全 文 ：微 生 物 学 通 报 1 , 9 1 年
1 9 , ,
o
.
。 `抗菌素生物理化特性 》 拍写组泊 : 抗菌素生物理化特性 (第二分册 )
, 第 3 8 , 3 , l , 3 6` ,呜3 2 , 6 0 7 , 6 2 ,
民卫生出版社 , 北京 , l , 81 。
页 , 人
.”,`O
经柞蚕蛹连续继代的柞蚕核型多角体病毒酶解图谱分析
杨明辉 熊克娟 孙富林
(中国微生物菌种保藏管理委员会普通病毒中心 ,武汉 )
谢 兼 泉 周 怀 民
(河南省云阳蚕业试脸场 , 河南云阳 )
摘耍 本研究对五株不同地域分离的柞蚕核型多角体病毒 ( 人 p N P v ) 在柞蚕蛹体内继代后的产
物进行 ` 。 IR 和 “ u 酶解图谱比较分析 。 观察到经柞蚕蛹继代一次的五株病毒的 丘 。 IR 酶解图谱均
相同 ;而 s’ lI 酶解图谱各有明显不同之处 。 其中二株病毒〔A p N P v 一 3 和 人 p N P v ~ , )经柞蚕蛹继代 1
次与连续继代 2` 次后的酶解图谱分析中 ,观察到 ,各样品的 cE o RI 酶解图谱仍相同 ,第 I 次与第 2 ` 次
的 A p N P v 一 , 的 s’ l 酶解图谱也无明显差异 。 但第 1次与第 26 次的 A p N Pv 一 3的 as l 酶解图谱却
有明显差异。 结果提示 : 人 p N P v D N 人 的 5 . 1 酶切位点较 cE o IR 酶切位点易产生变异 。 本文认为
E` o皿 1 与 s一 11 比较 , E c o R I 较适用于检侧其他 N p v 对 ^ p N p v 的污染 ,而 5 . 11 则较适用于 ^ p N p v
株间的差异检测。
关妞词 柞蚕核型多角体病毒 ;限制性核酸内切酶 ;病毒保藏
从 昆虫体内直接分离获得的核型多角体病
毒常含有多种自然突变的病毒颗粒田 。 改变病
毒继代的细胞环境 , 则与之相适应的自然突变
颐粒迅速复制 ,最终在继代产物中占优势 ,致使
原病毒种的某些遗传特性完全消失切。 又由于
幼虫体内可能存在潜伏型病毒感染国 。 采用替
代寄主用于病毒继代增殖 , 可能有失去原毒种
的危险阅。 对于病毒种保藏而言 , 病毒在继代
中保持种的遗传稳定性是病毒种保藏的理论基
础。 维持病毒种的性状 , 特别是为人们所需的
性状保持稳定是病毒种保藏的重要质 t 标准 。
建立适当的监侧手段检出病毒继代 产物 的 变
异 , 是摘好病毒种保藏的技术前提 。 但是 , 目前
克隆纯化技术和细胞培养或无毒幼虫饲养的条
件都未在国内普及 。 直接使用幼虫体内分离获
得的病毒种 , 通过感染幼虫进行病毒增殖 , 从
而得到研究所需的病毒材料仍是生产 、 科研及
病毒种保藏所常用的方法。 因此 , 探讨非克隆
病毒株在良好的继代条件下病毒基因组的稳定
性 ,导求适当的检测方法发现基因组的变异 , 对
病毒种的保藏 , 对病毒制剂的生产 , 病毒的开发
和利用均是极有意义的。
本文以 E co RI 和 sa l 酶解五个不同地域
分离的经柞蚕蛹继代 l 次或继代 26 次的 柞 蚕
核型多角体病毒 (简称 N P v ) 的 D N A , 探讨
E co R I 和 韧 I 酶在 A p N P v 继代产物 的质
量监洲中的实用性 。
材 料 与 方 法
(一 ) 材料
1
. 柞蚕核型多角体病毒 : A pN p v 一 3 , 辽宁
蚕业研究所分离于辽宁凤城。 A p N P V 一 , ,山东泰
安市农业科学研究所分离于泰安。 A pNP v 一 7
,
中国微生物菌种保藏管理委员会普通病毒中心
分离于河南鲁 山县 。 A P N PV 一 8 , 河南云阳蚕业
试验场分离于河南云阳县 。 A p N P V 一 9 , 广西南
宁蚕业指导所分离于南宁 。 A p N P v 一 3 ( 26 次 ) ,
照片由中科院武汉病毒所技术室帮助拍摄 , 谨致衷心 的
谢愈。
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 1991. 04. 002
1 9, l 年 1 8 (令) 微 生 物 学 通 报
为 A PN p V一 3的第 2 6次继代产物 。 A PN p v 一 9
( 2 6次 ) ,为 A p N p v 一 9的第 2 6次继代产物 。
2
. 限制性核酸内切酶 ; E co RI 和 S al l 购自
华美生物工程公司 。
3
.
