全 文 ：农产品加工·学刊 2009年第 10期
收稿日期：2009- 07- 30
基金项目：镇江市国际合作项目（GJ2007010，GJ2008010）；镇江市工业攻关项目（GY2007002）。
作者简介：马海乐（1963- ），男，陕西人，博士，教授，博士生导师，研究方向：生物资源高效利用技术。
E- mail：mhl@ujs.edu.cn。
氢气是清洁能源，其燃烧产物只有水，可以以金
属氢化物的形式进行储存[1]。 尽管氢气作为清洁能源
有着巨大的潜力，但目前氢气的生产多是由煤、石
油、天然气等化石燃料制得[2]。现在全球每年氢气总
产量约为 5×1011 nm3，其中用非化石能源制得氢气
约 2×1010 nm3 [3]。
生物系统提供了一系列的制氢方法，包括直接光
分解、间接生物光分解、光发酵和暗发酵 （厌氧发
酵） 制氢法[5， 6]。生物氢气作为微生物代谢的副产物，
正在成为现代技术开发的热点，它能利用多种可再生
资源来生产氢气[7]。暗发酵可以利用更廉价的废水、
废弃物厌氧发酵制氢，例如豆腐制造业废弃物、米糠
和麸皮、葡萄酒酿造厂污水、糖蜜和蔗糖废水、废弃
的活性污泥、城市固体垃圾、淀粉污水、餐厨垃圾、
稻草、椰子壳、制糖甘蔗渣等，所以厌氧发酵生物制
氢是一种更经济、划算的制氢方法[7， 8]。
响应面法优化醋糟厌氧发酵制氢
马海乐 1， 2， 3，刘瑞光 1， 3，王振斌 1， 2， 3，顾 顺 1， 3，Ruihong Zhang4， 3
（1. 江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；
2. 江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心，江苏 镇江 212013；
3. 美国加州大学—中国江苏大学生物质能联合研究中心，江苏 镇江 212013；
4. Department of Biological & Agricultural Engineering，University of California- Davis，Davis，CA 95616，USA）
摘要：依据响应面试验设计法，选取有机负荷（Food/Microbe，F/M）、固液比、初始 pH值和发酵温度为考察因素，
进行醋糟厌氧发酵制氢工艺优化试验。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出醋糟厌氧发酵制氢的最佳工艺
条件为：F/M 1.65，固液比 16.90 g/200 mL，初始 pH值 6.02，发酵温度 37.66 ℃；各因素的主效应关系为：初始
pH值 >F/M>固液比 >发酵温度。建立的产氢量数学模型为 Y=26.63+1.34 x1+1.27 x 2- 6.74 x 3- 2.44 x 32- 6 x 42- 1.7 x2x 3-
2.35 x3x4，该模型能解释 91.60%的响应值变化，产氢量的预测值为 32.91 mL/g TS，验证值为 33.73 mL/g TS。理论值
与验证值的复相关系数为 0.978 0，证明此模型是合理可靠的，可用于实际预测。
关键词：醋糟；厌氧发酵；氢气；响应面法；优化
中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A doi：10·39691jissn·1671- 9646（X）·2009·10·010
Optimization of Hydrogen Production from Vinegar Residue by Anaerobic
Digestion with Response Surface Methodology
Ma Haile1， 2， 3，Liu Ruiguang1， 3，Wang Zhenbin1， 2， 3，Gu Shun1， 3，Ruihong Zhang4， 3
（1. School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China；
2. Jiangsu Provincial Research Center of Bio- process and Separation Engineering of Agri- products，Zhenjiang，Jiangsu
212013，China；3. Joint Bio- energy Research Center of Jiangsu University and University of California- Davis，Zhenjiang，
Jiangsu 212013，China；4. Department of Biological & Agricultural Engineering，University of California- Davis，
Davis，CA 95616，USA）
Abstract：Anaerobic digestion for producing hydrogen from vinegar residue was studied with the method of Response Surface
Method，and F/M（x1），solid- liquid ratio（x2），initial pH value（x3） and temperature（x4） were selected as experimental
factors. Based on analysis of significance and interaction，the optimum conditions of anaerobic digestion were obtained，which
were the F/M of 1.65，solid- liquid ratio of 16.9 g/200 mL，initial pH value of 6.02 and temperature of 37.66 ℃. The order of
factors effecting hydrogen yield（Y） was initial pH value>F/M>solid- liquid ratio>temperature. The model，Y=26.63+1.34 x 1+
1.27 x 2- 6.74 x 3- 2.44 x 32- 6 x 42- 1.7 x 2x 3- 2.35 x 3x 4，could explain 91.60% changes of the response value. The correlation
coefficient of predicted value（32.91 mL/g TS） and measured value（33.73 mL/g TS） was 0.978 5，so the model is credible.
