全 文 ：　　收稿日期:2006-09-07;修回日期:2007-05-06
作者简介:唐文忠(1982-)安徽肥西人 ,硕士研究生;
通讯作者:荚　荣(1964-)安徽芜湖人 ,教授 ,硕导 ,主要从事环境生物技术方面研究 , E-mail:jiarong@ah163.com。
基金项目:安徽省教育厅自然科学研究项目(2006KJ162B);安徽大学人才队伍建设项目和研究生创新计划项目
裂褶菌 F17对刚果红的脱色及主要降解酶的研究
唐文忠 ,荚　荣 ,程晓滨 ,李旭东
(安徽大学生命科学学院 ,合肥　230039;安徽省生态工程与生物技术重点实验室 ,合肥　230039)
摘　要:裂褶菌 F17在限氮培养基中对偶氮染料刚果红表现出较高的脱色能力。最佳脱色条件为:温度 28℃、初始
pH值 4.5以及菌体摇瓶培养 3d加入染料 ,染料浓度以 100mg/L为宜。诱导因子藜芦醇 、吐温 80、土豆汁和松木屑
的加入明显提高了脱色率 , 而叠氮化钠和氰化钾的加入对脱色有显著的抑制作用。酶活检测表明 , 裂褶菌 F17在
刚果红脱色过程中主要产生 MnP, LiP活力很小 , 未检测到 Lac。此外 ,刚果红的脱色率与累积 MnP酶活具有良好
的线性关系 , 相关系数为 0.973。推测裂褶菌 F17对刚果红脱色的主要降解酶为 MnP。
关键词:裂褶菌 F17;刚果红;脱色条件;MnP;相关性
中图分类号:Q958.1 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2007)04-0024-05
　　由于生产和使用的要求 ,决定了人工合成染料属
于高度稳定的有机分子 ,具有耐光 、耐热 、耐物理化学
作用及难生物降解等特性。而全球每年大约要生产
70万吨的染料 ,估计有 10% ～ 15%的染料在使用过程
中被释放到环境中 ,造成严重的污染 ,其中 80%是偶
氮染料 [ 1, 2] 。刚果红是典型的双偶氮染料 ,也是第一个
人工合成的直接染料 ,被广泛应用于纺织 、造纸 、印染
等工业 [ 3] 。
白腐真菌是一类丝状真菌 ,它对难降解的污染物
具有广谱降解作用 ,尤其是能降解多环芳香烃类和毒
性较大的有机污染物 ,包括不同结构的多种染料 [ 4 , 5] 。
白腐真菌在一些主要营养物 (碳 、氮 、硫)受到限制时
产生木质素降解酶系 ,包括木质素过氧化物酶(LiP)、
锰过氧化物酶 (MnP)和漆酶 (Lac)。 LiP和 MnP是木
素降解酶系中起主要作用的两种过氧化物酶 ,它们是
在白腐真菌次生代谢过程中合成且被分泌到胞外 ,经
H2O2引发一系列自由基链反应 ,依靠氧化还原反应对
染料进行脱色 、降解和矿化 [ 6 , 7] 。但是 ,种类不同的白
腐真菌所产酶系存在差别 ,不同的培养条件和环境因
素也影响其降解酶的合成与分泌 [ 8] ,进而影响污染物
的降解效率。
本实验室已选育出 1株对多种染料脱色降解能力
较强的白腐真菌———裂褶菌 F17(Schizophylum sp.
