全 文 ：　第 37卷第 6期
　2007年 12月
工 业 微 生 物
Industrial M icrobiology
　Vol.37 No.6　
Dec.2007
作者简介:王淼(1962～ ),女 ,博士 ,副教授 ,研究方向为食品生物技术。
马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kef iranofaciens)产生的
开菲尔多糖的分离及其结构特性
王　淼 , 　毕　洁
(江南大学食品科学技术国家重点实验室 ,江苏 无锡 214122;
江南大学食品学院 ,江苏 无锡 214122)
摘　要　　研究了 Lactobaci llus kef iranofaciens 发酵产生的开菲尔多糖的初步纯化方法 ,并对开
菲尔多糖的分子组成 、分子量以及单糖之间的连接方式进行了研究。研究结果表明 ,采用酶解与
Sevage试剂相结合的方法进行纯化 ,当蛋白去除率为 93%时 ,多糖得率 60%,样品中多糖的百分含
量为 96%。采用 HPLC和红外光谱研究表明 ,培养基的组成会明显影响开菲尔多糖中葡萄糖与半
乳糖的比例 ,由 MRS培养基发酵产生的 KEFⅠ的相对分子质量约为 2.4×105Da ,葡萄糖/半乳糖
约为 1:4;而由改良的 MRS 培养基发酵产生的 KEF Ⅱ的相对分子质量约为 1.5×105Da ,葡萄糖/
半乳糖约为 1:10 。Lactobaci llus kef iranofaciens发酵的开菲尔多糖分子中均含有 β糖苷键。
关键词:Lactobacil lus kef iranofaciens;　开菲尔多糖(kef iran);　分离;　结构
　　许多细菌在生长过程中产生的胞外多糖具有重
要的生理和生态功能 ,特别是一些乳酸菌的胞外多
糖具有抗真菌 、抗细菌和抗肿瘤的特性 ,在食品和医
药行业具有潜在的应用价值。 Lactobaci llus kef ira-
nofaciens是从乳酒的起始培养物开菲尔粒(kefir)中
分离出来的一株乳杆菌 ,它能产生一种被称为 kefi-
ran(中文译为开菲尔多糖)的胞外多糖[ 1] 。开菲尔
多糖是一种水溶性的中性支链多糖 ,分子量大约在
1.0×106左右 ,含有几乎相等的 D-葡萄糖和 D-半乳
糖残基[ 2] ,在含醇的水溶液中具有很好的抗水解能
力。开菲尔多糖在食品上不仅用作增稠剂 、稳定剂 、
乳化剂或胶凝剂 ,而且具有抗菌 、抗肿瘤活性[ 3] 。
由于开菲尔多糖是由食品微生物产生的 ,在食品中
应用具有良好的安全性 ,近年 ,研究者采用微生物发
酵生产这种多糖[ 4 、5] ,以便开发和应用。
　　本文对在一定条件下 Lactobacil lus kef iranofa-
ciens发酵产生的开菲尔多糖进行分离纯化 ,研究了
分子量 、葡萄糖/半乳糖和单糖连接方式 、结构和组
成 ,并对不同培养基组成下得到的开菲尔多糖的结
构等进行了比较和分析。目前在我国关于开菲尔多
糖的发酵和分离研究尚未见报道。
1　材料与方法
1.1　材料
　　乳酸菌 Lactobacillus kef iranofaciens JCM 6985T ,购
于 Japan Collection of Microorganisms。经在MRS基本发
酵培养基和改良的 MRS培养基(以麦芽汁为碳源)中
发酵得到含开菲尔多糖(KEFⅠ和KEFⅡ)的培养液。
主要仪器
仪器名称 型号 产地
旋转蒸发仪 RE52CS (上海亚荣生化仪器四厂)
高效液相色谱仪 Waters 600 (美国 Waters公司)
示差折光检测器 Waters 2410 (美国 Waters公司)
傅里叶红外光谱 NICOLET NEXUS 470 (Thermo电子公司)
1.2　方法
1.2.1　多糖的测定
　　蒽铜-硫酸比色法 ,按文献[ 6]
1.2.2　开菲尔多糖的制备与提取
　　Lactobacil lus kef iranofaciens JCM 6985T菌在