Key words：vinegar residue；anaerobic digestion；hydrogen；response surface methodology；optimization
第 10期(总第 187期) 农产品加工·学刊 No.10
2009年 10月 Academic Periodical of Farm Products Processing Oct .
文章编号：1671- 9646 ( 2009 ) 10- 0040- 04
2009年第 10期
本文以醋糟为研究对象，以预处理后的牛粪为接
种 物 ， 采 用 响 应 面 分 析 法 （Response Surface
Methodology，RSM） [9， 10]，对影响醋糟厌氧发酵制氢
的关键因素进行优化研究，建立相应的数学模型，以
期为醋糟工业化制氢提供理论依据，为醋糟的综合利
用提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
（1） 醋糟，取自镇江恒顺酱醋厂。经测定该醋糟
中 TS（总固形物含量） 和 VS（挥发性固形物含量）
分别为 29.87%和 94.42%。
（2） 厌氧发酵产氢菌来源，以取自镇江市长江乳
业有限公司的牛粪作为混合产氢菌源，该牛粪的 TS
和 VS分别为 20.30%和 83.54%。
1.2 醋糟发酵产氢试验
以富集后的牛粪为混合菌种，以体积分数为
0.7%的 HCl 预处理过的醋糟为底物 （按固液比
1∶2.5，室温浸泡 24 h），在 250 mL蓝盖试剂瓶中进
行厌氧发酵。试验中，将预处理过的菌种和醋糟按照
设定比例加入蓝盖试剂瓶，用自来水定容至 200 mL，
调节 pH值后，垫上硅胶垫，拧紧螺旋盖。通过瓶盖
上的导管向瓶内充入高纯氮气，然后置于恒温水浴锅
中进行培养。每个处理重复 3次，以排水法对气体进
行收集，发酵结束后，取样进行气体成分测定。
1.3 气体分析
用密封玻璃注射器从收集瓶中吸取气体样品，然
后用 SP2000型气相色谱仪测定氢气含量。气相测定
条件为：Porapak Q 6不锈钢填充柱（80/100 Mesh），
柱恒温为 35 ℃；以 N2为载气，流速为 20 mL/min；
热导检测器，检测器电流为 60 mA，温度为 100 ℃；
进样器不分流，进样温度为 50 ℃。
1.4 试验设计
依 据 Design Expert（ Static Made Easy，
Minneapolis，MN，USA. version） 软件，采用 Central
Composite Design建立数学模型，以有机负荷（F/M）
（Z1）、固液比（200 mL发酵液中 TS的质量） （Z2）、
初始 pH 值 （Z3） 和发酵温度 （Z4） 为自变量，以
+1，0，- 1分别代表自变量的高、中、低水平，按如
下方程对自变量进行编码：
xi= Zi- Z0ΔZ
.