F17)[ 9] ,该菌在限氮液体培养条件下 , 分泌 LiP与
MnP。本文以偶氮染料刚果红为作用对象 ,研究裂褶
菌 F17对其脱色的最佳条件 ,并分析脱色过程中的主
要降解酶 ,为研究该菌株的脱色 、降解机理以及实际应
用奠定基础。
1　材料与方法
1.1　菌种和染料
裂褶菌 F17本实验室分离 、保存。
偶氮染料刚果红购自上海试剂三厂 , λmax:
495nm, 分子量:696.67。
1.2　培养基
斜面培养基 (PDA):马铃薯 200g/L,蔗糖 20g/L,
琼脂 30 ～ 40g, pH值自然。
限氮培养基 [ 9] :葡萄糖 10g/L,酒石酸铵 0.2g/L,
KH2PO4 2.0g/L, CaCl2 0.1g/L, MgSO4 · 7H2O0.5g/L,
0.1g/LVB1 10mL, BⅠ微量元素溶液 70mL, 0.1mol/L
乳酸 -乳酸钠缓冲液(pH值 4.2)100mL。
1.3　试验方法
裂褶菌 F17接种于斜面培养基上 , 28℃、培养 3 ～
4d,用无菌水洗入三角烧瓶中 ,匀浆器打匀成碎菌丝
片段 ,分别吸取 5mL等分到装有 95mL的限氮培养基
烧瓶中 , 28 ℃、130r/min摇床振荡培养形成大小一致
的菌丝球。菌液培养一定时间后 ,在摇瓶中加入染料
(3个平行),每隔 24h取样测定脱色率和生物量 ,在研
究主要降解酶试验时 ,同步测定 MnP、LiP和 Lac酶活。
1.4　脱色率和生物量的测定
脱色率的测定 [ 10, 11] :用分光光度法测定并计算某
一培养时间内培养液中剩余染料浓度 a1(a为原染料
浓度)。则染料脱色率 =(a-a1)/a×100 %。
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生物量的测定:菌体过滤并用蒸馏水数次冲洗后
测其湿重。
1.5　酶活测定
LiP的测定 [ 12] ∶0.2mol/L酒石酸缓冲液 (pH值
3.0)1.5mL, 15mmol/L藜芦醇 1.0mL,粗酶液 0.4mL,
15mmol/LH2O2 0.1mL启动反应 , 25℃水浴 3min,于
310nm测其吸光度 ,以 0.1mL缓冲液代替 H2O2作空白
对照 ,定义每分钟使 1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所
需的酶量为一个酶活力单位(U)。
MnP的测定 [ 12] ∶0.1mol/L乳酸钠缓冲液 (pH值
4.5)3.4mL, 40mmol/LMnSO4 0.1mL,粗酶液 0.4mL,
1.6mmol/LH2O2 0.1mL启动反应 , 25℃水浴 5min,于
240nm测其吸光度 ,以 0.1mL缓冲液代替 MnSO4作空
白对照 ,定义每分钟氧化 1μmolMn2+成为 Mn3+所需的
酶量为一个酶活力单位(U)。
Lac的测定方法见参考文献 [ 13] 。
2　结果与讨论
2.1　裂褶菌 F17对刚果红脱色的影响因素
2.1.1　培养温度对脱色率的影响
本实验设置了 5个温度梯度:20℃、28℃、 35℃、
40℃、45℃,在初始 pH值 4.5的条件下培养 3d后加入
染料 ,终浓度为 100mg/L,不同时间段刚果红的脱色率
如图 1所示。由图可以看出 ,温度对脱色率的影响非
常显著 , 20℃时染料的脱色率较低 , 28℃时脱色最佳 ,
72h后脱色率能达 64.2%, 35℃、40℃、45℃时染料的
脱色率下降较大。温度是菌体生长和酶作用的重要因
素 ,根据实验结果 ,选择 28℃作为最佳脱色温度。
2.1.2　pH值对脱色率的影响
表 1　培养基 pH值变化情况
Table1ThechangeofpHofculturemedium
阶段 pH
初始 3.0 4.0 4.5 5.0 6.0
培养 3天 2.5 3.6 4.0 4.0 4.2
　　调节限氮培养基的 pH值为 3.0、4.0、4.5、5.0、
6.0, 菌体培养 3d后加入染料 ,终浓度为 100mg/L,限
氮培养基 pH值变化情况见表 1,不同时间段刚果红的
脱色率见图 2。由表 1可以看出 , 菌体真正脱色 pH值
是在 2.5 ～ 4.2之间 ,说明菌体在生长代谢过程中有产
酸现象 ,导致 pH值下降。由图 2可以看出 ,初始 pH
值在 4.5 ～ 6之间 ,染料均有较高的脱色率 ,故选择初
始 pH值 4.5作为最佳脱色 pH值。
2.1.3　染料加入时间对脱色率的影响
