全 文 ：收稿日期:2014 － 03 － 13 修回日期:2014 － 05 － 05
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD19B03) ;农业部公益性行业(农业)科研专项(200903034) ;福建农林大学 A类毕业生科研
启动基金(132130011)．
作者简介:张洁(1983 －) ，女，讲师，博士．研究方向:植物病毒学． Email:jiezhang3553@ 163． com． 通讯作者吴祖建(1967 －) ，男，研究员，博
士．研究方向:植物病毒学． Email:wuzujian@ 126． com．
福州地区豨莶黄脉病病原的分子鉴定
张 洁，林文武，朱重庆，吴锦鸿，陈晓敏，章松柏，吴祖建
(福建农林大学植物病毒研究所 /福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002)
摘要:为明确引起福建省福州地区豨莶上黄脉症状的病原，利用 PCＲ技术，从 3 个样品上均扩增到双生病毒约 500 bp的特
异片段，选择病毒分离物 Fz02 进行全序列测定．结果表明:Fz02 DNA-A 全长 2771 nts，具有典型的双生病毒的基因组结构
特征，与豨莶黄脉病毒广州分离物(SbYVV-Gz01)同源性最高，达 93．4% ．利用设计的卫星分子的特异性引物，在病毒分离
物 Fz02 中扩增到 betasatellite分子(Fz02β)． Fz02β全长 1359 nts，与 SbYVV 广东分离物(GD13)伴随的 betasatellite 同源性
最高，为 85．3% ．系统关系树表明，Fz02 与 SbYVV各分离物聚类为一个大分支．此外，SbYVV序列变异较大．
关键词:双生病毒;豨莶黄脉病毒;豨莶;序列变异
中图分类号:S432．1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2015)02-0126-05
DOI:10． 13323 / j． cnki． j． fafu(nat． sci．)． 2015． 02． 003
Molecular identification of the pathogen inducing Siegesbeckia
yellow vein disease in Fuzhou
ZHANG Jie，LIN Wen-wu，ZHU Chong-qing，WU Jin-hong，CHEN Xiao-min，ZHANG Song-bai，WU Zu-jian
(Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province / Institute of Plant Virology，Fujian Agriculture
and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:To determine the virus species infecting Siegesbeckia orientalis in Fuzhou，Fujian Province，weed samples showing typical
geminivirus-like symptoms were tested by PCＲ using virus-specific primers． A fragment of 500 bp was consistently amplified from to-
tal DNA extracts of 3 samples with universal primers PA /PB for geminivirus． Comparison of partial DNA sequences revealed that
these samples were infected by a same virus and thus an isolate denoted Fz02 was selected for further sequence analysis． The com-
plete sequence of Fz02 comprised 2771 nucleotides with typical genomic organization of begomoviral DNA-A． Fz02 was most closely
related to Siegesbeckia yellow vein virus isolate Gz01 (SbYVV-Gz01) ，with 93． 4% nucleotide sequence identity． Specific primers