式中：xi——自变量的编码值；
Zi——自变量的真实值；
Z0——试验中心点处自变量的真实值；
ΔZ——自变量的变化步长。
共设立了 30个处理组。
响应面法 4因素 5水平试验设计见表 1。
2 结果与讨论
2.1 回归模型的建立
以 F/M x1，固液比 x2，初始 pH值 x3和发酵温度
x4为自变量，产氢量为因变量 Y，按照 Design Expert
软件中的 Central Composite Design模型，对试验获得
的产氢量响应平均值进行回归，建立二次回归模型。
初步回归方程为：
Y=26.63+1.34 x1+1.27 x2- 6.74 x3+0.3 x4- 0.97 x12-
0.044 x22- 2.44 x32- 6 x42+0.95 x1x2+1.14 x1x3-
0.09 x1x4- 1.7 x2x3- 1.02 x2x4- 2.35 x3x4. （1）
对回归方程进行检验，决定系数 R2=0.956 5，校
正决定系数 R2Adj=0.916 0，p<0.000 1。表明回归模型
显著，拟合程度好，有实际应用意义。
回归方程模型系数的显著性检验见表 2。
由表 2 可知，模型 （1） 中， x1 (p=0.029 3)和
x2(p=0.037 4)差异显著，x3(p<0.000 1)差异极显著，而
x4(p=0.600 3)差异不显著；二次项 x32(p=0.000 3)和
x42(p<0.000 1)差异极显著，其余项差异不显著；交互
项 x2x3(p=0.025)差异显著，x3x4(p=0.003 5)差异高度显
表 2 回归方程模型系数的显著性检验
因素 系数估计值 标准误差 t值 p值 显著性
Intercept
x1
x2
x3
x4
x12
x22
x32
x42
x1x2
x1x3
x1x4
x2x3
x2x4
x3x4
26.63
1.34
1.27
- 6.74
0.30
- 0.97
- 0.044
- 2.44
- 6.00
0.95
1.14
- 0.090
- 1.70
- 1.02
- 2.35
1.11
0.56
0.56
0.56
0.56
0.52
0.52
0.52
0.52
0.68
0.68
0.68
0.68
0.68
0.68
-
2.41
2.28
- 12.13
0.54
- 1.86
- 0.08
- 4.69
- 11.54
1.40
1.67
- 0.13
- 2.49
- 1.50
- 3.45
-
0.0293
0.0374
<0.0001
0.6003
0.0820
0.9335
0.0003
<0.0001
0.1827
0.1162
0.8967
0.0250
0.1556
0.0035
*
*
***
***
***
*
**
注：***，差异极显著 （p<0.001）；**，差异高度显著 （p<
0.01）；*，差异显著（p<0.05）。
因子
代码 水平
编码 非编码 - 2 - 1 0 1 2
有机负荷 F/M
固液比 /g·(200 mL)-1
初始 pH值
温度 /℃
x1
x2
x3
x4
Z1
Z2
Z3
Z4
0.95
12.5
5.5
25
1.20
14.0
6.0
30
1.45
15.5
6.5
35
1.70
17.0
7.0
40
1.95
18.5
7.5
45
注：x1=（Z1- 1.45） /0.25；
x2=（Z2- 15.5） /1.5；
x3=（Z3- 6.5） /0.5；
x4=（Z4- 35)/5。
表 1 响应面法 4因素 5水平试验设计
马海乐，等：响应面法优化醋糟厌氧发酵制氢 ·41·
农产品加工·学刊 2009年第 10期
著，其余项差异不显著（p>0.05）。表明 F/M、固 液
比和初始 pH 值对产氢量的主效应明显，且在初始
pH值、固液比和初始 pH值、发酵温度之间交互作
用显著。
依据系数估计值 x1=1.34， x2=1.27， x3=- 6.74，
x4=0.30 可知，因素的主效应关系为：初始 pH 值
>F/M>固液比 >发酵温度。在α=0.05显著水平下剔
除不显著项后，对模型（1） 进行优化后可得：
Y=26.63+1.34 x1+1.27 x2- 6.74 x3- 2.44 x32- 6 x42-