分别在摇瓶接种后的第 2d、3d、4d、5d加入染料 ,
终浓度为 100mg/L,不同时间段刚果红的脱色率见图
3。由图结果可知 ,染料于接种后的第 2d加入 ,脱色率
很低 ,可能染料对菌体生长及代谢存在抑制作用;3d
或 4d后加入 ,脱色率明显提高。本实验选择在接种后
的第 3d加入染料。
脱色时间(h)time
图 1　培养温度对刚果红脱色率的影响(℃)
Fig1Efectofculturetemperatureonthedecolorization
percentageofCongored(℃)
脱色时间(h)time
图 2　pH值对刚果红脱色率的影响
Fig2EfectofpHonthedecolorizationpercentageofCongored
2.1.4　染料浓度对脱色率的影响
菌体培养 3d后 ,分别加入浓度为 50mg/L、100mg/
L、150mg/L、200mg/L的染料 ,测定不同时间段刚果红
的脱色率 ,结果见图 4。由图可见 ,刚果红浓度增大 ,
裂褶菌 F17保持一定的脱色率 ,并且 ,在刚果红浓度
100mg/L内 , 随浓度增大脱色率反而提高 ,当染料浓
度达到 200mg/L时 ,脱色率下降较大 ,而且通过实验观
察发现 , 72h后菌体仍吸附大量染料。表明高浓度的
染料对降解有一定的抑制作用 ,脱色以吸附为主。
脱色时间(h)time
图 3　染料加入时间对刚果红脱色率的影响(d)
Fig3Efectofthetimeofdyeadditiononthe
decolorizationpercentageofCongored(d)
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脱色时间(h)time
图 4染料浓度对刚果红脱色率的影响(mg/L)
Fig4Efectofdyeconcentrationonthedecolorization
percentageofCongored(mg/L)
2.1.5　诱导因子的加入对脱色率的影响
分别在限氮培养基中补充终浓度为 0.5mmol/L、
1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L的藜芦醇 ,结果见
图 5。另外 ,分别在另组限氮培养基中补充终浓度为
0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的吐温 80,结果见图 6。由
图可 知 , 当藜芦 醇和 吐温 80 的 浓度 分别 达到
1.0mmol/L和 0.1%时 ,刚果红的脱色率和脱色速率都
有显著提高 ,脱色 24h后 ,脱色率就分别达到 70.5%
和 63.8%, 72h后脱色率分别为 89%和 92.9%。随着
浓度的增加 ,脱色率相差不大 ,故选择藜芦醇和吐温
80的最佳补充浓度分别为 1.0mmol/L和 0.1%。
脱色时间(h)time
图 5　藜芦醇对刚果红脱色率的影响(mmol/L)
Fig5 Efectofveratrylalcoholonthedecolorizationpercentage
ofCongored(mmol/L)
脱色时间(h)time
图 6　吐温 80对刚果红脱色率的影响
Fig6Efectoftween80onthedecolorizationpercentageofCongored
2.1.6　天然物质对脱色率的影响
分别在限氮培养基中补充终浓度为 20g/L、50g/
L、100g/L、150g/L的土豆汁;另外 ,分别在另组限氮培
养基中补充终浓度为 1g/L、3g/L、5g/L、7g/L的松木
屑 ,进行脱色试验。研究结果得出 ,终浓度为 50g/L的
土豆汁或 3g/L的松木屑 ,都能明显提高刚果红的脱色
率和脱色速率。
2.1.7　抑制剂对脱色率的影响
菌体培养 3d后 ,在摇瓶中分别加入叠氮化钠和氰
化钾 ,使其终浓度均为 1.0mmol/L,再同时加入染料 ,
进行脱色试验。研究结果发现 , 2种化合物明显地抑
制了裂褶菌 F17的脱色能力。叠氮化钠和氰化钾均为
木质素降解抑制剂 ,同样对真菌的脱色也有抑制作
用 [ 14] ,说明染料脱色正是由于裂褶菌 F17的木质素降
解活力的作用。
2.2　裂褶菌 F17对刚果红脱色的主要降解酶
2.2.1　生物量 、降解酶与刚果红的脱色
裂褶菌 F17接种于斜面培养基上 ,培养 3 ～ 4d后 ,
