全 文 ：第 29卷　第 1期
2009年　1月
河北大学学报(自然科学版)
Journal of Hebei Univer sity (N atural Science Edi tion)
Vol.29 No.1
Jan.2009
木豆叶水提物对兔破骨细胞样细胞的
形成及其骨吸收功能的影响
张金超1 , 2 ,王立伟1 , 2 ,孙　静3 , 王书香1 , 2 ,申世刚1 , 2 ,陈　航4 ,王　鹏5
(1.河北大学 化学与环境科学学院 , 化学生物学实验室 , 河北 保定　071002;
2.教育部药物化学与分子诊断重点实验室 , 河北 保定　071002;3.河北大学附属医院 B超室 , 河北 保定　071000;
4.河北大学附属医院 肾内科 , 河北 保定　071000;5.河北大学附属医院 口腔科 , 河北 保定　071000;)
　　摘　要:通过对骨髓单核细胞诱导分化形成的抗酒石酸酸性磷酸酯酶(TRAP)阳性多核巨细胞计数 ,
研究了木豆叶水提物对 1 ,25-二羟基维生素 D3 诱导兔骨髓单核细胞分化形成破骨细胞样细胞的影响.通过
破骨细胞样细胞与骨片共培养的方法 ,用显微摄影结合计算机图像分析测定骨吸收造成的陷窝数目及表面
积 ,研究了其对破骨细胞样细胞骨吸收功能的影响.结果表明 , 在 0.01 ～ 100 mg/L 质量浓度内 , 木豆叶水
提物能够剂量依赖性地抑制破骨细胞样细胞的形成(P <0.05),同时也明显抑制破骨细胞样细胞的骨吸收
活性(P<0.05),具体表现在 , 与对照组比较 ,其骨吸收陷窝数目和表面积明显减少 ,但没有呈现出质量浓度
依赖性 , 木豆叶水提物对破骨细胞样细胞骨吸收指数的影响的结果给予了进一步的证实.这提示木豆叶水
提物对骨质疏松症患者可能有一定的疗效.
关键词:木豆叶;破骨细胞样细胞;骨吸收
中图分类号:Q 952.1;O 629.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-1565(2009)01-0045-06
Effects of Water Extract of Cajanus ca jan(L.)Millsp Leaves on
Formation and Bone-resorbing Activity of Osteoclast-like Cells
ZHANG Jin-chao1 , 2 , WANG Li-wei1 , 2 , SUN Jing3 , WANGShu-xiang1 , 2 , SHENShi-gang1 , 2 ,
CHEN Hang4 ,WANGPeng5
(1.Chemical Bio logy Labo rato ry , College of Chemistry and Enviromental Science , Hebei University ,
Baoding 071002 , China;2.Key Laboratory of M edicinal Chemist ry and M olecular
Diagno sis of Ministry of Education , Baoding 071002 , China;
3.B-Ultrasound Room , A ffi liated Hospital of Hebei Unive rsity , Baoding 071000 , China;
4.Department of Nephrolog y , Aff iliated Hospital of Hebei University , Baoding 071000 , China;
5.Department o f Stomatology , Aff iliated Hospital of Hebei Unive rsity , Baoding 071000 , China)
Abstract:The effect o f w ate r ex t ract of Cajanus cajan(L.)M illsp leaves on fo rmation and bone-reso r-
bing activi ty of osteoclast-like cells in rabbit bone marrow mononuclear cel ls induced by 1 , 25-dihydro xyvi-
tamin D3 was evaluated by counting the numbe r o f tart rate resistant-acid phosphatase-po sitive [ TRAP
　
　收稿日期:2008-05-29
　基金项目:教育部科学技术研究重点项目(208018)
　第一作者:张金超(1969-), 男 ,河北武强人 , 河北大学教授 ,主要从事药物化学 、细胞生物无机化学 、老年病的发病机制以
及化学预防的研究.
河北大学学报(自然科学版) 2009 年
(+)] multinucleated cells and measuring the number and surface area of bone reso rption pits w ith pho to-
microg raphy and image analysis.The results indicated that w ater ex t ract of Cajanus cajan(L.)Millsp
leaves inhibi ted the fo rmation of osteoclast-like cel ls in a dose-dependent manner(P<0.05), and also in-
hibi ted bone-reso rbing activi ty o f o steo clast-like cells at the concentration of 0.01 ～ 100 mg/ L , numbers
and surface areas of the resorption pits decreased compared w ith the control g roup(P<0.05).The re sults
were further conf irmed by bone reso rption index of rabbit osteoclast-like cells.These findings suggest that
w ater ex t ract of Cajanus cajan(L.)Millsp leaves may be helpful in preventing the development of o steo-
po ro sis.
