全 文 ：第 29 卷 第 2 期
2010 年 4 月
电 子 显 微 学 报
Journal of Chinese Electron Microscopy Society
Vol-29，No. 2
2010-04
文章编号:1000-6281(2010)02-0163-04
青杄花粉管生长过程中囊泡运输与 Ca2 +
分布的细胞学研究
李玲俐，张凌云 *
(北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083)
摘 要:应用激光扫描共聚焦显微镜技术，研究并同时定位了 Ca2 +及分泌囊泡在青杄花粉管内的空间分布模式与
对应关系。利用钙离子特异性荧光探针 Fluo-3 及分泌囊泡动态变化的指示性染料 FM4-64 对正在生长的花粉管进
行的双重标记显示，青杄花粉管细胞质内 Ca2 +从距顶端 40 ～ 50 μm 处呈现典型梯度分布，花粉管顶端浓度最高;
FM4-64 荧光染料主要分布在花粉管质膜周围及花粉管顶端大约 15 ～ 20 μm 的地方，而亚顶端区荧光较弱;在正在
改变生长方向的花粉管中，FM4-64 荧光主要集中在弯曲部位。对二者及与 Rop GTPases 在花粉管内的空间分布及
与功能的关系进行了讨论。
关键词:花粉管;青杄;钙离子;囊泡分泌
中图分类号:Q942;Q944;Q336 文献标识码:A
收稿日期:2009-10-30;;修订日期:2009-11-19
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 30671659)，教育部“新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET-06-0121).
作者简介:李玲俐(1986 －)，女(汉族)，山东人，硕士 .
* 通讯作者:张凌云(1973 －)，女(汉族)，河北人，副教授 .
花粉管是一种典型的具顶端生长(极性生长)
特性且独立存在的单倍体细胞，其极性生长是由于
高尔基体产生的分泌囊泡携带着合成质膜和细胞壁
的前体物质及有关酶系统，在细胞顶端与质膜融合，
促进新的质膜和壁的合成，导致细胞顶端的延伸而
形成的［1 ～ 3］。其中，组建细胞壁与细胞质的前体物
质源源不断地运往花粉管顶端，以组成和构建其细
胞壁，这是花粉管伸长过程中最重要的事件。近年
来的研究表明，Ca2 +作为一种信号分子，在质膜附近
的浓度能被迅速调节，在分泌囊泡的运输及花粉管
极性生长过程中起着重要的调节作用［4，5］。FM4-64
是一种有效的研究分泌活性的选择性膜表面荧光标
记物，其在花粉管顶端的标记模式与分泌囊泡的分
布在空间上有非常严密的对应关系，常被用来研究
不同植物及不同生理条件下花粉管顶端分泌囊泡的
分布模式［6］。Fluo-3 /AM 是目前检测细胞内 Ca2 +
浓度变化的较好探针，与 Ca2 +结合特异性强灵敏度
高，能够检测细胞内低浓度 Ca2 + 的变化，酯化的
Fluo-3 /AM 能穿膜进入细胞，被胞内酯酶水解成
Fluo-3，是研究胞内 Ca2 + 的主要手段。关于钙离子
在花粉管内动态变化、囊泡运输及二者之间可能存
在的调控作用虽然已有过报道［5，7，8］，但对二者之间
的调控与其在花粉管内的空间分布还不很清楚。本
实验利用分泌囊泡指示性染料 FM4-64 和钙离子特
异性荧光探针 Fluo-3 对生长的花粉管进行双重标
记，并在激光共聚焦扫描显微镜下进行观察，以期对
二者在功能上的调控提供空间分布及细胞学上的依
据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
以青杄(Picea willsonii)花粉为实验材料，青杄
花粉散粉之前采集成熟的小孢子叶球，置于室温下
自然干燥，过夜，待散粉后，收集于无菌干燥小瓶中，
于 － 20 ℃冰箱贮藏备用。
1. 2 试剂
所要主要试剂 FM 4-64 及 Fluo-3 主要购自
SIGMA 公司，其它试剂除有特殊说明，也均购自该
公司。
1. 3 花粉体外培养与萌发
将贮存于 － 20 ℃冰箱的花粉转移至4 ℃复苏
12 h，室温下继续复苏 2 h。复苏后的花粉置于液
体培养基中，在室温(25 ± 1 ℃)萌发。培养基的成
分包括:15% 蔗糖，0. 03% 硝酸钙，5 mmol /L 柠檬
酸-磷酸缓冲液，pH 5. 8。
1. 4 FM4-64 与 Fluo-3 在花粉管内的装载与标记
FM4-64 的装载方法参照 Partonal et al［9］，略有
改动。取培养 72 h 的青杄花粉管溶液 100 μL 放于
EPPENDORF 管内，加入 FM4-64 溶液，用正常培养
基进行稀释，使其最终浓度为 3 μL。孵育 30 min
电子显微学报 J. Chin. Electr. Microsc. Soc. 第 29 卷
后，滴到凹槽载玻片上，继续进行 Fluo-3 荧光探针
的标记。
Fluo-3 AM 装载方法参考 Zhang et al［10］，略有
