全 文 ：2010 Vol.11 No.4
原发性肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤，具有发
病率高、治疗效果差、病死率高的特点，在我国已成
为第二大癌症杀手［1］。原发性肝癌起病隐匿，且早期
多无明显症状， 约 80%患者就诊时已经属于中晚
期，失去了手术切除的机会。HCC自然病程约为 2～6
个月，总的生存率仅为 3%～5%［2］。 积极防治肝癌已
经成为我国乃至全世界广泛重视的课题。
覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物， 因其仅分布于
华东地区，故名华东覆盆子。《中华人民共和国药典》
（2005 年）收载的覆盆子品种是华东覆盆子的果实，
果味甜，可食，具有补肾固精、助阳缩尿的功效。 药
理实验证明，覆盆子具有抗诱变［3］、延缓衰老［4］、增强
免疫的作用［5］。文献记载，覆盆子中的 β-谷甾醇（β-
sitosterol）等化学成分具有一定的抗癌作用 ［6-7］，但对
肝癌细胞的抑制作用目前国内未见报道。 本研究探
讨覆盆子浆对人原发性肝癌细胞的影响， 为临床抗
癌新药的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
DMEM 细胞培养液：北京赛驰生物科技有限公
司；四唑盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）、台盼蓝：美国
Sigma 公司；胰蛋白酶、胎牛血清：北京鼎国生物技
术有限公司；倒置显微镜：日本 OLYMPUS CK40；全
自动酶联免役检测仪：南京华标仪器厂。
1.2 覆盆子浆的制备
将覆盆子于 60 ℃烘干，粉碎，取 20 目～40 目
粉末 100 g，加 12倍水浸泡 30 min 后煎煮 1 h，分离
出提取液，药渣再加 10 倍水煎煮 1 h，分离出提取
液，将两次提取液合并，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减
压浓缩至稠膏状，60 ℃真空干燥， 得覆盆子总提取
物，将制备的干燥覆盆子提取物用 DMEM（肿瘤细
胞培养液）溶解，即得到不同浓度的覆盆子浆。
1.3 原发性肝癌细胞的来源与培养
1.3.1 标本来源 2007 年 6 月-2009 年 10 月原发
性肝癌新鲜肿瘤切除标本 25例，来自泰安市肿瘤医
院 11 例，泰安市第一人民医院 8 例，泰安市中医医
院 6例。
1.3.2 制备肿瘤细胞悬液 取新鲜肿瘤组织， 在无
菌条件下，去除肿瘤的纤维组织及坏死部分，眼科剪
剪碎，置入细胞滤器中，用 100 目铜网过滤，D-Hank
液冲洗，台盼兰染色活细胞≥90%，用 DMEM 制备
成 5×105/mL单细胞悬液。
1.3.3 肿瘤细胞培养 将细胞悬液分装入培养瓶
内， 然后用含 20%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100
U/mL 链霉素的 DMEM 接种于 50 mL 培养瓶中，于
37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，次日更换培养液，观察
细胞生长情况，待细胞生长至单层时进行传代。 弃去
旧培养液，PBS 液洗涤细胞， 加入 0.25%胰蛋白酶1
mL，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶铺满瓶底，流遍细
胞表面，置倒置显微镜下观察，见细胞质回缩，伪足
将要消失时， 向培养瓶中加入 3 mL 完全培养液终
止消化，然后按 1∶2 的比例在新培养瓶中继续培养。
1.4 方 法
覆盆子浆对原发性肝癌细胞影响的临床研究
亓贯和 1，王 静 2，李业永 2
（1.山东省泰安市第一人民医院，山东 泰安 271000； 2.山东省泰安市中医医院，山东 泰安 271000）
摘要 目的：探讨覆盆子浆对人类原发性肝癌细胞增殖的抑制作用。 方法：采用 MTT 法、形态学检测覆盆子浆对人原发
性肝癌细胞增殖的抑制结果。 结果：MTT 法显示，各个浓度的覆盆子浆对人原发性肝癌细胞的增殖均有抑制作用，呈现
出与药物浓度、作用时间的依赖性；浓度越大、作用时间越长，癌细胞生长越缓慢。 倒置显微镜下可见药物组细胞数减
少，间隙增大，细胞间出现“接触性抑制”。 结论：覆盆子浆对人肝癌细胞的生长具有抑制作用，覆盆子有可能成为抗肝癌