Key words:Cajanus cajan(L.)M illsp;osteoclast-like cells;bone reso rption
骨质疏松是一种代谢性骨疾病 ,以骨量低 、骨易碎 、骨组织微环境退化和骨折可能性增加为特点.随着老
龄化社会的到来 ,骨质疏松已成为威胁中老年人健康 、严重影响其生活质量的一个不容忽视的公共健康问
题.目前 ,我国政府已将骨质疏松 、糖尿病和老年痴呆病一起列为三大重点攻关的老年性疾病 ,及早防治骨质
疏松已成为医学界迫在眉睫的任务.
现今预防和治疗骨质疏松的药物主要分为两大类 ,即骨吸收抑制剂和骨形成刺激剂.其中雌激素替代疗
法(ERT)是目前预防和治疗绝经后骨质疏松最主要的方法 ,但是近年来的研究表明 ERT 使绝经后妇女患
乳腺癌 、子宫内膜癌和卵巢癌的危险性增高.另外 ,临床使用最为普遍的治疗骨质疏松的药物大都是由发达
国家研发出来的 ,价格昂贵 ,无法普及使用 ,故寻找其他药物和方法来预防和治疗骨质疏松是当前研究工作
的一个重要方向.
中药用于治疗骨折和骨关节性疾病已经有几千年的历史.目前 ,研究中药治疗骨质疏松的原理 、疗效及
有效成分在我国和日本十分活跃.根据中医理论 ,肾主骨 ,许多补肾中药可用于预防和治疗骨质疏松 ,如淫羊
藿 、蛇床子 、补骨脂 、牛膝 、杜仲等均被证实有很好的抗骨质疏松作用[ 1-3] .从现代科学的角度看 ,这些中药的
作用可能是通过以下几种途径实现的:通过作用于激素系统 ,提高正相骨代谢;促进对食物中钙的吸收;刺激
骨形成 ,抑制骨吸收.尽管临床实验和基础实验研究都表明中药治疗骨质疏松疗效明确 ,然而多数有效中药
的活性成分尚未阐明 ,相关的作用机制研究较少 ,这些问题都使中药用于预防和治疗骨质疏松难以得到国际
的承认.
木豆(Cajanus cajan (L .)Millsp.)系豆科木豆属植物.在我国主要分布于云南 、四川 、江苏 、广东 、广
西和海南等地 , 资源较丰富.民间将木豆叶用于止血 、止痛和杀虫等.近年来 , 用木豆叶治疗外伤和烧伤感
染及褥疮等取得了较好的疗效[ 4] .以木豆叶为君药组成的复方具有补肾健骨 、活血祛瘀 、消炎镇痛及提高免
疫功能等作用;现今由木豆叶水提取物已经研制成治疗股骨头坏死的药物通络生骨胶囊[ 5] ;袁捷等通过整体
动物实验研究发现通络生骨胶囊可以提高血清钙 、磷含量 ,激活成骨细胞活性 ,调节骨的代谢 ,促进骨的生
长[ 6] ,这提示主要组成成分为木豆叶水提取物的通络生骨胶囊可能对骨质疏松症有一定的治疗作用 ,但是 ,
迄今为止 ,木豆叶水提物对在骨质疏松症发病机制中起着重要作用的破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影
响尚没有报道.基于此 , 本文研究了木豆叶水提物对 1 , 25-二羟基维生素D 3诱导骨髓细胞分化形成破骨细
胞样细胞及其骨吸收功能的影响.
1　实验部分
1.1　材料及试剂
新生日本大耳白兔 ,购自河北医科大学实验动物中心.牛股骨 , -70 ℃,低温冰箱保存.
α-MEM 培养基(Gibco);胎牛血清(天津市生化制品厂);Giemsa 染色剂 、苏木素 、伊红和 N-2-羟基哌嗪-
N-2-乙磺酸(HEPES)均购自Sigma;抗酒石酸酸性磷酸酯酶 T RAP 试剂盒为天津市血液研究所生产;木豆
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第 1 期 张金超等:木豆叶水提物对兔破骨细胞样细胞的形成及其骨吸收功能的影响
叶水提物制备方法如下:取一定量的木豆叶 ,加 10倍量的水煎煮 3次 ,每次 1.5 h ,合并煎液 ,过滤 ,滤液浓缩
至相对密度为 1.05 ～ 1.10(60 ℃),喷雾干燥即可.
