600 , China;2.
Dalian Museum of N atural H istory ,Dalian 116001 ,China;3.Clinic o f Dal ian Nat ionali-
ties Universi ty , Dalian 116600 ,China)
Abstract:Objective To investig ate if Chondrus yendoi decoction(CYD)and po lysaccharide
(CYP)have the effects of scavenging superox ide anion(O · —2 ), antioxidation , protecting mi-
to chondria f rom damage.Methods Lipid pero xidat ion and sw elling of mouse liver and brain
mitochondria were induced by Fe
2+-L-Cys sy stem in vi tro.Superox ide anion w as generated
by reduced nico tinamide adenine dinucleotide (NADH )-N-methylphenazonium methy l sul-
fate (PM S)-4-nit robluetet razolium chlo ride(NBT)sy stem .Lipid pe ro xide malondialdehyde
(MDA),mitochondrial sw elling and superoxide anion fo rmation w ere de termined by spect ro-
photometry.Results CYD and CYP could inhibit MDA production , pro tect m ito chondria
f rom sw elling , and scavenge O · -2 obviously in a dose-dependent manner.Conclusion CYD
and CYP had the ef fects o f scavenging O
·-
2 , antio xidat ion , pro tect ing mito chondria f rom in-
jury.CYP was the majo r bio active component.
Key words:Chondrus yendoi;mitochondria;antioxidant;superoxide anion
　　楔形角叉菜(Chondrus yendoi Yamada
e t Mikami)是栾日孝等于 1998 年报道的我
国海洋新记录种[ 1] ,属于红藻门 、红藻纲 、杉
藻目 、杉藻科 、角叉菜属植物。但对其生物活
性的研究尚未见报道 ,鉴于活性氧对 DNA 、
蛋白质 、脂质的氧化修饰在衰老及心血管疾
病 、神经退行性疾病 、炎症 、癌症等疾病中起
重要作用[ 2] ,本文从清除活性氧自由基 、抗氧
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Chin J Mar Drugs , 2007 December , Vol.26 No.6 中国海洋药物杂志 2007 年 12 月第 26 卷第 6 期
＊ Δ基金项目:辽宁省教委高等学校科学研究基金资助项目(No.994421792)
　　作者简介:李兴泰 ,男 ,博士 ,副教授　Tel:13555928183;E-m ail:xt li@dlnu.edu.cn
化 、保护线粒体等方面研究其生物活性 ,为其
进一步开发提供依据 。
1　材料与方法
1.1　动物与材料
昆明种雄性小鼠(20 ～ 24 g , 4周龄), 由
大连大学医学实验动物中心提供(实验动物
质量合格证号:2002-5)。考马斯亮蓝 G-250
与吩嗪硫酸甲酯(PMS)为 Fluka 产品;牛血
清白蛋白 、还原型辅酶 Ⅰ(NADH)与氮蓝四
唑(NBT)(Boehringer M annheim 公司);硫
代巴比妥酸(TBA)、1 , 1 , 3 , 3-四乙氧基丙烷
(TEP)(Sigma 公司);HEPES(Merck 公
司);T ris(GiBco 公司);其它试剂均为国产
分析纯。楔形角叉菜 ,采自大连小平岛 ,由大
连自然博物馆张淑梅研究员提供并鉴定 。
