全 文 ：持留菌及其对微生物膜的耐受性影响研究进展*
龙冬艳摇 胡少平**摇 陈新才摇 刘摇 磊摇 陈英旭
(浙江大学水环境研究院, 杭州 310029)
摘摇 要摇 持留菌(persisters)是细菌种群中所占比例不到 0. 1%的一类特殊亚群,具有与种群
内普通菌、抗性突变菌所不同的特征,其形成机制复杂,不易分离培养. 持留菌可通过“休眠鄄
生长鄄增殖冶应对逆境的胁迫,维持自身生存和菌体结构稳定,在生物膜的多药耐受性与多金
属耐性中发挥着重要作用,对于维持微生物群落结构稳定具有重要意义.本文从持留菌的研
究历程、特点、基因调控机制及其对微生物膜的耐药性与多金属耐性的影响等方面进行了综
述,并对今后的研究方向进行了展望.
关键词摇 持留菌摇 微生物膜摇 毒素鄄抗毒素分子摇 多药耐性摇 金属耐性
文章编号摇 1001-9332(2010)10-2707-08摇 中图分类号摇 X172摇 文献标识码摇 A
Persisters and their effects on microbial biofilm tolerance: A review. LONG Dong鄄yan, HU
Shao鄄ping, CHEN Xin鄄cai, LIU Lei, CHEN Ying鄄xu (Academy of Water Science & Environmental
Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(10):
2707-2714.
Abstract: Persisters are a group of special subpopulation of bacteria, only occupying <0郾 1% of the
whole population but having the characteristics different from the ordinary bacteria and resistant mu鄄
tants. They have complex formation mechanism, and are difficult to isolate and culture. The persis鄄
ters can adapt to the adverse environment via “dormancy鄄growth鄄proliferation冶 to maintain their sur鄄
vival and cell structure stability, and play a vital role in the multi鄄drug and multi鄄metal tolerance of
microbial biofilm, being of great significance in maintaining the stability of microbial community
structure. This paper reviewed the research progress on the characteristics of persisters, their gene
regulation mechanisms, and their effects on the multi鄄drug and multi鄄metal tolerance of microbial
biofilm. The related research directions in the future were also prospected.
Key words: persisters; microbial biofilm; toxin鄄antitoxin ( TA) modules; multi鄄drug tolerance
(MMD); multi鄄metal tolerance (MMT).
*国家自然科学基金项目(40701161)和国家高技术研究发展计划
项目(2009AA063101)资助.
**通讯作者. E鄄mail: husp@ zju. edu. cn
2010鄄03鄄22 收稿,2010鄄08鄄03 接受.
摇 摇 一些公认的微生物难题,包括潜在的细菌感染、
不可培养微生物、持留菌以及生物膜的多药物耐受
性,悬而未决已有数十年历史. 然而近年来,越来越
多的研究表明,这些看似截然不同的现象,都与细胞
进入一种休眠的、非分裂状态有关,即与持留菌的存
在有关[1-3] .因此,对这一在特定微生物种群中所占
比例极少(约为 10-6 ~ 10-3)的持留菌进行深入研
究,对于解决这些微生物难题具有重要作用.近年来
随着微生物研究技术的发展,该领域的研究取得了
突破性进展,本文就有关持留菌及其对微生物膜耐
性影响的研究成果进行了简要的概括和总结.
1摇 持留菌的研究历程
持留菌概念的提出始于 1944 年,Bigger[4]在研
究青霉素作用机理时发现,青霉素可将绝大部分生
长中的葡萄球菌溶解.然而,即使在很高浓度的青霉
素作用下,仍有极少量的、所占比例约为 10-6的葡萄
球菌细胞不可避免地存活着,当青霉素浓度降低至
一定浓度以下时,这些少量的存活细胞可恢复生长.
Bigger将这种极少量细菌能够抵抗高浓度抗生素的
致死作用而存活的性质称为“细菌的持留性冶,将这
一类特殊的细菌称为“持留菌冶.