MRS基本发酵培养基和改良的 MRS 培养基中
30℃静置发酵 4d ,发酵液经离心除菌体 、乙醇沉淀 、
干燥即得开菲尔多糖多糖粗品。
　　MRS 基本发酵培养基(简称 MRS 培养基):改
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良的 MRSL 培养基[ 7]
　　改良的 MRS培养基:可溶性固形物含量 8%的
麦芽汁中添加 10%酵母粉 , 0.4% KH2PO4 , 0.1%
MgSO4·7H2O ,0.02%MnSO4·4H2O ,添加量均为体
积重量百分比(W/V)。
1.2.3　脱蛋白方法
1.2.3.1　三氯乙酸法
　　将开菲尔多糖多糖粗品溶于水 ,在样品液中加
入不同体积的 2%的三氯乙酸 ,使三氯乙酸溶液在
混合溶液中的浓度分别为 2%～ 50%,振荡均匀后
于 4℃下静置过夜 ,离心 ,上层水相即为去蛋白后的
糖溶液。
1.2.3.2　Sevage法[ 6]
　　将氯仿与正丁醇按体积比 5:1 混合 ,即 Sevage
试剂 ,将其按样品液体积的 1/3加入 ,混合物经剧烈
振摇后 ,蛋白质与氯仿-正丁醇生成胶状物 ,用分液
漏斗分取脱去蛋白质 。反复多次 ,直至丁醇氯仿层
不形成混浊为止 。
1.2.3.3　蛋白酶法
　　加入一定量的碱性蛋白酶 Alcalase 后 , 调节
pH8.0 ,于 55℃酶解 5h。
2　结果与讨论
2.1　开菲尔多糖的分离
　　有机溶剂沉淀的多糖中一般含有蛋白质 、色素等
物质 ,常用的多糖脱蛋白的方法有 Sevage法 、酶解法
与 TCA法。本论文对这三种方法分别进行了开菲尔
多糖的分离纯化 ,具体实验结果见图 1和图 2。
图 1　TCA 脱蛋白的效果
图 2　酶解与 Sevage法脱蛋白的效果
　　图 1 的结果表明 ,采用 15%的三氯乙酸处理
时 ,蛋白去除率较高 ,达 95%以上 ,但多糖的损失率
也较高 ,原因可能是由于静置过程中部分多糖发生
降解或随着蛋白的沉淀而发生夹带沉淀。此外 ,
TCA 浓度较高时 ,蛋白去除率不随三氯乙酸的浓度
增加而发生显著变化 ,但多糖损失率会随 TCA浓度
的增加快速下降。由图 2的实验结果可以看出 ,Se-
vage法与酶解法杂蛋白的去除率均在 80%以上 ,但
采用 Sevage 法处理时 , 多糖的损失率却很高 , 达
80%,此结果表明 ,多糖与蛋白质很可能复合在一
起 ,一起存在于变性蛋白的沉淀中。有关这方面的
问题需要进一步研究证明。通过对三种脱蛋白方法
效果的比较 ,采用酶解与 Sevage 试剂相结合的方法
对样品液进行处理 ,可以得到纯度较高的多糖。当
蛋白去除率为 93%时 ,多糖得率 60%,样品中多糖
的百分含量为 96%。
2.2　开菲尔多糖的分子量
　　多糖的性质往往与它的分子量大小有关。本论
文采用高效凝胶过滤色谱法对在 MRS 和改良的
MRS培养基中得到的两种多糖 KEFⅠ和 KEFⅡ进
行了相对分子质量的测定 ,结果如图 3所示 。通过
与标准分子量的葡聚糖(未显示图谱)对照 ,由 MRS
培养基发酵产生的 KEFⅠ的相对分子质量约为 2.4
×105Da ,而由改良的 MRS 培养基发酵产生的 KEF
Ⅱ的相对分子质量约为 1.5×105Da ,可见培养基的
组成不同 ,多糖的相对分子质量有显著差别。
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　第 6 期 王　淼 ,等:马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kef iranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性 第 37 卷　
图 3　KEF Ⅰ和 KEF Ⅱ的高效凝胶过滤色谱图
2.3　开菲尔多糖的单糖构成
　　确定多糖的单糖构成 ,是确定多糖结构的基本
前提 。本论文采用高压液相法对其单糖构成进行了
