全 文 ：文章编号:1004 － 2490(2014)02 － 0102 － 05
我国南黄海海域漂浮铜藻的分子生物学鉴定
收稿日期:2014 － 01 － 23
基金项目:国家海洋局海洋公益性科研专项(201205010) ;科技部国家科技支撑计划(2012BAC07B03)
作者简介:蔡永超(1988 －) ，男，硕士研究生，研究方向为海洋环境藻类生物学研究。
E-mail:caiyongchao2007@ 126． com
通讯作者:马家海． E-mail:jhma@ shou． edu． cn;孙 彬． E-mail:bsun@ shou． edu． cn
蔡永超，孙 彬，马家海，何培民，张 勤
(上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)
摘 要:为探究南黄海海域漂浮马尾藻属(Sargassum)的种类，以 2013 年 5 月采自南黄海海域漂浮马尾藻属
藻类为研究对象。采用 PCＲ技术扩增出其 ITS2 序列，并用 Clustal X和 Mega 4． 0 软件对其进行序列分析和 N
－ J系统发育树的构建。结果表明，南黄海海域漂浮的马尾藻属藻类为铜藻(Sargassum horneri ) ，其 ITS2 序
列大小为 700 bp左右。
关键词:南黄海海域;马尾藻属;ITS2 序列;铜藻
中图分类号:Q 949． 28 文献标识码:A
2007 年至今，我国南黄海海域连续 7 年暴发
了大规模的“绿潮”灾害，对当地的生态平衡和经
济生产造成巨大危害。国内外科学研究者对“绿
潮”藻做了大量的科学研究，并取得了初步的成
果［1 － 8］。从 2010 年至今，我国南黄海海域每年在
“绿潮”暴发期间，都有一定的马尾藻漂浮在海面
上，并已经引起相关海洋部门的关注与重视。从
形态构造上，可以初步鉴定为铜藻(Sargassum
horneri )。
铜藻隶属于褐藻门(Phaeophyta)墨角藻目
(Fucales)马尾藻科 (Sargassaceae)马尾藻属
(Sargassum) ，生长在低潮带深沼中或大干潮线下
4 m处的岩石上，广泛分布于浙江省中街山列岛
和嵊泗群岛［9］。目前，国内外对于铜藻的研究主
要集 中 在 资 源 调 查［9］、形 态 学［9 － 11］、生 活
史［12 － 15］、生态学［12，16］、人工增养殖［10–11，17］和繁
殖生物学［10，17–19］等方面。蔡一凡等［20］对我国浙
江沿海的铜藻进行了群体遗传多样性的分析。
但是，目前尚未见关于南黄海海域漂浮铜藻的报
道。
本研究以采自江苏海区的漂浮铜藻为材料，
基于 ITS2 序列对其进行了分子生物学的鉴定，以
期为南黄海海域漂浮铜藻后续的研究提供一些
基础性资料。
1 材料和方法
1． 1 材料采集与处理
样品采自 2013 年 5 月漂浮在江苏海域
(32°33． 111N，121°26． 058E)的铜藻(编号 JS，
图 1、图 2) ，野外采集的藻体，就地清洗后放在装
有冰袋的保温箱中冷藏保存，并于 24 h 内带回实
验室，用灭菌 ddH2O 洗去表面附着物和盐离子，
然后阴干保存于 － 20 ℃。
图 1 漂浮在南黄海海面上的铜藻
Fig． 1 Floating Sargassum horneri
on the southern Yellow Sea
DOI:10.13233/j.cnki.mar.fish.2014.02.001
第 2 期 蔡永超等:我国南黄海海域漂浮铜藻的分子生物学鉴定
图 2 漂浮在南黄海海面上的铜藻
Fig． 2 Floating Sargassum horneri
on the southern Yellow Sea
1． 2 基因组 DNA制备
DNA制备方法参照 DOYLE 等［21］，并有所改
动:(1)称取 0． 1 g干燥藻体，液氮研磨成粉末，转
移到离心管中;(2)加入 750 μL 3 % CTAB 提取
缓冲液，1． 5 μL β －巯基乙醇，65 ℃温浴 1 h(每
10 min摇匀 1 次) ;(3)加入 250 μL体积 5 mol·
L －1 KAc，充分混匀，0 ℃静置 15 min 后，12 000 r
·min －1离心 15 min，取上清液; (4)加入 600 μL
氯仿:异戊醇(24∶ 1) ，摇匀后，12 000 r·min －1离
心 15 min。将上清液转移至新管［重复步骤(4)
2 ～ 3 次］;(5)加入 600 μL异丙醇，摇匀置于 － 20
℃ 1 h，将 DNA沉降下来;(6)用 70%乙醇洗涤 1
～ 2 次后，在无菌风下吹干，溶于 1 × TE溶液中。
1． 3 目标序列 ITS2 的获取
ITS － 2 序列的扩增参考 YOSHIDA 等［22］。
引物由上海迈普生物技术有限公司合成。引物
序列为:
EPITS-2F 5-CGATGAAGAACGCAGCGAAAT
GCGAT-3
EPITS-2Ｒ 5-TCCTCCGCTTAGTATATGCTTA
A-3
采用 50 μL反应体系:DNA模板 2 μL，25 μL PCＲ
Master，引物 EPITS-2F和 EPITS-2Ｒ各 5 μL以及
13 μL 的 ddH2O。PCＲ 反应条件:93 ℃变性 1
min，94 ℃变性 30s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45
s，35 个循环。PCＲ产物经 1%琼脂糖凝胶电泳和
溴化乙锭染色后，通过紫外光检测。扩增产物的
纯化及测序由上海迈普生物技术有限公司完成。
1． 4 数据分析
采 用 BIOEDIT［23］ 和 CLUSTALX (Ver
1． 83)［24］分别对样品 ITS-2 序列进行编辑和对
齐。同源性通过 NCBI 进行 BLAST 检测，获取序
列均来自 GenBank，系统发育树构建采用邻接法，
采用 Kimura 双参数模型，使用软件为 MEGA
4． 1，参考 TAMUＲA等［25］，自举检验值 1 000 次检
验节点置信度。
2 结果
2． 1 形态学观察
本研究观察了实验样品所具有的形态特征，
见图 3。藻体黄褐色，较为纤弱，上生圆柱形的主