1.7 x2x3- 2.35 x3x4. （2）
2.2 响应面分析
F/M、固液比及其交互作用对产氢量影响的响应面
见图 1，F/M、初始 pH值及其交互作用对产氢量影响
的响应面见图 2，F/M、温度及其交互作用对产氢量影
响的响应面见图 3，固液比、初始 pH值及其交互作用
对产氢量影响的响应面见图 4，固液比、温度及其交互
作用对产氢量影响的响应面见图 5，初始 pH值、温度
及其交互作用对产氢量影响的响应面见图 6。
各图表示 x1，x2，x3，x4中任意 2个变量取零水
平时，其余 2个变量对产氢量的影响。
由图 1 可以看出，初始 pH 值为 6.5，温度为
35 ℃时，固液比不变。随着 F/M的增大，产氢量先
增加后减小。固液比较大时，变化速度较快；F/M不
变，随固液比的增大，产氢量增加；F/M较大时，升
高速度较快。由初步回归方程和响应面可以看出，
F/M对产氢量的影响呈现负二次曲线形式，而固液比
的影响主要呈现一次线性关系，且在固液比为
（16.30~17.00） g/200 mL，F/M为 1.45~1.57，所得产
氢量最高。显然，F/M较大时，产氢菌株过小；F/M
较高，会造成发酵液过度酸化，不利于产氢；F/M过
小时，菌株数量过剩，但发酵液中可利用有机物不
足，从而导致产氢受到抑制；固液比较大时，发酵液
中的 TS也较大，就意味着发酵液中菌种的数量和可
利用底物的量较多，所以产氢量会呈上升趋势；但当
固液比过大时，发酵体系中菌种过于密集，固形物浓
度过大，不利于微生物之间的传质，同时也会对发酵
操作带来负担，所以发酵过程中应选取合适的 F/M
及固液比。
由图 2 可以看出，固液比为 15.5 g/200 mL，温
度 35 ℃时，F/M不变。在 pH值为 6.0~7.0，随着 pH
值的降低，产氢量显著增加；初始 pH值不变，随着
F/M的增加，产氢量先增加后减小。由响应面和回归
方程可以看出，初始 pH值对产氢量的影响呈现负一
次线性形式，而 F/M则呈负二次曲线关系，在此条
件下，产氢量变化速率显示初始 pH值的主效应大于
F/M，与统计结果相符。初始 pH值可以影响微生物
对营养物质的吸收，改变生长环境中营养物质的可给
性和有害物质的毒性，从而影响发酵液的产氢能力。
显然，弱酸性初始 pH值有利于混合产氢菌适应新的
生长环境，增加微生物活性，提高产氢量。
由图 3可以看出，初始 pH值为 6.5，固液比为
15.5 g/200 mL时，F/M不变。随温度的增高，产氢量
先增加后减小，在 F/M较高时，变化速率较大；温
·42·
2009年第 10期
度不变，产氢量随 F/M的增加先增大后减小；在温
度 35 ℃左右，F/M 1.45~1.70时，得到最大产氢量。
从回归方程和响应面可以看出，温度对产氢量的影响
呈现负二次曲线形式，且主效应大于 F/M。微生物都
有其适宜生长的温度范围，不同菌种生长的最适范围
也不同，温度较低，微生物繁殖速度较慢，发酵效率
低，以至发酵时间延长，产氢量低；温度较高，微生
物受到抑制甚至被杀死，不利于发酵进行。显然，适
宜的发酵温度有利于产氢量的提高。
由图 4可以看出，温度 35 ℃，F/M 1.45时，固
液比不变。随着初始 pH值的降低，产氢量增加，在
较高固液比下，增加速率较快；初始 pH值不变，随
着固液比的增大，产氢量缓慢增加。与图 1、图 2 显
示的结论一致。从增加速率可以看出，初始 pH值对
产氢量的主效应大于固液比，这与统计结果相符。
由图 5可以看出，F/M 1.45，初始 pH值 6.5时，
固液比不变。产氢量随温度的升高，先增大后减小，
在温度 35 ℃左右达到最大值；温度不变，随着固液
比的增大，产氢量缓慢增加；从响应面可以看出，在
初始 pH值和 F/M固定的条件下，温度对产氢量的影
响呈现负二次曲线形式，而固液比与产氢量呈一次线
性关系。固液比与产氢量呈一次线性关系，但相关系
数过小，不宜通过增大固液比来提高产氢量。显然，
固液比 （16.25~17.0） g/200 mL，温度 34~36 ℃时，
得到最大产氢量。
由图 6可以看出，F/M1.45，固液比 15.5 g/200 mL