对持留菌的关注和研究最开始主要集中在医学
领域. 1958 年 Mcdermott 等[5]曾用“持留菌冶(persis鄄
ters)一词来描述药物治疗后长期存在的药物敏感
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 10 月摇 第 21 卷摇 第 10 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Oct. 2010,21(10): 2707-2714
菌,并将“药物敏感菌在动物体内遭受药物攻击而
能存活的能力称为持留性冶. 结核病病程的延绵和
复发所显示的持留现象是久为人知的临床事实,并
一度成为有关持留菌医学研究的焦点[6-7] . 在医学
领域,人们常以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber鄄
culosis)在宿主体内以非增殖方式存在从而造成延
缓性病程和导致复发的潜伏状态称为持留现象或持
留性(persistence),将引起这种现象的菌群称为持
留菌(persisters) [8] .为进一步明确持留菌的持留性
特征,Gomez等[9]进而将结核病的休眠性、潜伏性和
持留性进行了较好的界分,指出:休眠性是用来描述
潜伏感染时宿主和病原菌相互作用、相对平衡和静
止的亚临床状态的特征;潜伏性则描述了结核性长
期潜伏感染的基本特性;而持留性是独立为细菌特
性的描述:“结核分枝杆菌于逆境下在组织内保持
稳定和对环境的无反应性[10]冶的特性.因此,细菌的
持留性是导致结核病具有潜伏性的原因.
随着学科的交叉与研究的深入,持留菌已不仅
是医学领域的关注焦点,也逐渐引起了环境研究者
的极大兴趣[11-13] . 研究发现,持留菌不仅可以抵抗
高浓度抗生素而存活,在高浓度有毒重金属环境下
也有极少量的持留菌存在. 而持留菌这种能够在逆
境胁迫下存活的性质对于维持环境微生物系统的稳
定具有重要作用.
2摇 持留菌的特点
2郾 1摇 代谢活动的变化性与对环境胁迫的不应答性
持留菌在对应微生物群体中所占比例极少,大
多低于 0郾 1% .这类数量极少的特殊细胞的显著特
点是在逆境条件下处于非分裂增长的休眠状态和对
逆境的无反应性,并以此维持自身的生存.而当逆境
消失或外界有毒有害物质浓度降低时,持留菌又可
恢复生长,并进行增殖再生. 因此,持留菌的代谢活
动能随着外界环境的变化而变化,通过“休眠鄄生长鄄
增殖冶应对逆境的胁迫,维持自身生存和菌体结构
稳定.由于持留菌能逃避有毒有害物质的致命作用
而存活,随后在适宜条件下恢复增殖,因此 Pickers鄄
gill[14]2009 年冠其以“Escape Artists冶的美誉.
值得注意的是,持留菌并非抗性突变体,而是菌
群中一类表型异化的亚群[15] .它们不能在含高浓度
抗生素或有毒重金属环境下存活和生长,而是处于
一种休眠状态.其子代对抗生素、重金属等仍具有敏
感性,而不是基因突变体所具有的对有毒有害物质
的高抗性.当外界环境中有害物质浓度降低或消失
时,持留菌恢复生长后所产生的新生细胞绝大多数
对抗生素或有毒重金属仍具有敏感性,因此,同样能
在亲代的致死浓度水平下被抗生素或重金属所杀
死.经持留菌增殖新形成的菌群中,持留菌所占比例
仍低于 0郾 1%水平.
2郾 2摇 形成机制的复杂性
持留菌的形成最开始被认为可能与过量生成的
对细胞有毒害作用、并抑制其生长的蛋白有关.
Stewart[16]研究表明,重组的大肠杆菌 (Escherichia
coli)细胞体内过量生成的伴侣蛋白 DnaJ 与伤寒型
沙门氏菌过量生成的 PmrC 蛋白会使细菌细胞停止
生长,并使其表现出对氨苄青霉素与环丙沙星的高
耐受力.然而,这一简单机制并不能对自然界中各种
持留菌的形成做出解释.