were designed for the amplification of full length betasatellite genome which was then cloned and sequenced． The complete sequence
of betasatellite (Fz02β)was determined to be 1359 nucleotides． Betasatellite shared the highest identity (85．3%)with isolate of
SbYVV (GD13)． Phylogenetic analysis showed that Fz02 clustered together with isolates of SbYVV． In addition，there were signifi-
cant differences among sequences of SbYVV．
Key words:Geminivirus;Siegesbeckia yellow vein virus;Siegesbeckia orientalis;sequence variation
双生病毒(Geminivirus)是一类具有孪生颗粒形态的植物环状单链 DNA 病毒，病毒粒子的大小约为
18 nm ×30 nm，无包膜，由昆虫介体以持久性方式传播，大多侵染寄主植物的韧皮部组织．双生病毒既有单
组份也有双组份，有的单组份还伴随卫星 betasatellite分子(之前被称为 DNAβ) ，并与之形成双生病毒 /be-
tasatellite病害复合体．近年来，随着经济的发展和农产品国际贸易活动的频繁，双生病毒的传播愈演愈烈，
对多种粮食及经济作物诸如烟草、番茄、棉花以及大豆等造成重大经济损失［1］．
杂草分布广泛，适应繁殖力强，是双生病毒的重要中间寄主，对双生病毒的传播扩散、重组变异进化极
其重要．近年来，越来越多的杂草被双生病毒侵染［2 － 5］． 豨莶(Siegesbeckia orientalis)是亚洲地区常见的杂
草，可以在农闲和作物轮作期间繁殖病毒．在我国，豨莶上已经检测到的双生病毒有豨莶黄脉病毒(Sieges-
beckia yellow vein virus，SbYVV)［2，5］、广西豨莶黄脉病毒(Siegesbeckia yellow vein Guangxi virus，SbY-
福建农林大学学报(自然科学版) 第 44 卷 第 2 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2015 年 3 月
VGxV)［6］、中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus，PaLCCNV)［5］，以及中国番茄黄曲叶病毒(To-
mato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV)［7］．据报道，PaLCCNV 和 TYLCCNV 已经对番木瓜、番茄、烟草
等经济作物造成危害［8 － 10］，因此豨莶上的双生病毒应引起足够重视．本研究对福建省福州地区豨莶黄脉
病病原进行鉴定，并对其核苷酸序列变异进行分析，以明确其病毒类型和特性．
1 材料与方法
图 1 表现黄脉症状的豨莶
Fig． 1 Yellow vein symptoms in Siegesbeckia orientalis
1．1 病毒分离物
病毒分离物于 2012 年 11 月采自福州地区的豨莶
样品，病株均表现为黄脉症状(图 1)．
1．2 植物总 DNA提取
采用何玮毅等［11］报道的改良 CTAB 法提取豨莶叶
片中的总 DNA．
1．3 DNA-A全长基因组的克隆和序列测定
利用双生病毒 DNA-A 保守序列设计的简并引物
PA /PB［12］扩增得到大约 500 bp 的 DNA-A 部分序列，扩
增产物经 DNA凝胶纯化试剂盒(北京天根生化科技有
限公司)进行纯化，连接于 pMD18-T 载体(TaKaＲa 公
司) ，转化大肠杆菌 DH5α，利用 M13 引物进行阳性克隆
的筛选后送交上海博尚生物技术有限公司测序．然后根据测得的序列设计背向引物 Sig-Full-F(5-GCCCT-
GATGTTCCTCGTGGT-3)/Sig-Full-Ｒ(5-GTTGGTGACAAGGACAGTTGGG-3) ，用来扩增病毒 DNA-A 全长
序列，克隆方法同 500 bp部分序列．本研究中 PCＲ均使用北京全式金生物技术有限公司的 TransStart Fast-
Pfu DNA Polymerase．
1．4 卫星 betasatellite分子的检测
利用 betasatellite特异引物 beta01 /beta02［13］试图扩增卫星全长片段，但一直未能得到大小为 1． 3 kb