新药，为抗癌新药的开发提供理论与实验依据。
关键词 覆盆子浆；人原发性肝癌细胞；增殖；抑制
中图分类号：R285.6 文献标识码：A 文章编号：1671- 0258（ 2010） 04- 0022- 03
［基金项目］泰安市科技局计划资助项目
［作者简介］亓贯和，男，主管技师，从事临床检验工作
［收稿日期］2010-02-15
临床研究与经验
22
2010年 第 11卷 第 4期
1.4.1 四唑盐（MTT）比色法测定覆盆子对肝癌细胞
的敏感性实验 收集对数生长期的细胞， 调整浓度
为 5×104/mL 的单细胞悬液，接种于 96 孔培养板中，
每孔 200 μL，于 37 ℃ 5%CO2饱和湿度的培养箱中
培养 24 h 后，更换培养液，实验组加入以 DMEM 完
全培养液配制的覆盆子， 终浓度分别为 0.005 g/L、
0.01 g/L、0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L，另设阴性、空白
对照组，每组设 8个复孔。将培养板置培养箱中分别
于 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 各取出
1 块培养板，吸弃其中 5 个复孔内培养液，加入 5g/L
MTT溶液 20 μL，继续培养 4 h，吸弃孔内培养液，每
孔加入 DMSO 100 μL，震荡摇匀 10 min，使结晶物
充分溶解，选择 570 nm 波长，在全自动酶标仪上测
定各孔的吸光度（A）值，取 5 孔平均值，计算细胞生
长抑制率。应用直线回归法计算 IC50值，并寻找药物
作用的合适的浓度与作用时间。
细胞抑制率（%）= 1-A（实验组）A（对照组） ×100%
1.4.2 细胞膜完整性检测 取另外 3孔， 制成单细
胞悬液，0.4%台盼蓝染色，光镜下观察，细胞膜破裂
的细胞，被染成蓝色，而活细胞膜完整，拒染。
活细胞率（%）=细胞总数-蓝染细胞数
细胞总数
×100%。
1.4.3 细胞形态学观察 倒置显微镜下， 观察药物
作用后肝癌细胞生长情况及形态变化。
1.5 统计学方法
计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组计量资
料间比较采用方差分析，组间比较采用 t检验，P<0.05
认为差异有统计学意义，抑制率的比较用 χ2检验。
2 结 果
2.1 MTT法敏感性试验
每个浓度的覆盆子对肝癌细胞的增殖均有抑制
作用，只是抑制的程度有所不同，浓度为 0.005 g/L
覆盆子组的抑制率与空白对照组相比差异无统计学
意义；但是从 0.02 g/L 起，每个时间段随着覆盆子浓
度的增加， 抑制作用增强， 并且与前一个浓度相比
较，差异有统计学意义（P<0.01），呈现出剂量依赖趋
势；每个浓度随着作用时间的增加，抑制作用增强，
并且与前一个时间段相比较， 差异有统计学意义
（P<0.01），呈现时间依赖趋势，以 0.08 g/L 的覆盆子
在 72 h 时，其抑制率与前一个浓度相比较、与前一
个时间段相比较，差异有统计学意义（P<0.001），作
用最为明显（结果见表 1），以 72 h 不同浓度覆盆子
处理组与抑制率进行相关分析，呈正线性趋势，相关
方程为 Y=1.37+0.728 2X， 相关系数 r=0.981 2，D50
为 0.065 g/L，经过不同浓度的覆盆子处理后，细胞
生长速率开始变慢，然后细胞数逐渐减少，失去了正
常细胞快速增值期（指数生长期），说明加药后细胞
生长受到抑制，并呈现出与药物浓度、作用时间的依
赖性。
2.2 台盼蓝拒染法检测细胞膜完整性实验结果
随着覆盆子浓度的增加，作用时间的延长，蓝染
细胞数随之增加，活细胞率下降，浓度为 0.08 g/L 覆
盆子作用 144 h时，活细胞率为 31.2%（结果见表2），
说明肝癌细胞在此药物浓度及作用时间作用下，有
明显的被抑制作用。
2.3 形态学观察结果
阴性对照组：细胞呈上皮样贴壁生长，生长速度
较快，细胞呈多角形，细胞间接触紧密，在培养瓶部
分区域出现“叠堆生长”现象，增值旺盛，离壁细胞少
（结果见图 1）；覆盆子组：细胞数减少，普遍收缩，部
分细胞生长区域出现“接触抑制”现象，细胞间距增
大，细胞间接触松散，细胞增值受到明显抑制（结果
见图 1）。
3 讨 论
表 2 覆盆子对 25 例肝癌细胞作用后平均活细胞率 （%）
12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
