全 文 ：第 6 卷 第 4 期
9 1夕 0年 1 2月
生 物 物 理 学 报
A C TA B IO H PS YIC A SN I IC A
Vo l
.
6 N o .4
D c e
.
19 9 0
竹红菌甲素与半肤氨酸作用的 ESR研究
孙继山 张 莉
(中国科学院生物物理所 )
摘 要
本文用 S ER方法研究了竹红菌 甲素和半跳氨酸在光和暗条件下产生活性氧的过程 .我们发现
甲素具有氧化还原反应 中间载体的作月 , 即硫基化合物将 甩子转移给甲素 , 而 甲素在有氧的条件下
再将电子转移给氧生成超氧哭离子 自由基 . 光照 可以 加快这 一步骤 , 使用化学方法定量研究 证明激
发态 甲素与半脱氮酸的反应速率大于基态甲素 . 除半 臃氨酸外 , 琉基乙醉和还原 谷眺甘胧均 可以将
电子经甲素传给氧 , 而 甲硫氨酸 和脸氨酸不具这一 能力 , 这说明琉基在反应 中很重要而硫原子不是
必需 的 。
引 言
竹红菌甲素汗于y ) 以丁e l il n 入 ) ` 以下简称刀素 了于认 ) 是我国 首先发现并用于临末的 光故 化
剂 , `已具有激发能量低 , 不易 自敏氧尤 可见 区消光系数大筑许多优 良性育妙 l 、 王家珍等 人研究
证明甲素对细胞光敏作用的主要位点是细施摸民 : 红细胞 膜蛋 日 光敏须伤后的氨基酸分析表
叼半跳氮敌是是易氧化的氨墓酸之一卿 . 我 , _「一 了一 有鱿 二究 少戈 戈纤 绝 龙摸 : 臀 , 转 引是找丛
酶 . 刘甲 索皱敏感 一 下仪郊此 . 在黑啼条件下 下索 牙这圣矜 ·下月也去 泛其戮分失 活试 _ 润此 `
为进一步弄清甲 素对纸绝的佗 甲叽制 ` 右 .之` 要说 书 杯索 衬乍丛筑 : L· 下 了 ’ 一 瓜实验 犷 石 王 就是
通 过 E S R 力` 法视步 于究 下素与半 洗氨酸及其它 r乙劫疏 鉴 伙兮找日 相 互 佗 月声 生活 件 试白L
过程
材料与方法
1
、 试剂
甲素由云南微生物所提供 , 经进一步纯化后使用 : 5 , 5 一 二 甲基 一 l 一 毗咯琳 一 氮氧 “ 合
物 ( D M P O 、 叼 idr hc 产品 ; 使月前用活性碳纯化 : 氮蓝 四坐 ( N B丁 ) , F luk a 产品: N 一 特 丁丛
一 : 一 苯基硝酮 ( P BN 少, S ig Tn a 幸品 ; 其余试剂均为国产分析纯或 层析纯试剂
2
、 方法
门 ) 化学法测 O : 主要参见 M il eT 方法田 : 匀灯机光源照到百灭 泥色杯 中鱿样 异 仁几 生币
B、叮 一眨叫 辐射仪测光强为 3加认产 M 二, 使月日 立 U 一 3 20 0 分光光 支计住 5掀 lm 灶戈尤吸
收 。
( 2〕E S R 样品测试时用 I K认尸氨灯平行光源照到距光源约一 未鱿洋打; 胜 勺、 祥品装人 石英
毛细管内 。 使用 V iar an E 一 109 波谱仪 , X 波段 , 烦率为 9 125 M H乙 欲 率为 1仪 n w , 其它条件
视具体情况而定 。 除特别注明外 , 样品测试前通氧 。
所有人射光均使用截止频 率为 《 众m l 的滤色片滤去紫外光 甲素溶于二 甲亚 砚 , 其余试
剂溶于水 , 除特别说明外 , 二甲亚讽与水的比例控制在 :3 l( 丫 V )
其它条件见图注 ,
生 物 物 理 学 报 1夕剑 )年
结 果
1
、 光照条件下甲素与半眯氮酸反应的自旋捕捉 ER S波谱
图 (l )是光照不同时间的 S ER 波谱 , 由图可见光照 10 秒至 2 分钟 , 捕捉信号主要为呀
和 · O H 的合成谱 , 并以 O歹为主 , 信号强度呈先增加而后降低的趋势 , 从 2 分至 2 分 40 秒活
性氧信号明显下降 , 甚至消失 , 而后出现 6条峰信号 , 该信号较稳号 , 而且随着光照时间延长 ,强
R 吕 1. T氏 SE R s详成ar at in id以ed
1卫u r n m a 扫。 n it n n e . 丁七e so1 U石o n
co n倒他 工加 ~ o1
产
L D M P O
,
肠 订 lm ol L H A an d 6 ~ o1 L
cy s et l n e
.