的特异性片段．根据 DNA-A序列同源性分析，利用 SbYVV分离物(GD13、GD24、GD27)所伴随的 betasatel-
lite保守区域设计一对背向引物 betaFz02-F(5-AGCTACGCCGGAGCTTAGCTC-3)/betaFz02-Ｒ(5-AAG-
GCTGCTGCGTAGCGTAG-3) ，扩增得到约 1．3 kb的特异性片段，扩增产物经纯化克隆后测序，方法同 1．3．
1．5 病毒基因组序列分析
利用 DNAStar分析软件(DNAStar Inc．，Madison，WI，USA)中的 MegAlign程序及 Clustal V方法比较序
列相似性．系统关系树的构建采用 MEGA 5．0 的邻近相连法(Neighbor-joining)．通过 NCBI BLAST 查找序列
相似性．采用 Simplot version 3．2软件分析序列重组性．采用 DnaSP version 5．10．01 软件分析核苷酸序列变异
程度． OＲF预测通过在线软件 OＲF Finder程序进行．用于 DNA-A序列比较和进化分析的病毒有越南番茄黄
曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl Vietnam virus，TYLCVNV，EU189150)、越南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl
Vietnam virus，TLCVNV，GQ246941)、海南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Hainan virus，TLCHnV，
FN256261)、豨莶黄脉病毒(SbYVV-Gz01，JX294076;SbYVV-GD27，AM230635;SbYVV-GD24，AM230634;
SbYVV-GD13，AM183224;SbYVV-Fz11，JF682838)、广西豨莶黄脉病毒(SbYVGxV-G111，AM238692)、中国
番木瓜曲叶病毒(PaLCCNV-Fz10，JF682837;PaLCCNV-G12，AJ558116)、泽兰黄脉病毒(Eupatorium yellow
vein virus，EuYVV，AB433979)、雏菊黄花叶病毒(Erectites yellow mosaic virus，ErYMV，DQ641698)、胜红蓟黄
脉病毒(Ageratum yellow vein virus，AYVV，JN809815)、胜红蓟曲叶病毒(Ageratum leaf curl virus，ALCV，
AJ851005)．用于 betasatellite序列比较和进化分析的病毒有广西豨莶黄脉病毒卫星(Siegesbeckia yellow vein
Guangxi betasatellite，SbYVGxB-G111，AM238695)、豨莶黄脉病毒卫星(Siegesbeckia yellow vein betasatellite，
SbYVB-Fz11，JF682839;SbYVB-GD27，AM230645;SbYVB-GD24，AM230644;SbYVB-GD13，AM230643)、一
点红黄脉病毒卫星(Emilia yellow vein betasatellite，EmYVB，FJ869906)、中国胜红蓟黄脉病毒卫星(Ageratum
·721·第 2 期 张洁等:福州地区豨莶黄脉病病原的分子鉴定
yellow vein China betasatellite，AYVCNB，HF569262)、泽兰黄脉病毒卫星(Eupatorium yellow vein betasatellite，
EuYVB，AB300464)、中国番木瓜曲叶病毒卫星(Papaya leaf curl China betasatellite，PaLCCNB，DQ641709)、
金银花黄脉花叶病毒卫星(Honeysuckle yellow vein mosaic betasatellite，HYVMB，JQ728545)、雏菊黄花叶病
毒卫星(Erectites yellow mosaic betasatellite，ErYMB，DQ641713)．
2 结果与分析
2．1 Fz02 DNA-A基因组结构特征
利用双生病毒简并引物 PA和 PB，对3个表现黄脉症状的豨莶样品进行 PCＲ扩增，均得到1条约500 bp的
特异性条带．对该 500 bp产物进行载体克隆，随机各挑取 3 个克隆送交公司测序．结果表明，序列之间相
似性均在 99%以上，此片段与一些双生病毒的部分序列高度同源．选择 Fz02 样品进行全长序列扩增．由
此 500 bp片段设计一对背向引物(Sig-Full-F和 Sig-Full-Ｒ) ，扩增出 1 条约 2．7 kb 特异性条带．全序列测