0.005 98.3 98.1 97.5 97.1 96.2 95.1 90.1
0.01 95.1 94.2 93.6 91.8 88.1 87.2 86.9
0.02 94.7 91.7 89.8 89.9 79.8 76.3 74.1
0.04 90.2 88.6 88.1 87.1 75.9 68.3 53.8
0.08 89.1 87.1 85.4 84.9 64.4 43.1 31.2
P（覆盆子）（g/L）
表 1 覆盆子对 25 例肝癌细胞的平均抑制率 （%）
12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
0.005 1.7 2.3 2.3 2.8 3.9 4.2 5.6
0.01 7.2 9.3 9.5 13.7 16.5 18.1 18.8
0.02 13.5 14.6 15.1 17.2 24.1 28.3 32.8
0.04 16.7 17.5 20.2 24.6 29.5 34.8 41.3
0.08 34.4 44.1 51.4 61.7 63.3 65.7 68.8
Р（覆盆子）（g/L）
阴性对照组
图 1 药物作用后肝癌细胞生长情况及状态变化
覆盆子组
临床研究与经验
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肝癌的治疗方法很多，如外科手术、病灶局部的
介入放射治疗、全身化学药物治疗等。 近年来，国内
在肝癌的免疫基因治疗、癌基因和抑癌基因治疗、自
杀基因治疗及耐药基因治疗等方面的研究取得了一
定成绩，但多数尚处于基础研究阶段，而手术、放射
治疗、 化学药物治疗现在仍然是治疗肝癌的主要手
段， 由于大部分肝癌患者在确诊后已失去了手术切
除的机会，目前，临床确诊的原发性肝癌患者能接受
肝切除术者只占 10%~30%［8］，而且手术切除后的肝
癌患者复发率很高， 目前学者们已经充分认识到针
对肝癌进行外科手术， 应强调针对患者的全身情况
进行预防和综合治疗［9-10］，全身化学药物治疗在原发
性肝癌的综合治疗中始终占重要地位，但由于缺乏特
异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞产生
杀伤效应，导致骨髓移植，肝肾损害等致死性毒副作
用。 因此，寻找和开发新型的副作用小、疗效好、作用
比较温和的化疗药物，已迫在眉睫。
中医中药治疗肿瘤是我国在肿瘤治疗领域的一
大特色，临床实践证明，单独用中药或中西医结合治
疗肿瘤疗效确切，同时还可减轻放化疗的毒副作用，
因此，应用中医药治疗肿瘤备受国内外学者的青睐，
已经成为国内外抗肿瘤药物开发研究的重要组成部
分，特别是从中草药中提取抗肿瘤药物，成为近年来
中药的研究热点。 中医药是肝癌治疗的一条重要途
径，具有广阔的研究开发前景。
异常增殖是肿瘤细胞的特征之一， 抑制肿瘤细
胞的生长增殖是治疗肿瘤的途径之一，也是对抗肿
瘤药物的基本要求。 覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物，
对悬钩子属化学成分的系统研究始于 20世纪 70 年
代末 80年代初，从中分离出 β-谷甾醇、胡萝卜苷、椴
树苷、山奈酚-3-β-D（rha）-glc 等 50 多个化合物［6］。
本试验通过对原发性肝癌细胞的体外培养，覆盆子
处理后，MTT 药物敏感性试验结果表明， 覆盆子对
肝癌细胞的生长、增殖具有抑制作用，并且抑制率呈
现出与药物剂量、作用时间的依赖趋势（P<0.01）；从
生长曲线上看，覆盆子处理后的细胞，失去了正常细
胞快速增值期（指数生长期）；同时，形态学观察也进
一步显示覆盆子对原发性肝癌细胞生长增殖具有抑
制作用，从而降低了肝癌的恶性程度。 目前，抗癌中
药大体上有 4个方面的作用， 即抑杀肿瘤细胞的祛
邪作用；调整机体免疫功能等抗癌潜能的扶正作用；
提高手术、放疗、化疗等效果的增敏作用；减低治疗
肿瘤过程中的毒副作用。 覆盆子作为中药， 对机体
损害小， 作用温和， 因此， 可能成为治疗肝癌的化
学治疗药物， 为肝癌的临床治疗提供一条重要的途
径， 为抗癌新药的开发提供理论与实践依据。 本实
验表明， 覆盆子对肝癌细胞的生长增殖能有效地抑
制， 但其单一成分的作用机制还需要进一步研究与
探讨。
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