全 文 ：茅莓及其含药血清对 K562 白血病
细胞抑制作用的实验研究*
许晓峰1 张学进1△ 冯 健2 姜铁军1 付天红1 高瑞兰3
(1 浙江省中西医结合医院·杭州 310003 2 浙江中医药大学·杭州 310053 3 浙江省中医院·杭州 310006 )
摘 要 目的:观察茅莓及其含药血清体内及体外对 K562 细胞的抑制增殖作用。方法:通过建立荷白血
病瘤裸鼠模型，观察不同浓度的茅莓水煎液对荷白血病瘤裸鼠瘤体体积、重量、组织病理学改变的影响;
通过半固体琼脂培养观察不同浓度的茅莓含药血清对 K562 细胞集落生长的抑制作用;通过 MTT法观察
不同浓度的含药血清对 K562 白血病细胞的抑制增殖作用。结果:茅莓水煎液高、中、低剂量组瘤体体积、
瘤重均较模型对照组明显减少;茅莓水煎液组及阿糖胞苷(Ara － c )组光镜下可见多个坏死灶，瘤细胞肿
胀、破裂，细胞核溶解，消失等现象。终浓度为 10%和 20%的含药血清做琼脂半固体集落培养，显示随着
浓度增加，K562 细胞集落形成明显减少，抑制作用呈剂量依赖性，MTT法显示终浓度 10%和 20%含药血
清能明显抑制 K562 细胞增殖。结论:茅莓在荷白血病瘤裸鼠体内具有显著抑制瘤体生长的作用，在一
定浓度下，其含药血清对 K562 细胞也有明显的抑制增殖作用。
主题词 白血病 /中医药疗法 茅莓 /治疗应用 血清药理学 裸鼠 大鼠
* 浙江省中医药管理局课题 No． 2008CB063
△通讯作者
悬钩子属植物具有活血化瘀、清热止痛的功效［1 － 2］，在
我国传统中医中药中已广泛应用，许多研究者对其进行了一
系列研究，发现其具有抑菌消炎、抗过敏、抗氧化和镇痛等多
种药理作用［3 － 4］，近来发现有抗肿瘤作用［5］。
茅莓为悬钩子属植物，具有清热凉血、止血、散结止痛 、
利尿消肿等多种功效。郑振洨等［5］报道茅莓总皂苷对 Hut
－ 78 人皮肤 T细胞淋巴瘤有明显的抗肿瘤活性。白血病是
血液系统恶性肿瘤，与淋巴瘤细胞的生物特性相类似，但其
对白血病细胞的抑制作用尚未见报道。本研究以细胞株
K562细胞为实验对象，利用自行建立的裸鼠异种移植模型，
在体内和体外观察茅莓水煎液、含药血清对 K562 细胞的作
用，旨在寻找出抑制白血病细胞恶性增殖的中药有效成分。
1 材料
1. 1 靶细胞 白血病细胞株 K562:中科院上海细胞所惠
赠，在血液病研究所液氮长期保存。
1. 2 实验动物 BALB /c裸鼠:购自上海斯莱克实验动物有
限责任公司，4 ～ 6 周龄，重约 16g，在浙江中医药大学动物
中心基因与免疫缺陷实验室空气层流架中带盖鼠笼内饲养。
饮用水、标准饲料及其它与动物接触物品均经灭菌处理。
SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，200 ～
240g，在浙江中医药大学动物中心饲养。
1. 3 主要试剂和药品 小牛血清 :杭州四季青生物工程材
料研究所;IMDM培养基:Gibco;青霉素钠:山东鲁抗制药;硫
酸链霉素:华北制药公司;96 孔培养板:美国 Becton;四唑蓝:
上海生工;二甲基亚砜:国产分析纯。阿糖胞苷:杭州民生药
业集团有限公司。茅莓水煎液:茅莓根购自杭州桐君堂中药
饮片厂，经浙江中医药大学生药学教研室陈锡林教授鉴定为
蔷薇科悬钩子属植物茅莓(Rubus parvifolius L. )的根。400g
茅莓根饮片，加 10 倍量水提取 2 次，每次 1. 5 小时，合并水
提液，减压浓缩至相当于 2g 生药 /ml 的药液。药液经高温
(湿热)灭菌后，无菌条件下保存。
1. 4 仪器 CO2 培养箱:德国 Heraeus;P － 20、P － 200 移液
器 :法国 Gilson，普通光学显微镜:日本 Olympus;倒置显微
镜:日本 Olympus;BIO － TEX酶标仪:Instruments． Inc。
2 实验方法
2. 1 细胞株培养 K562 白血病细胞株常规接种于含 10%
灭活小牛血清、青霉素和链霉素各 100U /ml 的 IMDM 培养
液，置于 37℃、5% CO2 及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养，每
2 ～ 3 天换液。实验时取对数生长期的细胞。
2. 2 体内实验
2. 2. 1 高致瘤 K562 细胞株的筛选 将对数生长期 K562 细
胞 1 × 106 个移植到 4 ～ 5 周龄 BALB /c 裸鼠腋下或背部皮
下，成瘤后处死小鼠，无菌条件下取瘤，将瘤块置于杵状玻璃
匀浆器，并加入 5ml D － Hank＇s液，匀碎瘤组织后将匀浆液通
过 100 目孔径不锈钢网过滤去除未破碎瘤块，将所得到的细
胞悬液通过 4. 5 号针头，制成单细胞悬液后接种于 100ml培