定拼接后发现，Fz02 DNA-A全长 2771 nts(GenBank登录号为 KF499589)． Fz02 DNA-A基因组结构具有典
型的双生病毒特性，共编码 7 个 OＲFs:病毒链编码 2 个 OＲFs(AV1 和 AV2) ，互补链编码 5 个 OＲFs(AC1、
AC2、AC3、AC4 和 AC5) (图 2A)．在这些编码区之间的基因间隔区(intergenic region，IＲ)内含有双生病毒
复制和转录必需的各种元件，包括一个含有 9 个核苷酸 TAATATT /AC 的茎环结构;TATA Box 位于 2670 －
2675 nts;重复序列 GGTAC位于 TATA Box 5端的 2618 － 2622、2626 － 2630 和 2661 － 2665 nts．
A． DNA-A基因组结构;B． Betasatellite基因组结构;C． DNA-A核苷酸变异分布;D． Betasatellite核苷酸变异分布．
图 2 Fz02 全基因组结构及侵染豨莶的双生病毒核苷酸变异分布
Fig． 2 Genomic organization of Fz02 and distribution of genetic variation estimated by nucleotide diversity (Pi)
for Siegesbeckia-infecting geminiviruses
2．2 Fz02 DNA-A与其他双生病毒的同源性比较
将 Fz02 DNA-A全序列进行 NCBI BLAST检索发现，Fz02 与广东和福建报道的 SbYVV同源性最高，其
中与广州分离物(Gz01)的同源性为 93．4%，与福州分离物(Fz11)的同源性为 91．3%;而与其余双生病毒
的同源性均在 84．8%以下(表 1)． IＲ 区是基因组中变异最大的区域，Fz02 的 IＲ 区有 291 nts，与 SbYVV-
Gz01 IＲ相似性为 86．5%，而与其他相关病毒的相似性均在 79．3%以下(表 1)．氨基酸相似性比对发现，
除了 AV2 与 SbYVV-Fz11 同源性最高(达 96．6%)外，Fz02 编码的 OＲFs与 SbYVV-Gz01 对应 OＲF具有最
高的序列相似性，其中 AV1 和 AC3 的同源性分别高达 96．5%和 96．3%，而 AV2、AC1、AC2 和 AC4 的同源
性分别为91．5%、94． 7%、92． 6%和 90． 7% ． 值得注意的是，Fz02 编码的 AC4 与 SbYVV 其他几个分离物
(Fz11、GD13、GD24、GD27)的同源性仅为 76． 3% － 78． 4%(表 1)． 此外，Fz02 还编码一个 AC5 OＲF(图
2A) ，这在与之同源关系较近的病毒中都未曾发现．而利用 Simplot软件中的 similarity plot和 bootscanning对
相关序列进行重组性分析，未发现与其他病毒重组的信号．
·821· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 44 卷
表 1 Fz02 与其他 15 种相关双生病毒 DNA-A、IＲ及各 OＲFs的同源性比较1)
Table 1 Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of complete DNA-A，IＲ and OＲFs
between Fz02 DNA-A and other 15 geminiviruses %
病毒名称 DNA-Aa IＲa AV1b AV2b AC1b AC2b AC3b AC4b
ALCV 73．8 56．6 93．0 71．6 78．9 59．0 69．4 45．4
AYVV 74．1 45．7 87．9 63．8 85．9 55．6 69．4 78．4
ErYMV 73．4 47．7 92．2 75．9 83．7 59．0 68．7 69．1
EuYVV 75．0 59．1 80．9 75．0 82．9 58．5 76．9 71．1
PaLCCNV-G12 75．2 50．4 93．0 74．1 84．5 56．3 69．4 77．3
PaLCCNV-Fz10 75．3 45．9 92．6 74．1 84．8 56．3 69．4 78．4
SbYVV-GD13 91．0 76．3 95．7 94．9 92．2 91．2 94．0 78．4
SbYVV-GD24 90．8 76．3 95．3 94．9 91．4 91．2 94．0 77．3
SbYVV-GD27 90．9 76．3 95．7 94．9 91．7 89．7 94．0 78．4
SbYVGxV-G111 84．8 77．0 79．0 69．5 89．3 89．0 94．8 86．6
SbYVV-Fz11 91．3 79．3 96．1 96．6 89．8 90．4 96．3 76．3
