全 文 ：收稿日期:2007-01-21
基金项目:河南省科技攻关项目(0424420021)
作者简介:王振河(1966-), 男 , 河南辉县人 , 副教授 , 主要
从事食药用真菌研究。
正交设计优化裂褶菌发酵全液多糖提取工艺
王振河 1 ,万学东2 ,武忠伟 1 ,田丹丹 1
(1.河南科技学院生物工程系 , 河南 新乡 453003;2.河南科技大学医学院 ,河南 洛阳 471003)
摘　要　采用正交设计试验方法进行了裂褶菌发酵全液中裂褶菌多糖的提取工艺优化的研究。 结果表明:影响多
糖提取的因素依次是料水比 >浸提温度 >浸提时间 ,三个因素的最佳组合是 A
4
B
2
C
3
, 即料水比为 1∶3, 浸提温度为
80 ℃,浸提时间为 4 h。在此条件下 ,发酵全液中多糖的最大得率达到 3.65g/L。
关键词　裂褶菌;裂褶菌多糖;提取;正交设计
中图分类号:S646　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-9690(2007)04-0050-02
OptimumExtractionofPolysaccharidefromTotalFermentation
ofSchizophylumcommuneEstablishedbyOrthogonalTest
WangZhenhe1 , WanXuedong2 , WuZhongwei1 , TianDandan1
(1.DepartmentofBio-Engineering, HenanInstituteofScienceandTechnology, Xinxiang453003, China;
2.SchoolofMedicine, HenanUniversityofScienceandTechnology, Luoyang471003, China)
Abstract　ThepolysaccharideextactiontechnologyofSchizophylumcommunetotalfermentationwas
studiedbyorthogonaltest.Theresultsshowedthattheextractionfactorsuchastheratioofmaterieland
waterhadtheprimaryafaction, theextactiontemperatureandextactiontimewereinthenextplace, the
fitestcombinationwasA4B2C3 , thatwastheratioofmaterielandwaterwas1∶3 , extracting4 hatthe80
℃.Inthecondition, thehighestextractyieldofpolysaccharidereached3.65g/L.
Keywords　Schizophylumcommune, Schizophylian, extraction, Orthogonaltest
　　裂褶菌(SchizophylumcommuneFr.)又名白参 、
树花 、鸡冠菌等 ,是真菌门 、担子菌亚门 、层菌纲 、伞
菌目 、裂褶菌科 、裂褶菌属的一种食药兼用菌 [ 1] 。
裂褶菌人工栽培的生物学效率只有 35% ～ 50%[ 2] ,
所以 ,对于裂褶菌的开发利用主要是利用液体发酵
生产的菌丝体和发酵液。发酵生产的菌丝体含有多
种营养成分和生物活性物质。液体培养裂褶菌菌丝
中粗蛋白的含量为 28.76 %,含 17种氨基酸 ,氨基
酸总量为 120.13 g/kg,必需氨基酸占营养菌丝中
总氨基酸的 37.76%[ 3] 。裂褶菌多糖 (Schizophyl-
lian,简称 SPG)是从裂褶菌子实体 、菌丝体以及发酵
液中提取出来的水溶性多糖 ,是裂褶菌中最主要的
生物活性物质 ,分子量 4×104 μ,结构是以单一组分
的 β -(1-3)-D葡聚糖 ,其中每 3个葡萄糖分子
上连有一个 β -(1-6)的分支 , SPG具有抑制肿瘤 、
抗菌消炎 、抗辐射 、提高机体免疫力等多种生理活
性[ 2-4] 。
冀颐之(2003)和邓桂芳 (2004)进行了裂褶菌
液体培养的研究 ,通过优化发酵工艺 ,摇瓶培养裂褶
菌胞外多糖最大得率分别为 2.70 g/L和 1.00 g/
L[ 5-6] 。裂褶菌液体发酵后发酵醪黏稠 ,菌体和发酵
液很难进行分离 ,所以 ,为了减少生产工序 ,我们对
自己分离的野生裂褶菌进行了液体培养 ,采用正交
试验设计 ,研究了不同温度 ,不同含水量及不同浸提
时间对裂褶菌发酵全液多糖提取的影响 ,为进一步
开发裂褶菌多糖提供基础资料。
—50—
第 26卷第 4期
2007年 8月 　　　　　　　　　　　　　 中 国 野 生 植 物 资 源ChineseWildPlantResources　　　　　　　　　　 　Vol.26 No.4Aug.2007
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株　裂褶菌(Schizophylumcommune
Fr.),利用野生裂褶菌经过多孢分离获得 ,保存在河
南科技学院微生物实验室 。
1.1.2　培养基　斜面种子培养基:采用综合 PDA
培养基 [ 11] ,配方为马铃薯 200 g/L,葡萄糖 20 g/L,
KH2PO4 3.0 g/L,蛋白胨 5 g/L, MgSO4· 7H2O1.5
g/L,琼脂 20 g/L, pH自然 。
液体培养基:葡萄糖 40 g/L, 蛋白胨 5 g/L,