1.2　楔形角叉菜水提液(Chondrus yendio
decoction ,CYD)的制备
取干燥楔形角叉菜 ,粉碎 ,过 20目筛 ,精
密称取 20 g ,水煎煮 2次 ,合并煎液 ,减压浓
缩至 100 mL(浓度为 0.2 g 生药 · mL -1),
于 4℃冰箱中保存备用 。
1.3 　楔形角叉菜多糖(Chondrus yendio
po ly saccharide , CYP)的制备
称取楔形角叉菜 10 g ,粉碎 ,水煎煮 2
次 ,合并煎液 , 减压浓缩至 60 mL 。加入
95%乙醇使含醇量达到 80%。4 ℃冰箱中静
置 24h 。5000 r ·min-1离心 10 min ,沉淀用
120 mL 去离子水溶解 ,并适当加热 ,加活性
炭粉末 0.24 g 使含碳量达到 0.2%,并加热
煮沸 5 min;将脱色后的溶液 10 , 000 r ·
min
-1离心 10 min ,上清液加 95%乙醇 ,使含
醇量达 80%, 4℃冰箱中静置 24 h 。10 , 000
r ·min-1离心 10 min ,将沉淀干燥 ,蒽酮法
测得多糖含量为68%,使用时配制成1 mg ·
mL
-1 ,备用。
1.4　鼠肝匀浆的制备
将小鼠脱臼处死后 ,立即取出肝脏 ,用预
冷的生理盐水在电动玻璃匀浆机上制成
10%匀浆 ,于冰浴中保存备用 。
1.5　鼠肝 、脑线粒体的制备
差速离心法分离线粒体[ 3]小鼠脱臼处死
后 ,立即取出肝脏 、脑 ,于预冷的生理盐水中
洗去血迹 ,分别放入预冷的含有线粒体分离
介质(含 0.25 mol · L-1蔗糖 , 0.5 mmol ·
L-1 EDTA , 3 mmol · L-1 HEPES , pH 7.4)
的匀浆器中匀浆 , 1 , 000 ×g , 4℃离心 10
min ,取上清液于 12 , 000 ×g , 4℃离心 10
min ,沉淀用分离介质洗涤 2 次 ,每次于 12 ,
000×g , 4℃离心 10 min ,沉淀即为线粒体 ,
悬于一定量分离介质中 , 冰浴中保存备用 。
以牛血清白蛋白为标准 , Bradfo rd法测定线
粒体蛋白质含量[ 4] 。
1.6　脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的测定
用 TBA 显色法测定[ 5] 不同浓度的
CYD 和 CYP (模型组中无药物)与 0.20 mL
10%组织匀浆液或 0.5 mg 线粒体蛋白预先
在 37℃温育 5 min ,然后加入 50 μmo l·L-1
FeSO4(正常组不加 FeSO 4)和 0.2 mmo l·
L-1的 L-Cys ,用 pH 7.4 、0.1 mol·L-1的磷
酸盐缓冲液(PBS)补充体积至 1 mL(空白参
比管不加组织匀浆 、线粒体和药物), 37℃温
育 30 min后 ,加入20%三氯乙酸(TCA)0.5
mL 终止反应 ,9000×g 离心 10 min ,取1 mL
上清 , 加入 1 mL 0.67%硫代巴比妥酸
(TBA), 100℃煮沸 10 m in ,以空白参比管调
零 ,于 532 nm 处测吸光度 A , 以 TEP 为外
标 , 经线性回归分析计算 MDA 含量 。药物
的作用以 MDA 的抑制率(IR%)表示 。
IR%=(MDA模型-MDA样品)/(MDA模型
-MDA正常)×100%
1.7　线粒体肿胀测定
反应系统含 0.5 mg 线粒体蛋白 , 0.5
mmo l·L-1FeSO 4(正常组不加 FeSO4),0.2
mmo l·L-1的 L-Cys和不同浓度的药物(模
型组中无药物),以 pH 7.4 、0.1 mol·L-1的
PBS 为缓冲体系 , 反应液终体积为 2 mL ,
37 ℃温育 0 ～ 15 min ,在 520 nm 处测定 0 ,
5 ,10 ,15 min每管的吸光度[ 6] 。
1.8　超氧阴离子(O · -2 )的测定
以 NADH-PMS-NBT 为 O· -2 生成系
统 ,以 NBT 还原法测定 O · -2 的生成情况[ 7]
16 mmo l·L-1的 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)
中含 NADH 73μmol·L -1 ,NBT 50 μmol·
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中国海洋药物杂志 2007 年 12 月第 26 卷第 6 期 Chin J Mar Drugs , 2007 December , Vol.26 No.6