测定。图 4是两种标准单糖的洗脱曲线 ,由图中可
知:(V t)葡萄糖=12.702min;(Vt)半乳糖=14.307min。
图5是将发酵得到的开菲尔多糖 KEF Ⅱ在水解后
进行高压液相测定得到的洗脱曲线图 ,并将其与经
基本发酵培养基发酵得到的开菲尔多糖 KEF Ⅰ的
水解液进行比较。由图谱可以看出 ,KEF Ⅰ和 KEF
Ⅱ的洗脱中都出现了 2个峰 ,峰 1的出峰时间分别
为:(Vt)KEFⅠ =13.176min ,(V t)K EFⅡ =12.788min;
峰 2 的出峰时间分别为(V t)KEFⅠ =14.911min ,
(Vt)KEFⅡ =14.528min。根据出峰时间可以判断峰
1为葡萄糖 ,峰 2为半乳糖 ,说明这两种开菲尔多糖
图 4　高效液相色谱测定标准单糖的流出时间
图 5　菲尔多糖水解液的高效液相色谱图
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　第 6 期 　　工　业　微　生　物 第 37 卷　
都是由葡萄糖和半乳糖构成的 ,但两种多糖中葡萄
糖与半乳糖的比例不同。KEF Ⅰ中 ,葡萄糖:半乳糖
约为 1:4;KEF Ⅱ中 ,葡萄糖:半乳糖约为 1:10。上
述开菲尔多糖组分的分析说明 ,培养基的组成会影
响开菲尔多糖中葡萄糖与半乳糖的比例 。
2.4　开菲尔多糖的单糖连接方式
　　为了了解开菲尔多糖中单糖的连接方式 ,将发
酵得到的开菲尔多糖样品 KEF Ⅱ进行红外光谱扫
描 ,并与在 MRS 基本发酵培养基中得到开菲尔多
糖KEFⅠ进行比较 ,结果见图 6。在 KEF Ⅱ的光谱
图中:3403cm-1附近出现 O-H 的伸缩振动峰 ,这是
糖类共有的 ,因为糖类存在着分子间或分子内的氢
键 ,O-H 的伸缩振动在 3600 ～ 3200cm-1出现一种宽
峰。2930cm-1处是 C-H 伸缩振动峰 , 1418cm-1和
1244cm-1处所看到的不太尖的吸收峰是 C-H 的变
角振动峰 ,这两组吸收峰是糖类的特征峰 。1700 ～
1775cm
-1没有吸收 ,说明不含葡萄糖醛酸 ,也无乙
酰酯 。1652cm-1处的吸收峰为 C=O伸缩振动 ,但
不是很强 。1045cm-1处比较大的吸收峰是由两种
C-O伸缩振动所引起的 ,一种属于 C-O-H 的 , 另一
种是糖环的 C-O-C 。由于呋喃环的对称伸缩振动 、
次甲基的横向振动和 C-H 变角振动会分别在
937cm-1 、877cm-1和 818cm-1处出现三个尖峰 ,这
三个吸收峰是区别呋喃环与吡喃环的依据 ,因此 ,根
据表 1可以判断 878cm-1处与 809cm-1处分别为 β-
D-葡萄吡喃糖和α-D-半乳吡喃糖的吸收峰 。
图 6　两种开菲尔多糖红外光谱图的比较
　　糖的α-和 β-的端基差向异构体 ,是由端基的 C-
H 变角振动造成的。由表 1可知 , 878cm-1处的吸
收峰表明糖的构型为 β-型 ,含有 β-糖苷键。
　　KEFⅠ的光谱图与 KEF Ⅱ的主要区别有两处:
在 1400 ～ 1200cm-1区域内 ,KEF Ⅰ只有一个很弱的
吸收峰 , 而 KEF Ⅱ有两个 C-H 的变角振动峰;在
905 ～ 876cm-1区域内 , KEF Ⅰ只有一个吸收峰;在
400 ～ 700cm-1之间 ,吸收峰也显著不同。
表 1　糖类各种官能团的红外特征吸收[ 6]
官能团 振动方式 红外吸收(cm-1)
羟基 O-H 伸缩振动 3600～ 3200
烷基 C-H 伸缩振动 3000～ 2800
C-H 变角振动 1400～ 1200
羰基
羧基
酰胺基
C=O 伸缩振动
1870～ 1540
1740～ 1680
1650
醚 C-O伸缩振动(C-O-H ,C-O-C) 1300～ 1000
表 2　几种吡喃糖的特征吸收[ 6]
糖类 特征吸收(cm-1)
β-D-葡萄吡喃糖 905～ 876
α-D-半乳吡喃糖 839～ 810
表 3　吡喃环的特征吸收[ 6]