1.2　主要仪器
二氧化碳培养箱(Heraeus , BB16/BB5060);倒置相差显微镜(OLYMPUS , BH-2);扫描电子显微镜
(JSM-5600LV).
1.3　骨磨片的制备
将新鲜牛股骨用金钢砂片及粗细金钢砂石制备成 6 mm ×6 mm 大小 ,10 μm 厚的骨磨片.超声波清洗
器清洗 ,置入含 1 000 U/mL 青霉素 ,1 g/L 链霉素的 D-Hanks液中浸泡 ,换液 3次 ,每次 20 min[ 7] .
1.4　兔骨髓单核细胞的分离
将新生兔断颈处死 ,无菌条件下取四肢长骨 , 在 D-Hanks平衡盐溶液中剔除附着在骨表面的软组织及
软骨骺 ,然后在 α-MEM 全培养液(含质量分数为 15%的胎牛血清 、青霉素 100 U/mL 、链霉素 100 mg/L 的
2.5×10-2 mol/L HEPES 缓冲溶液)内 ,将骨干纵向剖开 ,轻刮骨髓腔表面至颜色变白 ,用尖吸管吸取培养
液反复冲洗髓腔面 ,去掉骨片 ,在 4 ℃下 ,细胞悬液离心(1 200 r/min)10 min ,弃上清液 ,加入新鲜的培养液
混悬细胞 ,接种在平皿内 ,在体积分数为 5%的CO 2 、37 ℃条件下培养过夜 ,收集未贴壁细胞和用质量分数为
0.05%的胰蛋白酶消化液(含质量分数为 0.02%的 EDTA)消化掉的细胞 , 在 4 ℃下 ,细胞悬液离心
(1 200 r/min)10 min ,弃上清液 ,加入新鲜的培养液混悬细胞待用.
1.5　木豆叶水提物对 1 ,25-二羟基维生素 D3 诱导兔骨髓单核细胞分化形成破骨细胞样细胞及其骨吸收功
能的影响
将上述分离得到的兔骨髓细胞接种在含有骨磨片或盖玻片的 24孔培养板中(每孔细胞 3×106 个),置
二氧化碳孵育箱中过夜 ,加入 1 , 25-二羟基维生素 D3 和木豆叶水提物 ,使 1 , 25-二羟基维生素 D 3 的终浓度
为 1.00×10-8 mol/ L , 木豆叶水提物的终质量浓度分别为 0.01 ,0.1 ,1.0 , 10 和 100 mg/ L ,然后继续培养.
同时用未加木豆叶水提物的实验做对照 , 置于体积分数为 5%的 CO 2 、37 ℃的孵育箱内培养 ,每 3 d换液
1次 ,每次用0.50 mL新鲜培养液(含相同浓度的 1 ,25-二羟基维生素 D3 和木豆叶水提物)换掉同样体积的
旧培养液[ 8] .
1.6　光相差显微镜观察与吸收陷窝的计数
在不同培养时间 ,利用 Olympus倒置光相差显微镜观察培养于盖玻片上破骨细胞样细胞的形成 、形态
及运动情况 ,并于不同时间取出 ,进行 T RAP 染色.观察骨片是否形成吸收陷窝及陷窝的变化;计数每张骨
片上形成的吸收陷窝数;对含有 2个以上细胞核且 T RAP 染色呈阳性的细胞判定为破骨细胞样细胞 ,通过
光镜计数每张玻片上的破骨细胞样细胞数;观察不同浓度的木豆叶水提物对骨髓细胞诱导分化形成破骨样
细胞骨吸收的影响 ,同时摄片供图像分析.
1.7　图像分析系统计算吸收陷窝的表面积
将与破骨细胞样细胞共培养 7 d的骨片摄影(×100),利用 LEICA Q 550IW图像分析系统计算每张底
片上吸收陷窝的表面积.
1.8　扫描电镜观察
培养期(1周)结束时 ,骨片浸于 0.25 mol/L 氨水内超声处理 10 min ,以除去生长在其表面的细胞.体积
分数为 3%的戊二醛和 1%锇酸固定 ,酒精系列脱水 ,二氧化碳临界干燥 ,喷金 ,扫描电镜观察吸收陷窝的形
态改变.