度不断增加 。 经测量 , 翰 = 15 . 3G , a H = ZI . SG .
2
、 甲素与半胶氮酸及其它几种含硫化合物暗反应的
公浓 波进
我们在黑 暗条件下观察 甲素与半 肤氨酸的反应 。
结果如 图 ( 2) 所 示 。 在黑 暗条件下 , 将甲素溶液与半
耽氨酸溶液混合后很快就出现 E SR 信号 , 但在 10 分
钟之内信号形状没有太大变化 , 在 30 分左右 , 出现 6
条峰 , 而在光照时 , 这段时间仅约 3分钟(见 图 1 ) .
除半肤氨酸外 , 我们还 试验 了疏基 乙醇 、 肤氨酸 、
还原型谷脆甘肤和 甲硫氨酸与甲素的暗反应 。 结果如
( 3) 所示 : 甲硫氨酸和胧氨酸在无光条件下与 甲素作用
没有信号 , 光照有信号 , 但同仅有 甲素的体系基本相
同 。 还原型谷肤 甘肤和琉基 乙醉均有较强 的信号 , 出
现 6条峰的时间分别约为 10 分和 5分 , 均 比半 胧氨酸
提前 , 本实验说明反应中硫原子不是必需的 , 而琉基是
很重要的 。
ùó了é一\ì一J了ù
以肋附斤
门尸右日
J )
`
/
{
~ 产J 浏 {
urDb叨几江、n讼
R各 2 1址 SE R s详以 r a of 而袱泣 H人
助 d ysC et i批 50 1西 o n at in id ca 文ed it me
比 山对t ilA co 侧即 n e n st of rn i x ed s ol u 一
石印 沈 het , ” , e as lF g L
iF吕 3 . 1’h e ES R s , 戈 tr a of sol 曲。 sn co n面面 n g
( A ) 6 m
o l / L邓石ne, ( B ) 6 mnt ol , L m ct hj o 一
( C ) 1 m
o l / L me 哪 p t oe t比川 0 1 an d
6 ~ o1 / L
r de u “ 月 gl u at 血On 。
co n ce n tr 曲 o ns o f H A an d D M代 )
飞 己汀k 闷
ar e t he
as iF 吕 I lA 此 级 m lPes w e er de et tC de Z
n 刀 n 以伪 峨 c r m认 j赐
第四期 竹红菌甲素与半耽氨酸作用的 F S R 研究 拓8
3
、
6条峰的鉴别
前面提到 : D M P O 除捕捉到 O歹和 · O H 外 , 最后得到一较稳定 的 6 条峰 E SR 波谱 , 这
可能属于 D入I PO / C H犷, 甲基来自 D M S O 的断裂 , 乙 睛溶液中得不到这个 6 峰 。 ( 图 4 A ) 为
了进一 步确认 , 我们使用 另一 种捕获剂 P BN, 结果如 图 ( 4 B )所 示 . 经测量 , a N = 14 . 8G ,
a H 二 1 . 8 G , 若考虑到溶剂效应 , 这个值与 S a p ir n 的结果基本一致阎 。
日一
1汰曰l

12
一 ~ -夕 一 _ _ 琳
.l n
.护川
l
一
l
。下!
娜叫曰一 一 几功洲人`~ 气厂一扮尸
iF 吕 4 T卜e E SR 幻即司 5 o f h y dr ox ) ,1 r ad i司
atr p pe d iw ht 10
门n r 口0 1/ L D M I均 i n 暇 一
to 而 itr l i /比0 s o l iut o n ( 9 1 , V , v ) ( A ) 即d
二ht ly r动司 加 p详 d 诚 ht Z飞厂耐 PB N谊 D 、 15 0 /氏 0 50 1叻 o n ( 3: 1 , V / V ) ( B ) .
丁七e Oo n o e n tr 动的 of HA 访 ht o s e t w o
s a n口lP es 讥吧 r e 0
.
5 几 u n o l/ L 叨d rceo r d de
aft er 3 而 n u让污 沮飞止n 玉朋石。几
t l吕 勺· ( A ) hT e ES R s户工 tr u m o f e y s et i讹一 n d u c团 荃于A
~
q UL n o ne r ide 喇 i n deo x y id 尤d s o liut o n co n恤几 n g
6 ~ ol
厂L C y st el n c an d 0
.