改动。将标记过 FM4-64 的花粉管用培养基清洗 2
遍，置于含20 μmol /L Fluo-3 /AM 的液体培养基中，
4 ℃下轻微振荡，孵育 2 h，之后有培养基清洗两次，
每次 5 min;将花粉管置于含 0. 2 μmol /L Fluo-3 /AM
的液体培养基中，在 25 ℃ 下继续孵育 1 h，以使
Fluo-3 AM 在胞内进行酶解，充分洗涤后取出细胞
外未结合的 Fluo-3 AM。进行单标记的花粉管直接
置于含 Fluo-3 的液体培养基中进行孵育即可，处理
步骤同上。将处理好的花粉管置于载玻片上，在激
光共聚焦扫描显微镜(ZEISS LSM 510 META)下进
行观察。FM4-64 染料采用 Ar /Kr 激光激发，激发波
长 514 nm，Fluo-3 激光激发波长 488 nm。
2 结果
2. 1 Fluo-3 在青杄花粉管内分布的连续切片扫描
本实验用对 Ca2 +敏感的荧光染料 Fluo-3AM 标
记花粉管，由于 Fluo-3AM 是高度亲脂的，容易进入
细胞，因此低浓度下不会破坏细胞的结构或干扰细
胞的生理过程。由图 1 从不同切面扫描显示，青杄
花粉管细胞质内 Ca2 +从距顶端 40 ～ 50 μm 处呈现
典型梯度分布，花粉管顶端浓度最高。这与 Ca2 +在
被子植物中分布模式一致。
2. 2 FM4-64 和 Fluo-3 在青杄花粉管内的标记模
式
图 2 花粉管分别经 FM4-64 和 Fluo-3 双标记后
在不同激光波长下激发，由图可见，在正常生长的
花粉管内，代表囊泡运输和分布的 FM4-64 标记在
花粉管质膜周围及花粉管顶端大约 15 ～ 20 μm 处，
而亚顶端区荧光较弱(图 b1，c1，f1);在生长方向正
在改变的畸形花粉管顶端，观察到明亮的红色荧光，
显示原来顶端区域已经停止生长(图 e);Ca2 + 则主
要分布在具顶端 15 ～ 20 μm 的地方浓度最高，且与
FM4-64 荧光重合(f，f1，f2)，或在亚顶端区域分布，
而在顶端“透明区域”空缺(图 b2，c2)。
3 讨论
花粉管极性生长过程中的囊泡运输是一个非常
复杂的过程，受到多层次细胞学事件的调控，如顶端
存在 的 游 离 钙 离 子 梯 度、RopGTPases 的 调 控
等［5，11，12］，从而使分泌囊泡的产生、运输与融合的速
率、内含物外排的速率及细胞壁组装等受到精细的
调控。
根据图 1 从不同切面扫描显示，青杄花粉管细
胞质内 Ca2 +从距顶端 40 ～ 50 μm 处呈现典型梯度
分布，花粉管顶端浓度最高。这与 Ca2 +在被子植物
中分布模式一致。在用 FM4-64 探针进行的囊泡运
输标记显示，囊泡运输主要集中在花粉管质膜周围
及花粉管顶端约 15 ～ 20 μm 的地方，而亚顶端区荧
光较弱;在青杄花粉管顶端存在一个分泌囊泡积累
的透明区(图 2a，b，c，d)，这与被子植物中一致，但
分布特性与被子植物又略有不同，这在白杄也已证
明［13］。在正在改变生长方向的花粉管中，FM4-64
荧光主要集中在弯曲部位(图 2e)，显示囊泡运输在
弯曲部位非常活跃，供应新的顶端的生长［5］。
已有研究表明，Ca2 +参与细胞器运动与分泌囊
泡的运输，其梯度分布及动态变化影响花粉管骨架
的聚合与解聚过程，从而影响花粉管的生长过
程［5，14］。Camacho 等也发现依赖于钙离子的胞吐主
要是分泌细胞壁的前体物质决定着花粉管的生长方
向［5］。花粉管顶端钙离子内流的位点决定花粉管
的生长方向，花粉管顶端钙离子增加的位点与细胞
壁内向增厚的位点一致，其机理可能是特定位点的
钙离子调节分泌囊泡与质膜特定位点融合［6］。本
实验中钙离子在顶端区域分布的浓度梯度与囊泡分
布特性的一致性为二者在存在功能上的调节提供了
细胞学依据。这在其它生理过程中也有类似现象，
如 CaM 通过调节钙离子调节着花粉管内多种生理
活动，而大量研究表明，花粉管胞质中 CaM 分布与
钙离子非常相似［11］，使两者之间调控或协调关系成
为可能。
已有研究认为 Rop GTPases 可能通过调节钙离
子依赖的途径如 annexins 活性来控制极性胞吐［8］。
事实上，作者在以前的实验中已经在青杄中对 Rop
小 G 蛋白进行了定位，发现其主要定位于花粉管顶
端，在胞质和质膜上均有，但顶端处浓度最高［15］，和
钙离子及囊泡分布模式非常相似。因此，本实验对
Ca2 +及囊泡分布特性的双重标记，结合以前实验对
Rop GTPases 的定位，三者分布模式及特性的一致性
说明它们之间存在的调控及相互协调关系，对 Rop
GTPases 和 Ca2 +在调节囊泡运输过程提供了空间上
的定位及细胞学上的依据。
461
第 2 期 李玲俐等:青杄花粉管生长过程中囊泡运输与 Ca2 +分布的细胞学研究
图 1 Fluo-3 标记的青杄花粉管内连续切片扫描图。
a ～ j:同一花粉管从表面(a)到中部(j)的连续扫描。扫描时，花粉管顶端和基部不在同一个激光平面上。Bar = 20 μm