干，主干为单生(图 3a)。叶基部的边缘常向中肋
处深裂，向上至叶尖则逐渐浅裂，叶尖微钝(图
3b)。气囊圆柱状，两端尖细，顶端冠一小裂叶，
基部细，柄短，气囊在分枝上常排列成总状(图
3c)。
图 3 铜藻的外形图
Fig． 3 Morphological characters
of Sargassum horneri
2． 2 ITS2 区序列分析
PCＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，ITS2
序列大小为 700 bp 左右(图 4)。PCＲ 产物直接
送至上海迈普生物技术有限公司进行纯化、测序
(图 5)。直接测序的序列片断在测序过程并未出
现双峰，说明电泳图谱中的条带为单一条带，产
物准度较高。
图 4 铜藻基因组 DNA的 ITS2 序列电泳图谱
Fig． 4 Electrophoretic photograph of ITS2
sequences of Sargassum horneri
301
海 洋 渔 业 2014 年
图 5 铜藻基因组 DNA的 ITS2 序列分布
Fig． 5 Alignment of ITS2 sequence of Sargassum horneri
图 6 基于 ITS2 序列构建的系统发育树(羊栖菜作为外类群)
Fig． 6 N-J phylogenetic tree based on ITS2 sequences (Sargassum fuisforme as an outgroup)
2． 3 构建系统发育树
依据测序结果构建的 N-J 进化树如图 6 所
示。样品 JS 和 S． horneri 聚类为一谱系支，作为
外类群的羊栖菜 S． fusiforme 为另一谱系支。因
此，南黄海海域漂浮的褐藻为马尾藻属的铜藻。
3 讨论
ITS(internal transcribed spacer)指 18 ～ 5． 8 S
核糖体 ＲNA 基因之间的 ITS1，5． 8 S 以及 5． 8 S
与 28 S核糖体 ＲNA基因之间的 ITS2 总和，具有
高度变异性，可作为鉴定种间甚至物种水平良好
的分子遗传标记，已被广泛用于研究属内种间以
及不同地理株间的分子系统演化及物种鉴定［26］。
但是，PHILLIPS 等［27］不建议使用 ITS 序列来研
究马尾藻属的系统发育，因为马尾藻属种类的
ITS序列有很大的区别。通过缩减 ITS 序列的片
段，使用 ITS2 序列可以克服因为 ITS 序列长而带
来的差异性。STIGEＲ 等［28］也认为 ITS2 序列是
对马尾藻属的种类进行区分的一种有效分子标
记。
本研究中，南黄海海域漂浮的马尾藻属藻体
经 ITS2 序列分析和 N-J系统发育树构建后显示，
南黄海海域漂浮的藻类为马尾藻属的铜藻。但
是，根据曾呈奎等记载“铜藻大多生长在低潮带
深沼中或大干潮线下 4 m 处的岩石上，是北太平
洋西部特有的暖温带性海藻［9］。我国北起辽宁、
山东，南到浙江、福建、广东都有分布［29 － 30］”。所
以，近 2 ～ 3 年来，我国南黄海海域为什么会出现
一定量的漂浮铜藻及其溯源研究等问题还有待
于进一步的深入研究。
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Molecular identification of floating Sargassum
horneri in the southern Yellow Sea
CAI Yong-chao，SUN Bin，MA Jia-hai，HE Pei-min，ZHNAG Qin
(College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)
Abstract:Massive green tides have occurred every year in the southern Yellow Sea since 2007． However，the
cause and origin of massive green tides have not yet obtained a convincing conclusion． In 2010，we found that
a large number of floating Sargassum emerged along with the outbreak of massive green tides in the southern
Yellow Sea，which twined with green tide algae and drifted from south to north． To identify the species of
floating Sargassum，floating algae was collected along the southern Yellow Sea in May，2013． Identification
was conducted by combing morphological observation and molecular biological methods． ITS2 sequence was
amplified by PCＲ and analyzed by Clustal X and Mega 4． 0，and the N-J phylogenetic tree was constructed．
Ｒesults showed that floating Sargassum in the southern Yellow Sea was Sargassum horneri，with a size of ITS2
sequence about 700bp． This study may provide some data for the consequent researches on floating Sargassum
in the southern Yellow Sea．
Key words:southern Yellow Sea;Sargassum;ITS2 sequence;Sargassum horneri
601