KH2PO4 3.0 g/L, MgSO4· 7H2O1.5 g/L,水 1 000
mL, pH自然。
1.2　方法
1.2.1　菌种活化　将配制好的斜面种子培养基分
装在试管中 ,于 121 ℃温度下灭菌 30 min,冷却备
用 。在无菌条件下进行接种 ,然后在 26℃的恒温箱
中培养 ,将保存母种活化 ,菌丝长满斜面后备用 。
1.2.2　液体培养　将制备的液体培养基分装于锥
形瓶中 ,每个 250mL锥形瓶中分装 100mL,共制备
了 30个三角瓶。在超净工作台上 ,每个三角瓶中接
种 4 ～ 5块面积约为 0.3cm2的菌种块 ,在 26 ℃下 ,
160r/min的恒温摇床上培养 。当菌丝生长最快的
锥形瓶中形成大量的菌丝球 ,几乎无液体培养基时
终止培养。
1.2.3　裂褶菌发酵全液多糖提取工艺流程　发酵
全液※破碎※以不同加水量 、不同浸提温度和时间
进行提取※离心※取上清液※Sevage法除蛋白※离
心※取上清液 ※醇沉 ※湿多糖 ※冷冻干燥 ※干
多糖。
1.2.4　主要操作要点 　破碎:将发酵全液用高速
组织捣碎机破碎 5 min,转速 10 000 r/min。
浸提:在破碎后的裂褶菌发酵全液中按正交设
计的要求(表 1),每处理进行不同料水比 、不同时间
及不同温度的恒温水浴浸提。
脱蛋白:Sevage法除蛋白。在溶液中加入 0.2
倍体积的氯仿 、正丁醇混合液(体积比氯仿∶正丁醇
=5∶1),在磁力搅拌器上搅拌 30 min, 4 000 r/min,
离心 20 min回收上清液 ,去除蛋白质及有机溶剂。
乙醇沉淀:向浓缩液中加入 3倍体积的 95%的
乙醇 ,保持乙醇浓度在 70%以上 。
表 1　因子水平表
水平
因素
料水比 A
/(V/V)
浸提温度 B
/℃
浸提时间 C
/h
1 1∶0 70 2
2 1∶1 80 3
3 1∶2 90 4
4 1∶3 100 5
1.2.5　粗多糖含量测定
将冷冻干燥后的粗多糖称重 ,进行极差分析 。
2　结果与分析
试验按照 L16(43)实验设计 ,对裂褶菌发酵全
液多糖进行提取试验。结果见表 2 。
表 2　L16(43)正交试验结果分析
实验号 A B C 多糖含量 /(g/L)
1 1 1 1 1.00
2 1 2 2 1.00
3 1 3 3 1.50
4 1 4 4 1.50
5 2 1 2 1.50
6 2 2 1 1.83
7 2 3 4 2.15
8 2 4 3 2.00
9 3 1 3 1.50
10 3 2 4 3.00
11 3 3 1 2.50
12 3 4 2 2.33
13 4 1 4 2.33
14 4 2 3 3.65
15 4 3 2 3.17
16 4 4 1 3.50
水平和
K1 5.00 6.33 8.83 T=34.46
K
2 7.48 9.48 8.00
K3 9.33 9.32 8.65
K
4 12.65 9.33 8.98
水平均值
k1 1.25 1.58 2.21
k2 1.87 2.37 2.00
k3 2.33 2.33 2.16
k4 3.16 2.33 2.25
极差 R 1.91 0.79 0.25
　　由正交试验结果及其极差分析可知 ,影响多糖
提取的因素主次顺序依次是 A>B>C,即加水量 >
浸提温度 >浸提时间。比较 3个因素不同水平下各
自的平均值 ,表明多糖提取的最佳(下转第 56页)
—51—
第 4期　　　　　　　　　　　　　 　王振河 , 等:正交设计优化裂褶菌发酵全液多糖提取工艺　　　　　　　　　　　　
3.4　花粉保存及其保持生活力是远缘杂交的物质
保证
关于兰花花粉的保存及生活力的测定 ,前人所
做的研究较少。兰花花粉属于二核型花粉 ,具有厚
实的外壁 ,能忍耐干燥 ,寿命长 ,比较容易保存 [ 9] 。
在实验中对新鲜花粉生活力进行测定 ,发现兰花花
粉不能被 TTC染色 ,其机理有待于进一步研究 。用
离体萌发法测定时 ,发现 7月份开花的虎头兰花粉
容易萌发 ,但在其它时间采集的花粉则没有萌发 ,具
体原因也有待研究。
参考文献
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35.
(上接第 51页)
组合是 A4B2C3 ,即料水比 1∶3,浸提温度为 80 ℃,浸
提时间为 4h。
3　小结与讨论
本文通过三因素四水平正交试验 ,确定了提取裂
褶菌发酵全液多糖的最佳组为料水比 1∶3,浸提温度
为 80 ℃,浸提时间为 4 h,并得到裂褶菌发酵全液多
糖的最大得率为 3.65g/L。冀颐之(2003)和邓桂芳
(2004)进行了裂褶菌液体培养的研究 ,通过优化发
酵工艺 ,摇瓶培养裂褶菌胞外多糖最大得率分别为
2.70g/L和 1.00g/L[ 5 -6] ,与我们的研究结果相比明
显偏低 ,可能是因为她们仅提取了胞外多糖 ,或是选
用的裂褶菌菌株本身产糖率偏低。
对于多糖的研究 ,目前主要是集中在胞外多糖
上 。提取胞外多糖需要经过发酵醪的分离工序 ,但是
由于裂褶菌液体发酵后发酵醪黏稠 ,进行分离比较困
难 ,而且多糖多数附着在菌体表面 ,需要多次冲洗才
能将多糖和菌体分离 ,从而导致后续提取过程中浓缩
成本提高。所以 ,对裂褶菌发酵全液进行破碎后直接
提取多糖有益于生产工艺的简化和生产成本降低 。
本文主要进行了机械破碎后水浸法提取多糖的
研究 ,与超声波破碎或酶解后提取以及多种方法相结
合的提取效果的比较有待进一步研究。
参考文献
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