Fig. 1 Sequential scanning image of Fluo-3 in picea willsonii pollen tubes. a-j:Sequential serial sections
of laser scans from the surface (a)to the mid-plane (j). The apex and the base of the pollen tube were not in the same focal
plane when photographed. Bar = 20 μm
图 2 FM4-64 和 Fluo-3 在青杄花粉管中双标记的激光共聚焦扫描图。
将分别经过 FM4-64 和 Fluo-3 荧光染料标记后的花粉管置于用多聚赖氨酸(Poly-L-Lys MW，300kDa)包被的
载玻片上，分别在 514 nm 或 488 nm 激发波长下进行观察，叠加。其中，红色代表 FM4-64 标记，绿色为 Fluo-3 标记，
黄色为二者叠加之处。Bar = 20 μm
Fig. 2 The double-labeling image of laser scans of FM 4-64 and Fluo-3 in picea willsonii pollen tube.
In vitro-cultured pollen tubes were labeled with FM4-64 and Fluo-3 simutaneously，and transferred to
the slide disposed with Poly-L-Lys MW. The fluorescent dyes were observed at 514 nm and 488 nm，respectively.
Red represents FM4-64 labeling;Green for Fluo-3 labeling;Yellow for the fuse between red and green. Bar = 20 μm
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* Corresponding author
The cellular studies of vesicles transport and calcium
display in Picea wilsonii pollen tube
LI Ling-li，ZHANG Ling-yun*
(Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract:Using confocal laser scanning microscopy，the spatial distribution pattern of calcium and secretory vesicles in Picea wilsonii
pollen tube was investigated simultaneously. The double labeling of calcium-specific fluorescent probe Fluo-3 and the indicative dye of
dynamic changes in secretion vesicles FM4-64 displayed the typical gradient pattern of cytoplasm calcium concentration at the range of
40 － 50 μm from the top of pollen tube in Picea wilsonii，the highest concentration just in the top of tube;Fluorescent dye FM4-64 are
mainly distributed in the plasma membrane around the pollen tube and the top of the tube around 15 － 20 μm，while the sub – region
of pollen tube showed weak fluorescence. Concerning the distribution pattern of calcium and secretion vesicles together with Rop
GTPases in Picea wilsonii pollen tube，the spatial distribution and function relations among them are discussed.
Keywords:pollen tube;Picea wilsonii;calcium;secretion vesicle
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