养瓶培养 10 ～ 15 代，即制得高致瘤性 K562 细胞。
2. 2. 2 荷白血病瘤裸鼠模型的建立及分组给药 将高致
瘤的 K562 细胞 1000r /min 离心 10 分钟，倒去上清液，用单
IMDM混匀，调整细胞浓度至 4 × 107 /ml，移植于 4 ～ 6 周龄
BALB /c裸鼠背部皮下，0. 2ml /只，5 天后成瘤，将成瘤的裸
鼠随机分成 5 组，每组 5 只，茅莓水煎液高剂量组(55. 56g /
kg)、茅莓水煎液中剂量组(27. 78g /kg)、茅莓水煎液低剂量
组(13. 89g /kg)、阿糖胞苷组(40mg /kg，ip)组，均连续给药
14 天。模型对照组每日以生理盐水灌胃。
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2. 2. 3 茅莓水煎液对荷白血病瘤裸鼠的作用
观察裸鼠的活动情况(包括进食、大小便性状、精神状
态等) ，测量瘤体大小，用游标卡尺测量瘤体的长径 a及短径
b(mm) ，计算体积公式为:V =∏ /6 × ab2(mm3)［6］，并绘制
瘤体生长曲线。灌胃 14 天以后，断颈处死裸鼠，剥离瘤体并
称重，计算抑瘤率。抑瘤率 = (1 － 治疗组瘤重 /对照组瘤
重)× 100%。取瘤体，以 10%甲醛固定 48 小时，石蜡包埋
切片，HE染色后进行光镜观察。
2. 3 体外实验
2. 3. 1 含药血清制备 取 SD 大鼠 ，体重 200 ～ 240g，随机
分成空白组 4 只 ，茅莓组 4 只。茅莓组予茅莓 9g /kg(相当
于临床用量的 10 倍 )灌胃，正常组每日给予等量生理盐水
灌胃 ，于给药第 7 天 ，最后灌药后 1 小时(灌药前禁食 12 小
时)乙醚麻醉后无菌剖腹 ，经腹主动脉无菌采血 ，每鼠大约
可采血 6 ～ 8ml，置无菌离心管离心 10 分钟 (1500r /min ) ，
56℃水浴 30 分钟灭活，用 0. 22μm 微孔滤膜过滤除菌 ，分
装，置 － 20℃冰箱保存备用。
2. 3. 2 含药血清对 K562 细胞集落生长的作用 琼脂半固
体集落培养法。计数集落标准定为 CFU － K562(＞ 40 个细
胞) ，并计算各实验组对细胞生长的抑制率，抑制率 =(1 －
A实验组 / A对照组) × 100%。
2. 3. 3 含药血清对 K562 细胞增殖的影响 MTT法检测。
2. 4 统计学处理 利用 SPSS13. 0 统计软件包进行统计，各
组数据采用均数 ±标准差来表示，用 t检验处理，以 P ＜ 0. 05
为显著性差异，P ＜ 0. 01 为非常显著性差异。
3 结果
3. 1 各组裸鼠成瘤情况比较 见表 1。
表 1 各组裸鼠瘤体体积、瘤重和抑瘤率比较(x ± s，n = 10)
组别 剂量(/kg) 体积(mm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%)
模型组 — 2984. 91 ± 136. 23 2. 34 ± 0. 50 －
Ara － c组 40mg 338. 50 ± 82. 08＊＊ 0. 27 ± 0. 11＊＊ 88. 66 ± 5. 19＊＊
茅莓组(低) 13. 89 1267. 16 ± 322. 18 0. 95 ± 0. 13＊＊ 57. 55 ± 7. 14*
茅莓组(中) 127. 78 734. 15 ± 230. 03 0. 49 ± 0. 09* 75. 40 ± 9. 12*
茅莓组(高) 55. 56 383. 24 ± 37. 24 0. 33 ± 0. 01＊＊ 87. 16 ± 7. 67＊＊
与模型组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
3. 2 各组裸鼠皮下移植瘤组织的病理变化
各治疗组及阿糖胞苷组瘤细胞有明显的坏死现象。光
学显微镜下可见多个坏死灶，瘤细胞肿胀、破裂，细胞核溶
解，消失等现象。见图 1 ～ 5。
图 1 模型组(10 × 40) 图 2 Ara － c苷组(10 × 40) 图 3 茅莓低剂量组(100 × 40) 图 4 茅莓中剂量组(10 × 40) 图 5 茅莓高剂量组(10 × 40)
3. 3 茅莓含药血清对 K562 细胞集落生长的抑制作用 见
表 2。
表 2 各组 K562 细胞集落数及抑制率的比较(x ± s)
组别 集落数(CFU) 抑制率(%)
空白组 — 125. 0 ± 4. 7 —
空白血清组 — 127. 0 ± 9. 2 —
茅莓组 (低) 5% 121. 0 ± 5. 3 3. 1 ± 2. 1
茅莓组(中) 10% 98. 2 ± 3. 0 Δ 21. 6 ± 2. 2Δ
茅莓组(高) 20% 63. 3 ± 2. 9ΔΔ 48. 8 ± 1. 2ΔΔ