大肠杆菌持留菌数量随时间的变化关系表明,
极少部分的持留菌在指数生长期的早期生成,然而,
到指数生长期的中期时,持留菌数量急剧增加,并进
入非增长的平稳状态. 为了探明早期产生的持留菌
是以接种的形式从亲代菌体直接引入,还是对抗生
素胁迫响应后新形成的,Ramage 等[17]通过反复稀
释与再生的方法将菌体维持在指数生长期,并保持
环境胁迫的一致性.经过 4 次循环以后,持留菌全部
消失.试验结果表明,持留菌很可能是预形成的,而
不是对抗生素胁迫产生的一种响应.
另有研究者指出,持留菌这一数量极少的亚群
里至少包括两种不同的持留性细胞,即玉型持留菌
(type 玉 persisters)和域型持留菌( type 域 persis鄄
ters) .其中玉型持留菌通过亲代的接种而引入,其数
量取决于稳定期亲代菌群内持留菌的数量,即接种
量.此类持留菌数量并不随生长周期的变化而变化.
域型持留菌可由普通细菌细胞通过一种表型转化机
制转化而形成.在这个过程中,域型持留菌又能持续
地转变成普通细胞.因此,域型持留菌的形成具有随
机性,其数量与亲代稳定期时菌体内持留菌的数量
关系不大[18] . Kussell等[19]的进一步研究表明,普通
细胞向持留细胞的转化速率更多地取决于外界环境
的改变频率,而与环境的选择压力关系较小.
2郾 3摇 分离、培养的不易性
对持留菌研究的一大关键难点在于其分离、获
得与培养的难操作性. 由于这一类亚群在野生型菌
群中所占比例极少,还存在持留细胞和普通细胞间
的持续转化,因此,很难获得足够量的持留菌用于试
验研究.直到 20 世纪 80 年代,Moyed 课题组的研究
在这一领域取得了突破性进展[20-22] . Moyed 等[20-21]
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分离到一株理想的大肠杆菌 hip 突变体,并从中寻
找到了位于染色体上的两个重要基因: hipA 与
hipB.研究发现,持留菌虽不是环境胁迫下产生的抗
性突变体,但 hip的等位基因 hipA7 的引入可以显著
提高氨苄西林暴露后持留菌的数量,与野生型菌群
中持留菌的数量相比提高了 10 万倍,最终可占群体
的 1% [23] .大肠杆菌 hip 突变持留菌的发现为后续
持留菌的研究创造了有利条件,研究者可通过 hipA
基因的引入获得足够量的用于试验研究的持留菌.
以 hipA7 基因的获得为基础,两种持留菌分离
方法随后得以建立,其中一种是 Keren 等[24]发明的
一种简易方法:通过将对数生长期的大肠杆菌暴露
于氨苄西林直至其裂解(约 3 h)后,通过离心的方
法获得存活细胞,即持留菌.该方法虽然操作简单快
捷,但误差大,适用对象少. 另一种方法也是该课题
组所发明,即利用持留菌处于休眠状态下的抗逆性
和低转录产出特性,将一个绿色荧光蛋白(GFP)报
告基因插入到被 rrnBPI 启动子所控制的大肠杆菌
染色体上的 att位点,经氧氟沙星暴露后,根据荧光
蛋白表达量的不同进行筛选(具有低 GFP 表达量的
细胞能够耐受氧氟沙星而存活),所得到的暗绿色
细胞即为持留细胞[25](图 1).该分离方法比第一种
方法更准确,但耗时长、成本高,不适宜于大范围应
用.