用无菌水洗入三角烧瓶中 ,匀浆器打匀成碎菌丝片段 ,
分别吸取 1mL、5mL、10mL和 15mL加入装有 99mL、
95mL、90mL和 85mL的限氮培养基烧瓶中 ,培养 3d
后 ,加入终浓度为 100mg/L的刚果红 ,脱色 72h后的结
果见图 7。由图可以看出 ,初始接种量的不同 ,导致限
氮培养基中菌体生物量存在明显差异 ,接种量 lmL,
72h时生物量为 38.7 g/L,接种量 5mL以上 , 72h时生
物量均超过 55.0g/L,但是 ,刚果红的脱色率基本相
同 ,都在 66%左右;酶活分析菌体产酶以 MnP为主 ,少
量的 LiP,不产生 Lac。可见 ,菌体生物量的多少不是
刚果红脱色的主要影响因素 ,而是与菌体产生的降解
酶有关。
图 7　不同接种量脱色 72h后刚果红的脱色率 、菌体生物量和酶活
Fig7DecolorizationpercentageofCongored、inoculationquantityand
enzymeactivitywithdiferentinoculationquantityafter72h
2.2.2　降解酶与刚果红的脱色
以限氮培 养基为对 照 , 分别 加入终 浓度为
1.0mmol/L的藜芦醇 、0.1%的吐温 80、50 mg/L的土
豆汁和 3mg/L的松木屑 ,同步测定 5种体系中刚果红
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脱色率和降解酶酶活 ,结果见表 2。由表可知 , 5种体
系中 ,脱色 96h后 ,刚果红脱色率分别为 68%、89.1%、
92.4%、98.2%和 95.7%, 48h时 MnP酶活分别为 18.3
U/L、87.2U/L、96.5 U/L、103.4 U/L和 97.2 U/L, LiP
活力很小 ,体系中未检测到 Lac。实验观察发现 ,脱色
24h时 , 5种体系中菌体和脱色液都是紫色 ,此时 ,脱色
主要是吸附作用;脱色 96h时 ,后 4种体系中菌体和脱
色液都变为淡黄色 ,表明刚果红结构已被破坏。
由于不同时间段 , 染料的脱色率与酶活都在变
化 , 从图中不能直接看出脱色率与酶活的关系。另
外 , 某一时刻染料的脱色率是由该时刻以前一段时间
内降解酶累积作用的结果 , 因此 , 本文分析了染料脱
色率与累积酶活之间的相关性 [ 15] , 结果见图 8。由图
8 (a)可知 , 所有体系中 , 刚果红的脱色率与累积
MnP酶活具有良好的线性关系 , 相关系数为 0.973,
但是 , 刚果红的脱色率与累积 LiP酶活之间的相关系
数只有 0.811, 见图 8 (b)。可见 , 刚果红的脱色与
MnP是直接相关的。
综上可推断 ,裂褶菌 F17对刚果红脱色的主要降
解酶为 MnP,少量的 LiP为辅助。有关利用 MnP对刚
果红的脱色试验及脱色条件正在进一步研究。
表 2　五种体系不同时间段刚果红的脱色率(%)和酶活(U/L)
Table2Decolorizationpercentage(%)ofCongoredandtheenzymeactivity(U/L)atdiferenttimeinthefivesystems
体系
时间(h)
限氮培养基
MnP LiP 脱色率
添加藜芦醇
MnP LiP 脱色率
添加吐温 80
MnP LiP 脱色率
添加土豆汁
MnP LiP 脱色率
添加松木屑
MnP LiP 脱色率
24 6.7 1.5 58.9 39.9 5.2 69.1 42.7 4.7 64.1 58.2 5.6 73 68.3 2.2 72.9
48 18.3 0.4 64.2 87.2 0.7 83.6 96.5 0.6 83.7 103.4 3.6 91.1 97.2 6.4 84.1
72 11.6 0.2 67.1 64.5 0 88.4 66.5 0 92.1 60.1 0.7 97.4 72.2 4.0 94.3
96 2.5 0 68 21.6 0 89.1 31.4 0 92.8 20.9 0 98.2 8.6 0 95.7
图 8　刚果红脱色率与累积酶活的相关性 a, MnP,
线性方程:Y=62.178+0.143X,相关系数 r=0.973;
b, LiP, 相关系数 r=0.811
Fig8Relationshipbetweendecolorizationpercentageof
Congoredandcumulativeenzymeactivity.