5 On r n o厂L H A
( B ) 3 二 n此 叭 e r 而拓鸣 H A an d c y s et inCs o lut io 几 D M (P 〕腮 目山刃 an d o x y多m w as b u b b lde5 im ul t叨c o囚 ) an d t h e n E SR S详成nj m w as r以旧 r de 己
( C )划 P r~ 洽 an d co m po n en st 忧 er t h es
am
e as B b以 i n ab s e n ce o f H A
4
、 反应机理的初步探讨
( l) 无氧条件下甲素与半扰氮酸的作用
图 ( SA )是暗中 、 通氮 、 不加任何捕捉剂得到的 E S R 波谱 : 甲素与半 恍氨酸混合后 , 了呈快
就出现这一 ES R 信号 。 在反应初期 , 信号随着时间延长 而不断增 加 。 待基本平衡后 , 我们观
察信号强度与微波功率的关系 , 经分析 , 饱和功率约 3m 认产, g 值为 2 .的 3。 由此 可推测 二信号 ` J丁
能出自半醒 自由基门 。
( 2) 半醒自由基到活性氧的转换
我们设计这样一组试验 : 先在无氧条件下使半肤氨酸与甲素反应产生半酿自由斌 图 S A 〕,
方法如前所述 , 然后迅速地通氧并加人 D M P O , 并立即测量 。 由图 ( S B ) 可见 , 原 半醒 自由基
信号已经消失 , 同时出现活性氧自由基信号 。 这说明半醒 自由基已将电子转移至O : 主成 了O 三。
如梁去除甲素 , 虽有信号 , 但浓度很低 ( 图 SC ) , 这意味着 甲素在半恍氨酸将 电子转移给氧的过
程中起重要的介导作用 。
( 3) 甲基自由基的产生
因为反应液中有相当 比例的 D M S q 该 C H犷可能来自 D M S.o 其中最常见的是阴禽子 自
由基和 · O H 对 D M SO 的攻击卿 ]。 张志义认为甲素可产生阴离 子 自力基臼 ] , 那 么 C H犷是否
由该自由基攻击 D M SO 产生的? 我们在无氧体系中照射 ! O分钟 云 , 结果只是前面提到的半
自由基越来越强 , 而没有任何 D M P O厂C H : 的信号出现 , 根据 H a be r 一 认傲s 反应 系理 : 加八
F扩` 可有利于 O歹~ · O H 的转变 , 但实际上 (图 6A ) : 加 、 :-[于 一后 不产生任河信号。 经分析
(另文发表 ) , 这主要由于斤 + 与甲素整合 , 阻碍了半肚氨酸向甲素的电子传递 , 没有 H A ·也就
没有 O三加人介 十 鳌合剂 E D T A后 , 很快出现信号 (图 6 B ) , 使用另一种鳌合剂 D T PA 反应 比
E D丁A 还快 . 这说明鳌合形式的扮 ` 可增加 · O H 的数量 , 从而增加 C H ` 的浓度 。
生 二 二 学 报 1夕哭 )年
尸 C印灿甲三,卫v
, 丫尸尸
扔卜 /
/
, _ 、 ,二
/
_ ,一贾牙才一
曰各丘 , n 蛤 ES R 匀万优I’a at 1. 出。 扛幻 山切加拢山曲
6
” , 巴
( A ) 飞、亡 印口拼泊团 . in 刘 J d闭 坑 此
~
aS 月9 1施 4 m m d / L eF O : in iL
( B ) S山此 as A ex eC伪目 吐坦丈 凡O Z aws比侧. 以月勿 1 nI m ol / L E D汀A
R吕 , . 月汤叮 b石, 词。 吐 肠加 . in D M os /H户
(:1 免V /y) osl 曲溯 叨面 in gn 印 产川 1 0!压
N E双 1 4 m lr O l z ; L哪侧 .en
( A )。 幻仃 of (加 H A a dn i n 山盯 k )
( B )口 n因面邓 2 3阿On 】/L H人 i n d ar .k
( C )组找` as B b ut i r . 山助司 侧 ht vi 幼 bl e
1电比 at 义刀 W /M之
( 4 )甲素的氧化还原作用和光敏作用
前面已经证明 , 在黑暗条件下 , 甲素介导的半脱氨酸到 O : 的电子传递 , 并且光照可以促进
这种作用 . 由于用 SE R 方法难以定 t , 所以 , 我们采用化学方法初步研究了甲素的介导作用
和光促进作用 . 由于在上述 E S R 反应体系中半耽氮酸和 N B T 反应极快 , 不易测 量 , 所 以 , 我
们增加了水的 比例 (见图注 ) . 由图 ( 7 ) 可见 : 加人甲素可增加 , 再加光后可进一步增加 o 歹的浓
度, 在该条件下反应速率分别比只有半耽氮酸的体系增加 40 % 和 92 % 左右 . 这进一步证 明 ,
甲素具有电子循环载体和光敏剂的双重功能 . 进一步分析 , 两种作用不是简单的相加 , 而是协
同作用 .