时，温度不变。随初始 pH值的降低，产氢量稳步增
加，且在温度较高或较低时，增加速度缓慢；初始
pH值不变，随着温度的升高，产氢量先增大后减小，
在初始 pH值 6.0~6.3，温度较低或较高时，产氢量随
温度变化速率较大。在固定 F/M和固液比的条件下，
发酵温度较高或较低时，温度对产氢量的主效应大于
初始 pH值；在发酵温度 35 ℃左右时，初始 pH值对
产氢量的主效应大于发酵温度。
2.3 试验验证
为了验证醋糟厌氧发酵制氢模型方程的适用性，
从上述回归模型中求得最优工艺条件为：
x1=0.80， x1=(Z1- 14.5)/0.25；
x2=0.933， x2=(Z2- 15.5)/1.5；
x3=- 0.960，x3=(Z3- 6.5)/0.5；
x4=0.532， x4=(Z4- 3.5)/5.
得：Z1=1.65，
Z2=16.9，
Z3=6.05，
Z4=37.66.
即醋糟发酵制氢的最佳条件：F/M 1.65，固液比
16.9 g/200 mL，初始 pH值 6.02，发酵温度 37.66 ℃，
产氢量理论值为 32.91 mL/g TS。
由于以上最佳条件未包括在响应面优化的 30个
实验中，需进一步进行试验验证。验证试验结果表
明，在最佳发酵条件下，醋糟厌氧发酵的产氢量达
33.73 mL/gTS，与预测值（32.91 mL/gTS） 基本一致，
（下转第 47页）
马海乐，等：响应面法优化醋糟厌氧发酵制氢 ·43·
2009年第 10期
[1]
说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模
型的正确性，说明响应面法适用于对醋糟厌氧发酵制
氢工艺进行回归分析和参数优化。
3 结论
（1） 利用试验设计软件 Design Expert，采用
Central Composite Design 建立了 F/M、固液比、初始
pH值和发酵温度与产氢量之间的二次多项数学模型：
Y=26.63+1.34 x1+1.27 x2- 6.74 x3- 2.44 x32- 6 x42-
1.7 x2x3- 2.35 x3x4.
回归分析表明，该模型能解释 91.60%响应值的
变化；通过模型系数显著性检验，得到因素的主效应
关系为：初始 pH值 >F/M>固液比 >发酵温度。
（2） 利用模型的响应面对产氢量影响的关键因子
及其相互作用进行探讨，优化出醋糟厌氧发酵制氢的
最佳条件为：F/M 1.65，固液比 16.9 g/200 mL，初始
pH 值 6.02，发酵温度 37.66 ℃，产氢量理论值为
32.91 mL/g TS，验证值为 33.73 mL/g TS，理论值与
验证值的复相关系数为 0.978 0。证明此模型是合理
可靠的，可用于实际预测。
参考文献：
Das D，Veziroglu T N. Hydrogen production by biological
processes：a survey of literature [J] . Int J Hydrogen Ener－
gy，2001，26：13-28.
Henley M， Wallace W， Andrel T. Microbial hydrogen
production [J] . AFRL Technol Horiz，2003，3：32-33.
Hart D. Hydrogen power： the commercial future of the
ultimate fuel [ D] . Financial Times Energy Publishing，
London，1997.
Levin D， Pitt L， Love M. Biohydrogen production:
prospectus and limitations to practical application [J] . Int J
Hydrogen Energy，2004，29：173-185.
Benemann J R. The technology of biohydrogen [ D] . In：
Zaborsky OR Biohydrogen. Plenum， New York， 1998：
19-30.