a, MnP, RegressionequationisY=62.178+0.143X,
correlationcoeficientis0.973;b, LiP, correlationcoeficientis0.811
3　结论
3.1　裂褶菌 F17在限氮培养基中对偶氮染料刚果红
脱色的最佳条件:温度 28℃、初始 pH值 4.5以及菌体
摇瓶培养 3d加入染料 ,刚果红浓度以 100mg/L为宜 ,
诱导因子藜芦醇 、吐温 80、土豆汁和松木屑的加入明显
提高脱色率和 MnP酶活 , 其最 佳终浓度分别为
1.0mmol/L、0.1%、50g/L和 3g/L,而叠氮化钠和氰化
钾的加入对刚果红的脱色有显著的抑制作用。
3.2　裂褶菌 F17在刚果红脱色过程中的产酶以 MnP
为主 , LiP活力很小 ,未检测到 Lac。刚果红的脱色率与
累积 MnP酶活具有良好的线性关系 ,相关系数为
0.973,与累积 LiP酶活之间的相关系数为 0.811。推
测裂褶菌 F17对刚果红脱色的主要降解酶为 MnP,并
以少量的 LiP为辅助。
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StudyonthedecolorizationofCongoredbySchizophylumsp.
F17anditsdegradationenzymes
TANGWen-zhong, JIARong, CHENGXiao-bin, LiXu-dong
(1.ColegeofLifeScience, AnhuiUniversity, Hefei230039, China;
2.AnhuikeylaboratoryofEcologicalEngineeringandBiotechnology, Hefei230039 , China)
Abstract:Theazodye, Congored, wasdecolorizedefectivelybySchizophylumsp.F17innutrientnitrogen
limitedculturemedium.Theoptimumconditionsofdyedecolorizationwereasfolows:temperature28℃, initial
pH=4.5, dyesaddedtothemediumafter3daysofincubationinshakenflasks, andoriginaldyeconcentrationwas
100mg/L.Theadditionofveratrylalcohol、tween80、potatoextractanddealragalhadagreatpromotionondecol-
orizationrate, buttheadditionofNaN3 andKCNalhadmakedinhibitionactionondecolorization.Schizophylum
sp.F17producedMnPmainlywhiledecoloringofCongored, LiPactivitywasverylow, andnolaccsewasdetected.
Moreover, therewasagoodlinearrelationshipbetweendecolorizationpercentageofCongoredandcimulativeMnP
activity, andcorelationcoeficientwas0.973.SoitwasconcludedthatMnPplayedakeyroleinthedecoloriza-
tionofCongoredbySchizophylumsp.F17.
Keywords:Schizophylumsp.F17;Congored;decolorizationconditions;MnP;relationship
·写作常识 ·
本刊常用的计量单位
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面积:公顷用 hm2 ,不用 ha,亩用公亩 ,换算因数为 1hm2 =15亩。
旋转速度:用 r/min,不用 rpm, ×g。
蒸气压力:用 Pa或 kPa、MPa表示 ,不用大气压 at, kg/m2或 kg/cm2等。
光密度:用 OD(斜体)表示。
生物大分子的分子量:蛋白质用 u或ku,核酸用 bp或 kb表示。
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