讨 论
甲素的研究无论是临床还是理论 , 以前主要集中在光敏活性上 . 本文利用 ES R 和化学方
法同时研究了甲素在暗和光条件下对半耽氨酸的作用 , 上 面的结果初步证 明了琉基化合物 比
较容易将电子传给甲素 , 而 甲素在有氧的条件下 , 再将电子传给氧生成超氧阴离子 自由基 , 这
除了氧化还原电位这一因素以外 , 还可能与琉基有关 , 因为我们加人较强还原剂 vi t C 后并没
有捉到活性氧自由基 . 有些抗癌药物 , 比如道诺红霉索 ( aD oun 几肠d n)
, 伪 x o n 山id n 等在化学还原剂的作用或醉的作用下可得到稳定的半醒 自由基 l[ `〕. 而甲素的功能团与这些抗癌药的
功能团很相似 . 琉基化合物做为底物使酿还原成半酿自由基并进而将电子转移给氧生成 贾 也有报道以切 . 根据这些报道和甲素的结构 , 我们推测 : 甲素和半脱氨酸等琉基化合物作用产 生
活性氧的过程也是通过类似的电子传递 . 在通氮条件下 , 由于没有电子受体 , 得到 的 自由基 较
称定 , 它的稼定性是由于内组键所致 , 其原因是氢原子在相邻氧原子上的交换引起 的离域作
用洲 . 加人金属离子 , 比如 F扩+ , M才十等使氢键破坏 , 因而即使在通 氮条件下也 没有稳 定的
自由基信号 , 除此之外 , 激发态甲索也促进活性氧的形成 。 C滋r 苗由ale 使用 E SR 自旋捕捉 的
第四期 竹红菌甲素与半耽盆酸作用的 S E R研究 7 4 0
方法也发现道诺红霉素具有光敏促进作用 〔国 , 由于 E SR 用于定量的某些 限制 , 我们采用化学
方法进行定量分析 , 结果表明 : 不仅有光反应 , 也有暗反应 , 二者之间呈协同作用 .
Buet t川沈 在水溶液中研究血叶琳衍生物与半肤氨酸的光敏反应中 , 用 D M P O 捕捉到半胧
氨酸自由基 , 我们也曾试图在我们的体系中捕捉这一 自由基 , 但没有捉到 。 这可能与不 同体系
有不同的反应途径和反应速率有关 。 从时间进程来看 , 最后得到的是 甲基 自由基信号 , 试验证
明 C H 3.是 由于 · O H 攻击 D M SO 所致 。 在有还 原 剂的 情 况 下 , 鳌合形 式 的 F矛+ 可 促
进 · O H 的形成 , 这方面 已有报道。 8] . 随着反应的进行 , 呀 和其他自由基与 D M P O 的加成
物逐渐地被半耽氨酸和 O牙还原 , 但由于 甲基 的位阻效应 , 使 D M PO /C H g寿命延长 , 这解 释
了为何在反应后期 E S R 信号只有 D入I P Q / C H ;而没有其它信号 。
参考文献
[1 ] 安睁仪 、 张曼华 : 《科学通报 》 ,拟 18 ) , 198 5, 139 7
〔刀 王家珍 、 程龙生 : 《 生物物理学报 今, 叉1) , 198 7,科
3[〕 程龙生 、 王家珍 : 《实验生物学报 今, l议1 , , 198 5 , 豹
[’] 孙继 山、 程龙生等 ; 《实验生物学报 》 , 戮 4) , 1如9 ,4 23
[习 M . W, 肠 11改 C a n . J. hC既 , 48 . 1970, 935
〔司 入 N · 翻州 n an d L H eP沈 A rC h . 压 oc l℃ n l . 氏 oP 卜)、 , 1阶 , 19 ,爪铭〔
阅 赵保路 , 听文娟等 ; 科学通报》 , 从 10 ) . 1989 ,触〕
〔8 ] L M T o l lx 滋 : J 入m . hC 既 反父 . . 1叮 12 ) . 1叭8、 395 2
三9」 G R . B u : t加汀 e t al P h o饮 h川 : p h o t o bl o l二 溉 . 1夕一 9 . 毖马3
f工0] 袱 去又 减伦 义等 中国私学 ’叫 B , 、 蒸 西期 . 1蛇久36 1
[1 1 ] G P
o 、 15: F艘 R 〕d j司 iB o l 卜I比 , 氏1989 . 63
〔12] H T 政曲以幻 et 公 A比 h . 压二d lcrL 压叩h终
,
25 众 1) 19 5’ .封
〔13〕 T G 习J , t F E B S Ld L . 为 1、 198 6 .2 巧
仁拼〕气 七 han 脚 以 aJ . iB 汉比队 压 。 ph ): . A: 认阴 1. 诊抖 、 3鱿