L
-1 , PMS 15 μmol · L-1 , 空白管不加
PM S , 对照组不加药物 ,总体积为 3 mL ,以
空白管调零 ,于 560 nm 处测定吸光度 ,并计
算抑制率 。
1.9　统计学处理
数据以 x ±s表示 ,采用配对 t检验进行
统计学分析。
2　结果
2.1　对 Fe2+-L-半胱氨酸诱发的小鼠肝 、脑
线粒体及肝匀浆脂质过氧化的影响
楔形角叉菜水提液和多糖对 Fe2+-L-半
胱氨酸诱发的小鼠肝 、脑线粒体 、肝匀浆脂质
过氧化产物丙二醛(MDA)的生成均有明显
的抑制作用 ,且呈剂量-效应关系(表 1 ～ 3)。
表 1　CYD对鼠肝 、脑线粒体丙二醛生成的影响(n=5 , x±s)
Tab 1　Effec t o f CYD on fo rmations o f MDA in mouse liv er and brain mitochondria(n=5 , x±s)
组　别 浓度(g· L -1)
MDA(肝)
nmol·(mg· p rot)-1 IR%
MDA(脑)
nmol·(m g· prot)-1 IR%
正常组 - 4.36±0.82＊＊ 3.35±0.93＊＊
模型组 - 6.21±0.44 5.92±0.86
样品组 1 6.06±0.39 8.11 5.77±0.64 5.84
2 5.63±0.35＊ 31.35 5.43±0.38 19.07
4 5.08±0.45＊＊ 61.08 4.81±0.29＊ 43.19
8 4.86±0.58＊＊ 72.97 4.15±0.46＊＊ 68.87
16 4.51±0.72＊＊ 91.89 3.58±0.75＊＊ 91.05
注:与模型组比较:＊P <0.05 , ＊＊P <0.01
表 2　CYP对鼠肝 、脑线粒体丙二醛生成的影响(n=5 , x±s)
Tab 2　Effect of CYP on fo rmations of M DA in mouse live r and brain mito chondria(n=5 , x±s)
组　别 浓度(mg· L -1)
MDA(肝)
nmol·(mg· p rot)-1 IR%
MDA(脑)
nmol·(m g· prot)-1 IR%
正常组 - 4.15±0.95＊＊ 2.85±1.20＊＊
模型组 - 6.36±0.56 5.95±0.71
样品组 5 6.07±0.38 13.12 5.76±0.75 6.13
10 5.52±0.27＊ 38.01 5.05±0.39＊ 29.03
20 5.18±0.49＊＊ 53.39 4.54±0.52＊＊ 45.48
40 4.87±0.64＊＊ 67.42 4.21±0.57＊＊ 56.13
80 4.38±0.86＊＊ 89.59 3.63±0.85＊＊ 74.84
注:与模型组比较:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
表 3　CYD 和 CYP 对鼠肝匀浆丙二醛生成的影响(n=5 , x±s)
Tab 3　Effect o f C YD and CYP on fo rmations of M DA in mouse live r homogena te(n=5 , x±s)
组　别 CYD浓度(g· L -1)
MDA(CYD)
nmol·(g·肝)-1 IR%
CYP 浓度
(mg· L -1)
M DA(CYP)
nmol·(g·肝)-1 IR%
正常组 - 105±22＊＊ - 113±32＊＊
模型组 - 164±21 - 185±20
样品组 1 156±18 13.56 5 145±27＊ 55.56
2 148±11 27.12 10 133±18＊＊ 72.22
4 135±13＊ 49.15 20 124±24＊＊ 84.72
8 122±17＊＊ 71.19 40 120±27＊＊ 90.28
16 115±23＊＊ 83.05 80 116±31＊＊ 95.83
注:与模型组比较:＊P <0.05 , ＊＊P<0.01
2.2　楔形角叉菜水提液和多糖对鼠肝线粒
体肿胀的影响
Fe2+-L-半胱氨酸可导致线粒体肿胀 ,
520nm处浊度下降且随时间的延长肿胀程度
加剧。楔形角叉菜水提液(4 g 生药·L-1)和
多糖(10 mg ·L-1)可显著抑制 Fe2+-L-半胱
氨酸引起的线粒体肿胀 ,作用明显(表 4)。