1.9　骨吸收指数的测定
培养结束时 ,收集培养上清液 ,采用原子吸收分光光度计测量其总钙含量 ,计算实验组与对照组钙含量
的平均值的比值 ,作为骨吸收指数 ,其值小于 1.0表示抑制骨吸收.
1.10　数据处理
实验数据至少来自 3次独立实验结果 ,数据表示为:x±SD ;数据分析采用 SPSS t-test , P<0.05有显
著性差异.
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河北大学学报(自然科学版) 2009 年
2　结果
2.1　破骨细胞样细胞的形成及骨吸收功能的形态学观察
在 1.00×10-8 mol/ L 的 1 ,25-二羟基维生素 D3 存在下 ,第 1 天 ,可见骨髓单核细胞贴壁 , TRAP 染色
阴性;第 3天 ,单核细胞聚集 ,细胞间接触紧密 ,细胞突起相互连接 , T RA P 染色偶见阳性多核细胞;第 5天 ,
细胞聚集现象更明显 , TRAP 染色阳性多核细胞增多;第 9天 ,可见 TRAP 染色阳性多核细胞进一步增加 ,
细胞胞浆丰满 ,细胞突起延展 ,细胞核数目不等 ,大部分积聚在核中央.
在 1 ,25-二羟基维生素 D3 诱导下 ,骨髓细胞与骨片共同培养 3 d ,骨片上才出现少量吸收陷窝 ,随着培
养时间的延长 ,吸收陷窝不断增多 ,其形状及变化情况与成熟破骨细胞的骨吸收陷窝相似 , 开始多为单个圆
形或椭圆形 ,随着培养时间的延长 ,吸收陷窝不断地扩大 ,数量也不断地增多 ,连接成贝壳形或不规则形状.
扫描电镜所见 ,骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞样细胞所形成的骨吸收陷窝与相差显微镜所见的骨吸收
陷窝外形一致 ,可见圆形 、椭圆形及不规则形骨吸收陷窝 ,由于脱矿和组织水解酶的作用 ,陷窝与周围正常骨
组织相比明显凹陷 ,边界清晰 ,底部暴露出骨基质中的胶原纤维[ 9] .
2.2　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞形成的影响
由图 1可见 ,木豆叶水提物能够剂量依赖性地抑制破骨细胞样细胞的形成 ,具体表现在随着质量浓度的
增加生成的破骨细胞样细胞数目减少.
2.3　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞形成的骨吸收陷窝数的影响
由图 2可见 ,各质量浓度组的木豆叶水提物均能明显抑制破骨细胞样细胞形成的骨吸收陷窝数 ,但是并
没有呈现出质量浓度依赖性.
n=10 , 与对照组比较 P<0.05
图 1　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞形成的影响
Fig.1　Effect of water extract of Ca janus caj an(L.)
Millsp leaves on the formation of osteoclast- like cells
n=10 , 与对照组比较 P<0.05
图 2　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞形成的骨吸
收陷窝数的影响
Fig.2　Effect of water extract of Ca janus ca jan(L.)
Millsp leaves on the number of bone resorption pits on bone
slices formed by rabbit osteoclast- like cells
2.4　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞形成的骨吸收陷窝表面积的影响
由图 3可见 ,各质量浓度组的木豆叶水提物均能明显减少破骨细胞样细胞性骨吸收陷窝表面积 ,但是并
没有呈现出质量浓度依赖性.
2.5　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞骨吸收指数的影响
由表 1可见 , 各质量浓度组的木豆叶水提物均能明显抑制破骨细胞样细胞的骨吸收功能 ,具体表现在
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第 1 期 张金超等:木豆叶水提物对兔破骨细胞样细胞的形成及其骨吸收功能的影响
其骨吸收指数小于 1 ,但是并没有呈现出质量浓度依赖性 ,这与上面得到的结果也是一致的.