二1习 入 J . C肛 rnj ch 目 改 公 F王BS 玫比 1拼 ` 19 幼 构 1
仁工幻 气 S印粗 ;扭 以 :al F吠 伯 d j园 肠 。 1. M吐 反19胆 , 14 1
仁17] G . R . B鱿 t饥比 几 B S 比 t , 117 , 1985,汾5
二; 8」K . R岌之上a o t 公: p h o以 h呱 P h o ot 丘0 1. , 今 S J 1988 , 6艺
T f伍 g r U D Y O X T H E 入I EC H A 入15 、 15 O F R 人D 百〔 ’ . 、 L
R E 人C T IO 入 B E T认 F E N 不一I 人 `人、 D ( {飞-S r E I、 下 卜
FO R人I A I 一 IO N 八 一 r 卜{〔
T 11五 P R E S E \ 犷 `
S以 J ` s h山 1 泛l 七、已 几
(介义 犯 .t, cJ/’ 及 c声川。 . A“ d c 7n版 9 二二一 弘 朔乡 、 介羌一乡 . 、 一 几
入 BS I一凡、 (了
一几 e m ce h川弧 。 f ar d朋 1 9扭沉 1t 洲 ;侧 h洲 `成 t「 、川 ` , ’ ” 一 曰以 州 d叮 5eT ;配 此代 ! n -
\ se t一g a tde 认 i由 E SR a n d : h印 1一以 1 tce }、、 、一q : l。 、 、 ? : : ;一: 、 犷: p : 犷 一 f i飞。 ; 。、 l d州肠 s h o 讯阅 ht a t H A
a c tde as
a m曲 a t o r 一n th e 耐 o x C , 、 l一n g 、 一 ;: . o lo c t兀, 。 :石 认盯。 t r a n s即 rt 树 fr o m s ul 币) ’d n , l
4 7 1生 钧 物 理 学 报 1 9引〕年
o c咧PO 训山 t o I }A, an d in tu r l、 政 a班幻 ot o x y gen fo m u gn s u p沈 xo ide a in o n ar d阔 i n da 氏而 5 Pr 0 O巴洛 can 悦 即恤 1箱记 b y il l u丽 an it o几 W e fo皿 d s” ev g e iact o n w er e x is t记 be -七刃戊泊 r ae ict on in da xk a dn in il hg L w h i山 s otr 叼 y s u g se回 hat t xe比 de H A aer ict gn
就 ht c sy肠拙 wo dlu be afs 渝 th an ht at of H A in g or un d ast .et B路 i此 哪俪 n几
住坦代之 p tco itL an ol a l记耐 u“ 幻 gl aut iht on e ~ a lsO aC aP lb e of d en iot gn ht 改 le川 or sn oto x y g m m。五 a喇 b y HA , b u t i t was 越 Iuer in het c a s e o f cy s t i n e a n d 厅七 t衍o in叭 w扮hc in -
id aC以 hat t s lu hf ydyr l脚 u sp ~ 加p r o加m t in het aer 川 on ar ht er th an slu f u ir o at 。、
广东省生物物理学会成立
报导 :
19如年 12 月 1 日上午 , “ 广东省生物物理 学会成立大会 暨第一届学术会议 ” 在华南师范
大学召开 . 中国生物物理学会及广东科协 、 广东电子学会 、 广东物理学 会 、 广州市 仪器仪 表学
会 、 广东生物学会 、 广东光学学会等上级机关和兄弟学会的代表到会祝贺 , 华南师范 大学 副校
长王开发副教授到会祝贺并讲话 。 与会会员代表印 余人 , 选举产生了以刘 颂豪教授 为名誉理
事长 、 熊钮庆教授为理事长的第一届理事会 。
广东省生物物理学会的宗旨是促进广东生物物理学工作者的学术交流 , 团结同行为广东经
济建设作出贡献 .
(广州华南师大物理系 熊建文供稿 )
本文于 1佣 9 年 10 月加 日收到 .