Nandi S，Sengupta S. Microbial production of hydrogen: an
overview [J] . Crit Rev Microbial，1998，24：61-84.
Ueno Y，Haruta S，Ishii M，et al. Microbial community in
anaerobic hydrogen -producing microflora enriched from
sludge compost [ J] . Apple Microbial Biotechnology，
2001，57：555-562.
Lay J J， Lee Y J， Noike T. Feasibility of biological
hydrogen production from organic fraction of municipal solid
waste [J] . Water Res，1999，33：2 579-2 586.
杜双奎，于修烛. 红枣酶法提取汁工艺条件响应面分析
[J] . 农业机械学报，2007，38（3）：191-193.
李宏全，赵孟春. 响应面法优化微波萃取黄芪多糖工艺
研究 [J] . 中兽医医药杂志，2007，26（2）：10-14.
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
（上接第 43页）
L- 乳酸产量为 51.67 g/L，当发酵时间延长至 144 h，
乳酸产量为 71.55 g/L。
（3） 运用 Matlab软件对动力学方程关键参数求
解，μm=0.037 8 h-1，Xm=5.175 2，α=20.689 4，β=- 0.064 8，
p=4.559 5，q=1.087 2。比较建立的动力学模型与实
验数据的分布趋势，R2均大于 0.98，说明该动力学
方程可以作为米根霉发酵产 L- 乳酸优化控制的参考
依据。
参考文献：
Bulut S， Elibol M， Ozer D， et al. Effect of different
carbon sources on L（+） -lactic acid production by
Rhizopus oryzae [ J] . Biochemical Engineering Journal，
2004，21：33-37.
Yu R C， Hang Y D. Kinetics of direct fermentation of
agricultural commodities to L-lactic acid by Rhizopuso ryzae
[J] . Biotechnol lett，1989，11（8）：597-600.
杨子培，成琰如，袁东波，等. 玉米淀粉深层发酵生产
L-乳酸 [J] . 食品与发酵工业，1994（5）：18-23.
李兴江，潘丽军，姜绍通，等. 米根霉发酵甘薯淀粉制
备 L-乳酸的最适条件 [J] . 合肥工业大学学报（自然科
学版），2004，27（2）：127-130.
金滨锋，崔洪斌，王金凤，等. 利用玉米芯发酵生产 L-
乳酸的研究 [J] . 哈尔滨商业大学学报（自然科学版），
2004，20（2）：213-215.
Adenise L， Woiciechowski， Soccol C R. Experimental
design to enhance the production of L -lactic acid from
steam-exploded wood hydrolysate using Rhizopus oryzae in
mixed -acid fermentation [ J] . Process Biochemistry，
1999，34：949-955.
Shigenobu Miura，Tomohiro Arimura，Noriakiitoda，et al.
Production of L-Lactic Acid from Corncob [J] . Journal of
bioscience and bioengineering，2004，97（3）：153-157.
Lu Zhengdong， Lu Mingbo， He Feng， et al. An
economical approach for D-lactic acid production utilizing
unpolished rice from aging paddy as major nutrient source
[J] . Bioresource Technology，2009，100：2 026-2 031.
Rojan P J，Anisha G S，K Madhavan Nampoothiri，et al.
Direct lactic acid fermentation：Focus on simultaneous sac－
charification and lactic acid production [J] . Biotechnology
Advances，2009，27：145-152.
郑志，姜绍通，罗水忠，等. 不同通气条件下米根霉发
酵产 L-乳酸的代谢调控 [ J] . 农业机械学报，2008，
39 （8）：79-83，134.
姜绍通，郑志，朱羽，等. 无载体固定化米根霉重复间
歇发酵生产 L -乳酸 [ J] . 生物工程学报， 2008，
24（10）：1 729-1 733.
朱羽. 无载体固定化米根霉发酵 L-乳酸的研究 [D] . 合
肥：合肥工业大学，2007.
[1]
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吴学凤，等：米根霉以木糖为碳源发酵产 L- 乳酸的动力学 ·47·