振动类型 特征吸收(cm-1)
α-端基差向异构的 C-H 变角振动 844±8
β-端基差向异构的 C-H 变角振动 891±7
2.5　开菲尔多糖的特性粘度
　　采用改良的 MRS 培养基发酵 ,开菲尔多糖浓
度与粘度的相关分析结果见图 7。图 7 的结果表
明 ,开菲尔多糖溶液的浓度与比浓粘度呈线性相关 ,
多糖溶液的浓度越高 ,比浓粘度越大 ,当糖溶液的浓
度外推至 0 时 ,开菲尔多糖的特性粘度η为 73.86
[ 100mL/g] 。
图 7　开菲尔多糖溶液的浓度与比浓粘度的关系
3　结论
　　(1)采用酶解与Sevage试剂相结合的方法进行
开菲尔多糖纯化 ,当蛋白去除率为 93%时 ,多糖得
率 60%,样品中多糖的百分含量为 96%。
　　(2)培养基的组成会明显影响开菲尔多糖的相
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　第 6 期 王　淼 ,等:马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kef iranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性 第 37 卷　
对分子质量 、葡萄糖与半乳糖的比例。由 MRS 培
养基发酵产生的 KEFⅠ的相对分子质量约为 2.4×
105Da ,葡萄糖/半乳糖约为 1:4;而由改良的 MRS
培养基发酵产生的 KEF Ⅱ的相对分子量约为 1.5×
105Da ,葡萄糖/半乳糖约为 1:10。
　　(3)Lactobaci llus kef iranofaciens 发酵的开菲
尔多糖分子中均含有 β糖苷键 ,采用改良的 MRS 培
养基发酵得到的开菲尔多糖特性粘度 η为 73.86
(100mL/g)。
参 考 文 献
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Separation and characterization of kefiran produced by
Lactobacillus kefiranofaciens
WANG Miao , BI Jie
(S tate Key Lab of Food Science and Technology , School of Food Science and Technology , Jiangnan Universi ty , Wuxi , 214122)
Abstract　The separation and characterization of kefiran produced by Lactobacillus kef iranofaciens was studied.The
93% protein removal rate and 60%kefiran recovery rate with 96%content could be obtained by using a combination of
enzymatic and Sevage methods.The molecular weight and glucose/ lactose of KEF Ⅰand KEF Ⅱ , produced by using MRS
and modified MRS medium , were 2.4×105Da or 1.5×105Da and 1:4 or 1:10 respectively.Monosaccharide was linked
by β-glucosidic bond among the obtained kefiran.
Key words　Lactobacillus kef iranofaciens;kefiran;separation;st ructure
—20—
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