D N A 溶解液 : T E 缓冲液 , p H .S o
4
.
E c o R I 酶解缓冲液 : T r i s 一 H C I 10 0m m o l /
L
,
N : C I 5 o m m o l / L
,
M g C I
: l o m m o l / L
, p H 7
.
5
( 3 7℃ ) 。
5
.
S a l l 酶解缓冲液 : T r i s 一 H C I 6m m o l / L ,
N a C I 12 5m m o l / L
,
gM C 1
2
6m m o l / L
, a 一疏基
乙醉 7m m o l / L , p H S . 0 ( 3 7℃ ) 。
6
. 电泳缓冲液 : T ir s一 H A C 4 0 m m ol / L ,
ED T A 2 0m m o l / L
, p H S
.
3 ( 2 5℃ ) o
(二 ) 方法
以穿刺接种方法感染健康柞蚕种蛹继代和
增殖 A p N p v 。 除 A p N p V一 3 和 A p N p v 一 9经
柞蚕蛹体连续继代 26 次外 , 其他三株 A p N P v
均只经柞蚕蛹体继代增殖 1次 . 收集各 A p N P v
致死的柞蚕蛹 , 按 A p N P V 纯化方法 国提 纯
N P V
。 在显微镜或 电子显微镜下观察 N P V 的
纯度。 从 N p v 一步抽提 D N A 「` , 。 D N A 在
T E 缓冲液内溶解后 , 用紫外光波段扫描和琼
脂糖凝胶电泳方法 , 检查 D N A 的纯度 。 以每
微克 D N A 加 14 单位内切酶 , 3 7℃ 水浴酶解
1小时 。 沈 D N A 在同等条件下作酶解和电泳
操作对照 。
图 l 经连续继代后的 A p N P V 一 3 多角体形态
1
.第 1次继代的多角体
2
.第 2` 次继代的多角体
A
: . 。。 二 ) 2
.
9。 各 D N ^ 样品经 0 . 7另 琼脂糠凝
胶电泳 , 在胶内仅呈现一条 D N A 荧光带 , 泳
动位置与 又D N A 相当 ,但在样品孔仍有 D N A
余留未进胶 。 此情况与严家琪等报道的现象吩
相似 。
(三 ) E e o R I 和 S a l l 曲解图讼
1
.
E co R I 酶解图谱 : 图 之所示不同地城
来源的五株 A p N P v D N A 的 E co RI 酶解图
谱相同 ; 经过柞蚕蛹体连续继代 2 6 次后的 A p
N P V 一 3 ( 2 6 次 )和 A p N P V一 9 ( 2 6 次 )与各第 1
次继代的 A p N P V 一 3 和 A p N p V 一 9 的 E e o R I
酶解图谱仍然保持一致 , 重复三次所得酶解图
谱相同。
结 果
(一 ) A p N P V 的多角体提纯
提纯的各 A p N P v 多角体经显微镜及 电
镜观察 , 样品纯净无杂菌污染 。 各病毒株的多
角体形态无明显不同 。 多角体形态呈大小不一
的三边形 、 四边形和少数不规则形 。 图 l 展示
了 A p N PV 一 3 经继代第 1 次和第 26 次的 多 角
体形态 , 二者无显著形态差异 。
( = ) A p N P V D N A 的抽提
从各 A p N P v 多角体直接抽 提 获 得 的
D N A 样品 , 在紫外光波段的扫描曲线 呈核酸吸
收光谱的特征 。 最大吸收 值 在 2 58 土 I n m 波
长 , 最小吸收值在 23 。一23 1o m 波长 , A , 。 .l
图 2 A p N P v 的 E c o R I 酶解图谱 ( 1% 琼脂枪胶 )
1
.
