全 文 ：生物物理学报 第九卷 第四期 1 9叹 ;年 U月
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用荧光漂白恢复技术研究竹红菌乙素在小鼠
肝癌细胞内的扩散过程 *
乐加昌 王文玉 江 王栋 傅世密 庞素珍
( 中国科学院生物物理 所 北京 l的 !1 ) 0
摘 要
利用竹红菌乙素自身的 荧光特征 . 在 F R P装置上直接测 定了 乙素在 A H细胞内的侧 向扩散系数
和灸光 漂白 的恢复率 。 实验结果表明 乙素在 A H细胞内的扩散系数 D= 2 3` I Jg cn f 性一 }荧光漂白恢
复比 率R = 7 9. 8% 。 上述 实脸说明 乙素在细胞膜 内与生物 大分子之 间没有形 成共价健形式的结合
状 态
关键词 : 竹细菌 乙素 荧光漂白 肝癌细胞
竹红菌乙素是扎醒类新型光敏色素 , 它进人细胞后主要聚集在细胞膜 内 lt , 并 被认 为是一
种潜在的光动力治疗的敏化剂和优 良生物大分子的荧光探针 2[] 。 我们在前几篇文章 中研究 了
乙素在细胞内对膜蛋白质荧光拌灭的机理 , 提出了乙素不仅是一种光敏化剂而且也是一种优
良的膜体系蛋白质动态荧光碎灭剂网 。 本文利用乙素 自身的荧光特征 , 在 F P R 装置上直接测
定了乙素在细胞膜内侧向扩散系数 , 荧光漂白恢 复率 ; 并用荧光显微镜观察 了乙 素在细胞 内
的分布 。 上述观察与分析有助于了解乙素在细胞膜内的物理行为 , 进而为推进竹红菌素 作为
生物大分子的荧光探针的应用提供实验证据 。
材料与方法
一 、 F 】砚 装置由光学和电子学两部分组成 : 氢离子激光器经落射线荧光显微镜可聚光斑
直径 5产rI n , 功率 lm w , 漂白时间 25 此 ; 荧光漂白剂 : 则利用乙素 ( H B ) 自身高灵敏度发射荧光的
特征 , 在 4 8 nl 波长条件下激 发
,
6 (X )n m 以上荧光信号由高灵敏度光电倍增管检测 ; F P R 系统
数据由微机对于实验结果进行理论拟合 。
二 、 细胞处理 : 小鼠腹水肝癌细胞培养在小 鼠腹腔中 6 一 9 天后取 出 , 用 P B S中H = 7 . 4) 洗
涤三遍 , 并配成 l ` or 6ce l问 的细胞悬浮 。 在一毫升的细胞悬液 中加入 2~ l瓜 (2 伽1 H )B
, 溶
液中乙素终浓度 : .0 以召m o l压 ;在室温条件下 放置一分钟后 , 在 2 (X洲) r /m功 离心洗去多余 的乙
素 。 用 PBS 将细胞配成测试液 , 直接在 F P R 上测定 。
三 、 试剂 : 乙素按文献 15 方法制备 , 并经 H ’N M R 方法测定和文献值一致 , 其它化学试剂
均为国产分析纯以上的产品 。
实验结果与讨论
一 、 化学恢复的排除
在 xA e h o d 的 F PR 理论中 , 一个重要的条件是荧光剂的化学恢复可 以忽略 , 否则 F P R 理
论和数学分析就不可能适用 。 由于用 乙素直接作为荧光剂的荧光漂 白恢复实验未见 文献报
导 , 因此必须对荧光恢复过程中是否存在化学恢复进行实验观察 。 本实验以 聚苯乙烯 薄膜 作
* 本项目为国家 自然科 学基金资助项 目。
生 物 物 理 学 报 l卯 3年
为固体支衬介质 , 薄膜厚度 0 . 1土 o . 05 n 卫n , 滴加含乙素的三氯甲烷溶液 1
~
L飞 ( 10间 待干燥后
加上盖玻片在 F P R 上测定 , 结果见图 ( 1) 。 从图可 见乙素的荧光未漂 白前为强度 10 % ; 经激
光漂白以后在固体的介质中立即下降至 10% 左右 , 而乙素的 F (0 )/ (F )t 荧光恢复在这里几乎不
存在 , 因而不会影响下面的实验结果的可靠性 。
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二 、 典型的几(t) 的实验曲线
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、 在 A B 细胞内
荧光相对强度以荧光百分数 ( F 厂。)和时间的关系由下式给出 :
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式中 : D = 。谈 D 是特征扩散时间 , 。 = 样品上激光光斑的半径 , D 二 荧光分子的侧向扩散
系数 , 只 = 漂白前的原始荧光强度 , K 二 漂白参量 。 荧光恢复比率 (R )用 :
R 二 ! (F 黄卜 (F 0) r r[ (t < 0) 一 (F 0) 〕 公式计算 ,
扩散系数 D 用 D = 冰沪4t l : 公式计算
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生 物 物 理 学 报 1叨 3年
受 到了严重 的阻碍 , 有文献 报导 D P PC 在膜 内 以 凝 胶 状 态存 在 , 荧 光 漂 白扩 散 系 数约
10
一 ’认污一 ’ 很小性( 3) 存在着蛋 白质大分子等的阻碍作用 ; ( 4) 存在着乙素分子的复合物状态 : 按
文献【10] 的结论在我们的实验浓度范围内形成乙素分子激基复合物是可能的 。 另外我们从荧
光照相观察到的 乙素在细胞内聚集状态是否也可能与激基复合物的存在有关有待进一步研
究 因此按照在膜 内容易形 成乙 素激基复合物的观点解释 (或者容易形成某种聚集态 复合
物 )后其荧光的漂白扩散系数要比乙素单体扩散系数要慢也是很容易理解的 ; ( 5) 有关乙 素光
敏损伤能否 引起 乙素在膜内的扩散系数减少 . 这里我们可 以引用文献 {川 用 F仃C 荧光探针的
实验结果来说明竹红菌素加 入前后 , 并不改变细胞膜蛋白的扩散系数 口
综上所述 , 我们不仅可以看到乙素在细胞膜内扩散过程中的物理状态 , 同时另一个重要意
义是乙素可 以在膜内作为一种生物大分子荧光探针在细胞水平上作出了证明
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本文 于 1卯 3年 2 月 16 日收到