n=10 , 与对照组比较 ＊P<0.05
图 3　木豆叶水提物对破骨细胞样
细胞形成的骨吸收陷窝表面积的影响
Fig.3　Effect of water extract of Caj anus ca jan(L.)Millsp
leaves on the areas of bone resorption pits on bone
slices formed by rabbit osteoclast-like cells
表 1　木豆叶水提物对破骨细胞样细胞
骨吸收指数的影响(n=10)
Tab.1　Ef fect of water extract of Caj anus caj an(L.)Millsp
leaves on bone resorption index of rabbit osteoclast-like cells
ρ(木豆叶水提物)/
(mg· L-1) [ Ca
2+] /(mg· L-1) 骨吸收指数
对照 65.36±5.67
0.01 59.78±3.56＊ 0.91
0.1 62.65±2.46＊ 0.96
1 52.69±4.09＊＊ 0.81
10 49.45±3.23＊＊ 0.76
100 46.78±1.65＊＊＊ 0.72
　　与对照组比＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P<0.001
3　讨论
人体骨骼依赖于骨吸收和骨形成之间的动态平衡调控 ,在人体发育时期成骨细胞(o steoblast , OB)的骨
形成作用超过破骨细胞(osteoclast , OC)的骨吸收功能 ,骨骼发育成长;在进入老年之后(尤其是妇女绝经
期后),破骨细胞的骨吸收功能超过成骨细胞的骨形成作用 ,出现骨质丢失 , 这一平衡的移动导致骨质疏松.
另外过量服用糖皮激素等多种因素引起的骨质疏松 、Pagets 病以及癌症骨转移造成的骨破坏 ,都与破骨细
胞异常活跃的分化增殖和骨吸收功能有关 ,因此 ,调控破骨细胞的分化和功能是治疗上述疾病的关键环节.
由于破骨细胞的分离培养比较困难 ,故此国内外对破骨细胞的研究明显滞后于其他细胞.20世纪 80年
代初 ,Chambers[ 10] 首先从新生兔长骨分离出破骨细胞 ,建立了体外培养成熟破骨细胞的方法.随后相继从
新生兔 、鼠 、鸡胚 、低血钙鸡和胎儿等骨组织中成功地分离培养出破骨细胞 ,从而能够进行破骨细胞的形态 、
运动及功能调节的体外研究.虽然人们对这一方法不断进行改进 ,但到目前为止 ,尚不能获得完全纯化的破
骨细胞.另外 ,由于该方法只能分离得到成熟的破骨细胞 ,无法对破骨细胞的发生 、分化和融合过程进行动
态研究.后来的研究发现在外加成骨细胞的支持下 ,1 , 25-二羟基维生素 D3 可以诱导骨髓单核细胞分化形成
破骨细胞样细胞 ,利用该骨髓长期培养体系 ,可以对亲骨性激素和因子调节破骨细胞发生 、分化 、融合及活化
进行研究 ,但由于其中包含外加的成骨细胞 ,因而不能分辨成骨细胞和破骨细胞的行为[ 11-13] .1998年 , Da-
vid等[ 8] 对上述方法进行了改进 ,在不需要外加成骨细胞的参与下 ,成功地用 1 , 25-二羟基维生素 D 3 诱导兔
骨髓细胞分化形成了破骨细胞样细胞 ,从而有可能观察刺激因子对破骨细胞分化发育的直接作用.
本文采用 David等[ 8] 的方法 ,以破骨细胞样细胞为模型 ,研究了木豆叶水提物对 1 ,25-二羟基维生素 D3
诱导兔骨髓单核细胞分化形成破骨细胞样细胞及其骨吸收功能的影响 , 结果表明 , 质量浓度在0.01 ～
100 mg/L内的木豆叶水提物不仅能抑制破骨细胞样细胞的形成 , 而且还抑制破骨细胞样细胞的骨吸收功
能 , 这进一步提示木豆叶水提物不但可以治疗股骨头缺血性坏死 , 而且对骨质疏松症患者也可能有一定的
疗效.现有的研究结果表明 ,木豆叶含有三萜 、酚酸 、茋类 、异黄酮 、黄酮等化学成分[ 14-16] .近年来许多研究表
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明淫羊藿在骨质疏松的治疗方面显示出一定的潜力 , 因此 , 淫羊藿在治疗骨质疏松的复方中得到广泛应
用 ,但是 , 绝大多数研究都是集中于淫羊藿中的黄酮成分.实验表明 , 淫羊藿粗提物 、总黄酮以及主要黄酮
成分显示一定的促进成骨细胞以及成骨细胞样细胞 UMR-106的增殖活性[ 17] .因此 ,推测木豆叶水提物中的
黄酮可能具有抗骨质疏松作用.今后的研究工作应该对其抗骨质疏松作用的物质基础进行深入研究 ,寻找新
的抗骨质疏松活性化合物和先导化合物 ,为将其开发成为预防和治疗骨质疏松的新型中药打下坚实的基础.
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(责任编辑:赵藏赏)
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