A PN P V一 5 2
.
A p N PV 一 7 3
.
A P N p V
一启 4 . A P
N P V一 3 5
·
A PN PV 一 3( 2 6次 ) 6 . A p N p v 一 , ( 2 6 次 )
7
。
A P N P V 一 ,
.名0 0 . 微 生 物 受 通 报 l , 9 1 年 1 8 (略)
2
.
as l l 酶切图谱 : 图 3展示了 1外琼脂
糖 胶浓度时 A一N p v 一 3 、 A pN p v 一 9 、 A p N P v -
3 ( 2` 次 )和 A pN P V一 9 ( 2 6 次 ) 的 D N A s a l l酶
解图谱。 很明显 地 看 出 A p N P v 一 3 ( 26 次 )
D N A 的 as l 酶解图谱在原 毒 种 A p N PV 一 3
的 B 、 C 核酸片段之 间增加了一条 D N A 片段
b
。经多次重复仍证明 b带的存在 。而 A p N P v 一 9
( 2 6次 )与 A p N P v 一 9的 S a l l 酶解图谱无明显
不同 。
经柞蚕蛹体继代一次的不同地域来源的五
株 A p N p v D N A 的 as l 酶解图谱也各有不
同 (图 4 ) , 差异表现在图中横线所示 D N A 片
段的有无 。
圈 3 连续继代 2 6 次后的 sa l 酶解图谱
l( % 琼脂箱胶 )
1
。
A p N ? V 一 3 第一次继代物 2 . A p N p V 一 3 第 2 6 次
健代物 (增加 3` 片段 ) 3 · A p N P V 一 , 第一次继代物
心· A p N P v 一 9第 2` 次继代物
口 令 A p N P v 不同地域分离株的 sa l 酶娜图谱
( O
·
7% 琼脂塘胶 )
.
A P N P V 一 3 (缺 A . B . C . E 、 F ) z . A P N PV 一 5 (缺 A 、
F ) 3
·
A PN P V
一
7 (缺 F ) 呼 . A p N PV 一 8 (缺 A 、 C 、
,
.
A p N P v
一
9 (缺 A 、 B 、 D 、 E ) 6 . A p N P v 一 3 +
E e o R I 7
.又D N A + E e o R I
讨 论
对于 A p N P v 的 E co IR 酶解图谱分析指
出 , 无论病毒是来自不同地域或经过柞蚕蛹体
的连续继代 , D N A 的 E co R I 酶解图谱均保持
不变 , 表现出 A p N P v 基因组的遗传稳定性 。
因此 , 以 E e o R I 酶解图谱作为 A p N Pv 种的
一个鉴别指标 , 应用于 A p N P V 的继代产物检
测和宿主范围鉴定中是适宜的 。
在 A p NP v 的 sa l l 酶解图谱分析中看
到 ,不同地域来源的 A p N P V aS U 酶解图谱各
有不同处。 同一病毒 ( A p N P V 一 3) 在良好 的
稳定的条件下连续继代 26 次 , 病毒 D N A 的
sa l l 酶解图谱出现了明显变异 。 改变加酶量
为 10 u 和 20 U ,降低琼脂糖浓度至 。 . 7并 ;及重
新抽提 D N A 进行 sa l l 酶解重复试验 , 均证
实变异的存在 。 可见 A p N P v D N A 上的 s a l l
酶切位点易发生变异 。 另一株病毒 ( A p N P v -
9 ) 也在相同条件下经柞蚕蛹体内连续继代后 ,
病毒 D N A 的 sa l 酶解图谱仍保持与继代初
始时一致 。 说明 A PN PV D N A 上的 S a l l 酶
切位点虽然易产生变异 , 但仍具有相对的稳定
性 。 所以 ,用 sa l l 酶解 A p N P V 株的 D N A ,
分析不同地域来源 的 病 毒 株 的 差 异 , 检 测
A p N P v 继代产物的变异是适宜的 。
鉴于同种病毒的不同地方株可能存在不同
(下转第 2 2 0 页 )
.2 2 0
-微 生 物 学 通 报 1 9 9 1 年 皿. (4 )
产品 (表 4 )o
8
. 黄单胞胶中次氛酸钠残留量及氮含量的
分析 :经对漂白处理的黄单胞胶样品进行次抓
酸钠残留t 的分析测定 (按抓含盆计 ), 其结果
表明 , 抓的残留 t 均在 .0 3外 以下 。 该产品作
为食品添加剂使用 , 抓的残留量低于我国轻工
部所规定的标准咖。
对黄单胞胶氮含 t 的分析结果表明 , 经漂
白处理的黄单胞胶氮含 t 在 1 . 1一 1 . ,关之 间 ,
稍低于原工艺国产黄单胞胶的 氮 含 t ( 1 . 3一
1
.