与空白组、空白血清组比较 ΔP ＜ 0. 05，ΔΔP ＜ 0. 01
3. 4 茅莓含药血清对 K562 细胞增殖的抑制作用 结果见
表 3。
表 3 各组 K562 细胞增殖的 MTT检测结果(x ± s)
组别 吸光度 抑制率(%)
空白组 — 1. 31 ± 0. 05 —
空白血清组 — 1. 32 ± 0. 01 —
茅莓组(低) 5% 1. 30 ± 0. 02 0. 7 ± 0. 2
茅莓组(中) 10% 1. 04 ± 0. 01Δ 20. 5 ± 0. 4Δ
茅莓组(高) 20% 0. 69 ± 0. 02ΔΔ 48. 4 ± 8. 9ΔΔ
与空白组、空白血清组比较 ΔP ＜ 0. 05，ΔΔP ＜ 0. 05
4 讨论
当前，白血病的临床治疗仍采用传统的大剂量联合化
疗，但此疗法副作用大，复发率高，尤其对机体免疫与造血系
统有很大损害。寻找抑制白血病细胞恶性增殖并诱导其凋
亡的中药是值得探索的途径之一。茅莓是悬钩子属中比较
常见的一种植物，具有清热凉血、止血、散结止痛 、利尿消肿
等多种功效，以往的研究集中在心血管方面，对肿瘤的研究
较少。本科在临床中发现淋巴瘤患者口服茅莓水煎液后，患
者的症状明显好转 ，淋巴结明显缩小，生存期明显延长，生
活质量明显提高。但是对抗白血病的研究尚未见报道。
本研究显示茅莓水煎液给荷白血病瘤裸鼠灌胃后，瘤块
病理检查可见多个坏死灶，瘤细胞肿胀、破裂，细胞核溶解、
消失等现象，而对照组白血病细胞生长旺盛，而且各治疗组
瘤体体积、瘤重均较模型对照组明显减少。
茅莓含药血清可明显减少 K562 细胞细胞集落数目，
MTT检测证实含药血清对 K562 增殖有明显抑制作用。说
明茅莓水煎液及其含药血清确实在体内和体外对 K562 细
胞均有明显的抑制作用。
本研究采用动物实验、中药血清药理学相结合的方法观
察了茅莓对白血病细胞的抑制作用，无论是在体内还是体外
均有抗白血病作用，其作用机制尚不明确，有待于进一步研
究。
参考文献
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医药研究，2002，18(2) :371．
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·904·中国中医药科技 2011 年 9 月第 18 卷第 5 期 Sep． 2011 Vol. 18 No. 5
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response of human lung carcinoma xenografts to vindesine and vin-
cristine． Br J Cancer，1982，45:466．
(收稿:2010 － 11 － 25

)
刺五加对鱼藤酮诱导的帕金森病果蝇模型作用的研究
陈 专 李廷利△ (黑龙江中医药大学中药药理教研室·哈尔滨 150040)
△通讯作者
1 材料 野生型 Canton S品系黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) :
北京大学生命科学学院提供。鱼藤酮蔗糖溶液:精密称取 20mg 鱼
藤酮(阿拉丁生产，纯度 95%，批号:26714)加 0. 4ml吐温 － 80，超声
10 分钟，再用 5%蔗糖水溶液定容 10ml，取出部分加入 3 倍量 5%蔗
糖水，得到 500mg /L 鱼藤酮蔗糖溶液。刺五加提取液:刺五加根
(Manyp rickle Acanthopanax root)粉碎，水煎醇提，浓缩成 6. 4g /ml、
3. 2g /ml、1. 6g /ml 备用。基础培养基配方:蒸馏水 460ml、玉米粉
42g、蔗糖 31g、琼脂 3g、酵母粉 3g、丙酸 2. 5ml。多巴胺 EL25A 试剂
盒:Takara公司。仪器:果蝇二氧化碳麻醉装置:自制;果蝇雌雄分离
装置:自制;果蝇攀爬能力测试装置:自制;SB － 5200D 超声波清洗
机:宁波新芝生物科技股份有限公司;MK3 酶标仪:上海赛默飞世尔
仪器有限公司。
2 方法
2. 1 实验环境 温度(24 ± 1)℃;相对湿度:50% ～ 60%;光照:12
小时自动亮 －暗循环(7:00 开灯，19:00 关灯)。
2. 2 处女蝇的收集与饲养 每天晚上 18:00 ～ 19:00 将培养瓶内的
成蝇转移或杀死，次日早晨 7:00 ～ 8:00 对新羽化出的果蝇进行挑
选，收集 12 小时内羽化未交配的处女蝇，麻醉后雌雄分养，分别移入
装有新鲜培养基的玻璃试管内，每个玻璃试管选出性状好的果蝇 50
只左右，并且标明雌雄及日龄，废弃的放在装有乙醇的锥形瓶里处
死。每 5 天更换 1 次培养基。
2. 3 模型的复制［1］ 选取刚孵化雄性野生型 Canton S 品系黑腹果