SbYVV-Gz01 93．4 86．5 96．5 91．5 94．7 92．6 96．3 90．7
TLCHnV 79．2 50．7 93．0 73．5 81．7 56．0 72．4 77．3
TLCVNV 75．3 47．6 93．4 76．7 83．1 57．8 57．5 75．3
TYLCVNV 78．9 67．7 93．8 75．9 83．6 58．8 69．4 75．3
1)a 核苷酸序列同源性;b 氨基酸序列同源性．
从图 3A可以看出，Fz02 与豨莶上分离到的其他病毒(SbYVV及 SbYVGxV-G111)形成一个独立分支，
并且与 SbYVV-Gz01 同源关系较近．
系统关系树由 MEGA 5．0 的邻近相连法构建，步差值为 1000．
图 3 基于 Fz02 和其他相关双生病毒(A)及伴随的 betasatellite分子(B)全长核苷酸序列构建的系统关系树
Fig． 3 Phylogenetic tree based upon alignments of the complete nucleotide sequences of the DNA-A components (A)
and betasatellite molecules (B)with other related geminiviruses
2．3 病毒伴随的 betasatellite分子结构及其同源性比较
利用设计的卫星分子的特异性引物，在病毒分离物 Fz02 中扩增到 betasatellite 分子(Fz02β)．序列测
定表明，Fz02β全长 1359 nts(GenBank登录号为 KF499590) ，互补链上编码 1 个 βC1 OＲF，在 1260 － 15 nts
之间含 1 个长为 115 nts的卫星保守区域(satellite conserved region，SCＲ) ，SCＲ区含有双生病毒科病毒共
有的茎环结构和 TAATATT /AC(图 2B)． Fz02β的全序列与 SbYVV 各分离物(GD13、GD24、GD27)的卫星
分子的同源性最高，分别为 85．3%、85．1%和 84．2%;与其他已报道的卫星 betasatellite 的同源性均低于
76．3% ．值得注意的是，Fz02β与 Fz11β的同源性只有 65．1% ．另外，Fz02β 全序列中不含有 beta01 和 be-
ta02 的引物序列，这也是用此引物未能扩增到特异片段的原因．
从图 3B可以看出，Fz02β与豨莶上分离到的其他病毒卫星(SbYVB及 SbYVGxB-G111)形成一个独立
分支，并且与 SbYVB广东分离物(GD13、GD24、GD27)同源关系较近．
·921·第 2 期 张洁等:福州地区豨莶黄脉病病原的分子鉴定
2．4 Fz02 基因组结构变异分析
利用 DnaSP软件对 7 个相关病毒分离物及其 6 个病毒伴随卫星进行了全基因组的序列变异分析，发
现在整个基因组上的变异不均匀(图 2C、D)． 其中，DNA-A 中最大的变异峰值集中在 AC4 OＲF N 端和
AC1 OＲF N端，另外 2 个小的变异峰值分布于 AC5 和 AV1 内，其他区域较为保守．卫星分子中变异峰值
集中在 βC1 OＲF的下游区域，以及 SCＲ和 A-rich区之间的区域，而 A-rich区和 βC1 OＲF相对保守． DNA-
A与卫星分子相比，后者具有更大的变异性．
3 讨论
本研究表明，Fz02 与广东报道的 SbYVV-Gz01 的同源性最高，达 93． 4% ． 根据国际病毒分类委员会
(ICTV)制定的双生病毒种的分类标准，全长基因组(即 DNA-A)核苷酸序列相似性小于 89%，定为不同病
毒种;大于 89%即为同一病毒的不同分离物或株系［14］．因此认为 Fz02 是 SbYVV的一个分离物．
本文从福州地区常见的杂草豨莶上分离到的 SbYVV，与本实验室 5 年前从同一地点采集到的样品［5］
所鉴定的病毒同源关系仅为 91． 3%，且未发现 PaLCCNV 的复合侵染． 系统进化关系树也表明，Fz02 与
SbYVV广州分离物亲缘关系最近．对 SbYVV各分离物进行全基因组变异分析，表明 DNA-A和 betasatellite
都具有不同程度的变异，且存在较高的变异峰值区．研究表明，双生病毒及其伴随卫星分子显示共进化的
关系，并且根据其寄主及地理起源的不同而聚类为不同的分支［15］．因此有必要通过构建 SbYVV 和 PaL-
CCNV的侵染性克隆对两者的寄主范围及其进化变异关系进行进一步验证．
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(责任编辑:杨郁霞)
·031· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 44 卷