6外) 的水平 ;不 大于 19 8 6年 F A O /w H O 所
公布的黄单胞胶氮含 t 不高于 1 . ,务的指标【川 。
,
. 漂白处理后的黄单胞胶的增粘性与假塑
性
( l) 增粘性能 : 如图 2所示 , 黄单胞胶的·
溶液粘度随浓度的增大而显著增高 , 这表明黄
单胞胶的漂白处理不会影响黄单胞胶的增粘性
能。
( 2 ) 假塑性能 : 由图 3可以看到 , 黄单胞 .
胶的溶液粘度随剪切速率的增加而明显 降 低 , .
这表明经漂白处理后的黄单胞胶仍具有优良的 ,
假塑性能 , 该性能随黄单胞胶浓度的增加而显
著增强。
、、、`
, 考 文 狱
常.,巴妞拐
溉绝一 ,竺三布三三巧 3()
剪切邀率 ` r l m in )
圈 3 黄单抱胶的粘度与剪切速率的关系
. : 奖国样品 ( 0 . 1% 溶故浓度 ) 一 : 国产漂白样品
(0
.
1% 溶液浓度 ) 又 : 美国样品 (。 . 3% 溶液浓度 )
0 : 国产漂白样品 ( O· 3%溶液浓度 ) △ : 美国样品
(0
.
,% 溶液浓度 ) ` : 国产漂白样品 (。 . ,% 溶液浓度 )
l
。
J e a n e: A : J
.
P o l y , ` r s c i S y份 P o ` i“ 仍 . 45 : 2 0 9一 2 2 7 ,
19 74
。
2
。
U
.
5
.
P a t e n t : 3 9 6 6` 18 , 1 9 7 6 .
3
。
G
.
B
.
P a t e n t : 2 0 6 ,` 89 A . 1 9 8 1 .
略 .梁凤来等 : 精细石油化工 , :S ” 一 3 , , l , 8, 。
5
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U
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P a t e n t: 3 5 1 6 9 8 3
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S t e r M P
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1 1
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F A O : S P e e i f i c a t i o n f o r I d e n t i t y a n d P u r i r萝 o f C e r -
t a i n F o o d A d d i t i , e s
.
3 0 t h S e * s i o n o f 比 e J o i n t
F AO lw H O E
x p e r t c o m m i t t e e o n F o o d A d d i t i v e s
卜
R o m e
, 1 , 8` .
(上接第 2 0 0 页 )
的遗传特性。 例如毒力的强弱 、 混合感染时的
增效或干涉作用等等 , 常被人们选择性地进行
利用 , 因此收集保藏病毒的不同地域分离株是
有意义的 。 A p N P V 的不同地域分离株 , 各具
哪些可用的独特性状 , 尚待研究 。 因此 , 以本研
究提出的以 E co IR 和 s al l 酶解图谱作为 A p
N P V 继代产物的一种检测指标是有实际 意 义
的 。
, 考 文 献
l
。
B r o w n 5 E e t a l
.
: J
.
G君 ”
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V` r o l二 6 : 2 4 3 1一 2碍峪 1 . 1, 8了,
2
.
H i t o . h i W
a t a n a b e e r a l
.
: J
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1. , 亡 r t o b r
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P o t人0 1二 乃 :
1 1一 1 7 , 1 9 7 , .
3
.
K i o l e , N e t a l
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: J
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1. 少 , r : e b r . P a t h o l . , 1 7 : 1 99一 2 0 2 .
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4
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