蝇，每组 60 只左右，基础培养管中(基础培养基配方同上)培养 5
天，转移至含诱导剂的滤纸培养管中(每管含 0. 5ml 浓度为 0. 5mg /
ml鱼藤酮蔗糖水溶液)培养 2 天，即为成模果蝇。
2. 4 分组及给药 造模后的果蝇分为 4 组:模型组、高剂量给药组、
中剂量给药组、低剂量给药组，分组后，模型组转移至基础培养管中
培养 3 天，给药组分别转移至对应含药培养管中(每管含药液 4ml)
给药 3 天。以正常果蝇做对照。
2. 5 观察指标及测定
2. 5. 1 果蝇攀爬能力测试 分别将每组 40 只 CO2 轻微麻醉状态
下果蝇单只放入 40 支一排竖直的玻璃微管(长 150mm，内径 3mm)
中，开口端使用脱脂棉封闭，将果蝇晃到管底，利用高清自动监控系
统监测每只果蝇通过玻璃微管时所用的时间，计算各组平均攀爬时
间作为果蝇攀爬能力评价指标。考察刺五加对鱼藤酮诱导果蝇 PD
模型行为抑制的防治作用。
2. 5. 2 果蝇脑部多巴胺(DA)含量测定 采用 ELISA 法检测，严格
按试剂盒说明书步骤操作。
2. 6 数据分析 各组数据用(x ± s)表示，采用 t检验。
3 结果
3. 1 各组果蝇攀爬能力测试结果 见表 1。
表 1 各组果蝇的攀爬时间比较(x ± s，s)
组别 n 攀爬时间
正常组 30 35. 63 ± 9. 39
模型组 30 65. 97 ± 12. 81＊＊
低剂量组 30 59. 03 ± 12. 53＊＊#
中剂量组 30 49. 27 ± 12. 80* ##
高剂量组 30 39. 47 ± 11. 58##
与正常组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较#P ＜
0. 05，##P ＜ 0. 01
3. 2 各组果蝇脑部 DA含量测定结果 见图 1。
图 1 各组果蝇脑部 DA含量
4 讨论 帕金森病(PD)是一种进行性神经系统退行性疾病，属于中老
年人常见的运动障碍性疾病。但其病因和发病机制十分复杂，至今仍未
彻底明确，目前所有针对 PD的治疗均为对症治疗［1］。本文依据文献报
道［2］，采用鱼藤酮诱导 PD模型，观察刺五加对该模型的干预作用。
为了保证实验结果的准确、可靠，本实验首先对造模的果蝇进行
筛选。果蝇从蛹化到成虫后，活动能力在 7 ～ 17 天内稳定的保持在
最高水平［3］，因此实验选择了 7 日龄果蝇作为监测对象。实验结果
表明刺五加可明显提高 PD果蝇的攀爬能力，增加 PD 果蝇脑内 DA
含量，并呈剂量依赖性，由此提示刺五加为治疗帕金森的有效药物。
参考文献
［1］ Coulom H，Birman S． Chronic exposure to rotenone models sporadic
Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster． J Neurosci，2004，
24(48) :10993．
［2］ 柏秀娟，尚延昌，王伟，等．帕金森病的研究进展． 现代生物医
学进展，2010，10(1) :178．
［3］ 李廷利，许光辉，徐瑞鑫．影响野生型 Conton S 果蝇睡眠时间
的相关因素研究．中国实验动物学报，2010，18(2) :105．
(修回:2011 － 07 － 20)
·014· 中国中医药科技 2011 年 9 月第 18 卷第 5 期 Sep． 2011 Vol. 18 No. 5
EXPERIMENTAL STUDY ON PROTECTIVE EFFECT OF DAHUANG ZHECHONG PILL
ON KIDNEYS OF RATS WITH NEPHROPATHY INDUCED BY ADRIAMYCIN
CHEN Jihong，SUN Wei，ZHOU Dong，et al
(Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210029)
Objective:To discuss the protective effect of dahuang zhechong pill on kidneys of rats with nephropathy induced by adriamycin．
Methods:Models were built by injecting adriamycin，models were divided into model，dahuang zhechong pill groups，taking normal
rats as control group． Each group was given the corresponding management for 28 days，determined urine protein and NAG enzyme，