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Chin J Mar Drugs , 2007 December , Vol.26 No.6 中国海洋药物杂志 2007 年 12 月第 26 卷第 6 期
表 4　CYD 和 CYP 对鼠肝线粒体肿胀的影响(n=5 , x±s)
Tab 4　Effect of CYD and CYP on swelling of mouse liver mitochondria induced by Fe2+-L-Cys(n=5 , x±s)
组　别 正常组 模型组 CYD(4 g· L -1) CYP (10 m g· L -1)
0 min 0.606±0.114＊ 0.458±0.052 0.461±0.046 0.528±0.029＊
5 min 0.542±0.075＊＊ 0.395±0.037 0.452±0.035＊ 0.504±0.036＊＊
10 min 0.463±0.062＊＊ 0.339±0.040 0.421±0.043＊ 0.425±0.048＊
15 min 0.407±0.038＊＊ 0.301±0.036 0.404±0.033＊＊ 0.386±0.029＊＊
注:与模型组比较:＊P <0.05 , ＊＊P<0.01
2.3　楔形角叉菜水提液和多糖对超氧阴离
子(O · —2 )生成的影响
与对照相比较 ,加入楔形角叉菜水提液
和多糖的样品组吸光值明显降低 ,说明其具
有清除 O· —2 的作用 ,并呈剂量依赖性(表 5)。
表 5　C YD和 CYP对超氧阴离子(O · —2 )
的清除作用(n=5 , x±s)
Tab 5　Scaveng ing effect of C YD and CYP on
supe rox ide anion produced by NADH-PM S-NBT
sy stem (n=5 , x±s)
组别 浓度 A 560nm I R%
对照组 - 0.266±0.065
CYD(g· L -1) 0.33 0.174±0.056＊ 34.59
0.67 0.143±0.045＊＊ 46.24
1.33 0.108±0.062＊＊ 59.40
2.67 0.092±0.049＊＊ 65.41
5.33 0.078±0.055＊＊ 70.68
CYP(m g· L-1) 1.67 0.242±0.035 9.02
3.33 0.220±0.026 17.29
6.67 0.190±0.028＊ 28.57
13.3 0.136±0.042＊＊ 48.87
26.7 0.086±0.050＊＊ 67.67
注:与对照组比较:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
3　讨 论
线粒体是真核细胞内产生生物能源物质-
ATP 的细胞器 ,是自由基生成的最主要部位 ,
也是自由基损伤的最敏感靶部位。线粒体产
生的氧化剂及由此导致的氧化损伤随年龄增
长而积累 ,线粒体的电子传递系统约消耗细胞
所利用氧的 90%,其中约 2%在线粒体内变为
氧自由基[ 8] ,氧自由基是导致脂质过氧化的最
主要因素 ,尤其是活性氧可引发脂质过氧化 ,
导致线粒体氧化损伤。脂质过氧化可导致膜
通透性增加并引发线粒体肿胀。目前国外一
些学者称线粒体为“衰老的生物钟”。
本实验以 Fe2+-L-Cys体系体外诱发鼠
肝 、脑线粒体及肝 、脑匀浆脂质过氧化产生丙
二醛并使线粒体发生肿胀 ,观察楔形角叉菜
水提液及多糖的抑制作用 ,结果表明 ,水提液
和多糖均能明显抑制丙二醛生成 ,并在一定
浓度内呈剂量效应关系 ,说明楔形角叉菜能
很好地抑制脂质过氧化。楔形角叉菜水提液
和多糖亦具有明显的抑制线粒体肿胀作用 ,
且随时间的延长 ,抑制作用增强。
通过呼吸链电子漏途径 ,线粒体产生大
量的超氧阴离子(O ·-2 ),O ·-2 是氧的单电子还
原产物 ,在电子经呼吸链传递给末端氧化酶
之前漏出呼吸链与氧反应生成 O 2·-的过程
是线粒体生成有害活性氧的源头[ 9] , 因为
O·-2 可进一步经链式反应被电子还原产生氧
化性更强的 H 2O2和羟自由基(·OH)。本
实验以 NADH-PMS-NBT 系统产生 O ·-2 ,观
察到楔形角叉菜水提液和多糖在一定浓度范
围内均能明显地清除 O ·-2 ,说明楔形角叉菜
可阻止自由基损伤的链式反应 ,本实验表明 ,
楔形角叉菜具有清除超氧阴离子 、抗氧化及
保护线粒体功能 ,多糖为其主要活性成分。
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