than killed rats，determined blood BUN，SCr，ALB，TC，TG and rheology;taking renal tissue to observe pathomorphology changes．
Results:Dahuang zhechong pill could reduce the urine protein and NAG enzyme of rats with nephropathy induced by adriamycin，de-
crease TG level，significantly improve hypercoagulability，ease the pathomorphology changes of renal tissue．
Conclusion:Dahuang zhechong pill can protect rats’kidneys from adriamycin injury by lowering urine protein and blood lipid，im-
proving blood coagulation．
INFLUENCE OF JIAOTAI PILL ON MORPHOLOGICAL CHANGES OF
ISLETS OF PANCREAS IN TYPE 2 DIABETES MELLITUS RATS
HU Na，YUAN Lin，LIU Zhiqiang，et al
(Shanghai Traditional Chinese Medicine University，Shanghai 201203)
Objective:To observe the influence of jiaotai pill on morphological changes of islets of pancreas in type 2 diabetes mellitus rats．
Methods:Models with type 2 diabetes mellitus were made by feeding high － carbonhydrate and high － lipid diet for 6 weeks，than in-
tra － abdominal STZ，experiment was divided into normal，model and jiaotai pill groups，normal and model group were given saline，
Chinese group was given jiaotai pill for 5 weeks，dynamic observing the changes of water intake and food intake，body weight and fast-
ing blood － glucose，detecting serum FFA，TG and IND level;taking pancreas tissue to observe the pathomorphology changes by light
and electron microscope;insulin positive cells were observed by immunohistochemical method．
Results:To compare with model group，FBG of jiaotai pill group began to low after treated 1 week，the difference between jiaotai pill-
group and model group was difference after treated 5 weeks;food intake decreased obviously from the third week，on the fifth week-
end，water intake，TG，FFA reduced significantly． The pathomorphology observation showed that the islets structure of jiaotai pill
group was more intact than that of model，the number of cells increased，secretory granules of cells were rich，epithelioid cells of islets
peripheral ducts increased and migrated to central of islets． The immunohistochemical results in jiaotai pill group showed that the num-
ber of insulin positive cells increased，staining got shade．
Conclusion:Jiaotai pill can protect the structure of islets of pancreas in type 2 diabetes mellitus rats．
EXPERIMENTAL STUDY ON INHIBITION EFFECTS OF JAPANESE RASPBERREY HERB
AND ITS SERUM CONTAINING HERB ON K562 LEUKEMIA CELLS
XU Xiaofeng，ZHANG Xuejin，FENG Jian，et al
(Hospital of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine of Zhejiang Province，Hangzhou 310003)
Objective:To observe the inhibition of Japanese raspberry herb and its serum containing herb on proliferation of K562 leukemia cells
in vivo and vitro．
Methods:Models of K562 － bearing mice were built by subcutaneous vaccination K562 leukemia cells，mice were divided into model，
positive and raspberry low，middle，high groups，each group was given corresponding medicine after vaccination 5 days，observing the
changes of tumor volume，weight and histopathology in each group mice after treated 14days． Observing the inhibition of different con-
centration serum containing raspberry on proliferation of K562 leukemia cells by MTT in vitro．
Results:The volume and weight of tumor in raspberry groups were obviously reduced，there were significant difference between each
treated group and model group;the histopathology results showed that necroses of tumor cells in each dose raspberry group and Ara C
group were more than that of model，swelling ，clasmatosis，dissolution and disappearance of nuclei were appeared in each medicine
group． The seropharmacology results showed that 10% and 20 % serum containing raspberry could obviously reduce the colony forma-
tion of K562 leukemia cells，that was in a dose － dependent manner;10% and 20 % serum containing raspberry could inhibit the pro-
liferation of K562 leukemia cells．
Conclusion:Japanese raspberry herb can significantly inhibit the growth of tumor in K562 － bearing mice，10% and 20% serum con-
taining raspberry can inhibit the proliferation of K562 leukemia cells in vitro．