摇 摇 高孟秋[26]和陆宇等[27]通过应用低氧培养、定
量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸
裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及 85B 蛋白
的 mRNA表达变化的方法检测体内外模型中结核
分枝杆菌持留菌,成功建立了结核分枝杆菌持留状
态的体外及动物模型.尽管 ICLmRNA、Acr蛋白 mR鄄
NA的高表达可作为持留菌存在的标志,但该检测
方法在持留菌的分离方面仍存在一些欠缺.因此,更
快捷有效的持留菌分离方法尚有待于进一步开发.
3摇 持留菌的基因表达调控
Keren 等[29] 研究表明,与野生持留菌相比,
hipA7突变持留菌中有多个基因的表达下调,然而更
多基因(约为 300 种)的表达量上升.表达下调的基
因大多与能量产生以及其他的非必须功能(如鞭毛
的形成)有关,这一结果与持留菌处于休眠状态一
致.过度表达的基因大多属于功能已经确定的基因
家族,如基因 recA、umuDC、uvrAB、 sulA 等属于 SOS
家族;htrA、htpX、 cspH、clpB、cbpAB、clpB 等属于冷热
刺激响应家族;而绝大多数基因,如 dinJ / yafQ、
yefM、relBE、mazEF 为毒素鄄抗毒素 ( toxin鄄antitoxin,
TA)分子.
TA分子是由两个基因组成的操纵子,其中一个
基因编码一个稳定的毒素蛋白(可抑制一些重要的
细胞功能),另一个基因编码一个不稳定的、可以对
毒素蛋白进行中和的抗毒素蛋白,该蛋白对毒素蛋
白的表达具有自动调节作用. 有研究者认为 TA 分
子可在细胞处于逆境的胁迫下(如饥饿、抗生素作
用、DNA 损伤、热击等)诱发细胞程序死亡 ( pro鄄
grammed cell death,PCD) [30-31],但更多的研究证明,
图 1摇 一种持留细胞的分离方法[28]
Fig. 1摇 A method for isolating persisters.
907210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 龙冬艳等: 持留菌及其对微生物膜的耐受性影响研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇
TA分子并非导致细胞的死亡,而是抑制某些大分子
的合成,从而对细菌生长进行可逆地抑制[32-33] . 研
究表明,由毒素基因所引发的代谢停滞可被抗毒素
基因的表达所抑制[34-35] .
TA分子的存在在持留菌的基因调控过程中具有
极其重要的作用[36-37] .对大肠杆菌 hip突变体的深入
研究表明,该菌株发生突变的 hip 启动子是一种典型
的 TA分子,由两个特殊的基因(hipA 和 hipB)所组
成. hipA编码一个非常稳定的毒素蛋白(HipA),该蛋
白是大肠杆菌的一个关键持留因子;而位于 hipA 上
游的 hipB基因编码一个不稳定的同源的抗毒素蛋白
(HipB). HipB 与 HipA 紧密地连接在一起,从而将
HipA毒性中和,形成一个稳定的无毒复合体(HipBA
complex). HipBA 复合体与 HipB 都能与 DNA 结合,
从而可对 hip操纵子的转录活性进行抑制和调节,使
细胞进入休眠状态[38-39](图 2).
摇 摇 Schumacher 等[40]对 HipA鄄HipB鄄DNA 复合体的
结构研究发现,该复合体内部呈 70毅角,HipB 可与 2
个 HipA分子结合,并通过构象失活作用抑制 HipA
激酶活性.研究表明,持留菌体内 HipA毒素分子的存
在可阻止抗生素对靶位点功能的破坏而维持细胞存
活.因此,这类毒素鄄抗毒素(TA)分子的调节能帮助
细胞耐受极端环境压力,而不是将自身杀死(图 3).
4摇 持留菌在生物膜耐性中的作用
生物膜是一些微生物细胞由自身产生的多聚物
(主要为多糖)所包围而形成,且附着在浸有液体的
惰性或生物表面,具有结构的群落. 地球上 99%以
上的微生物都是以生物膜的形式存在[41] .生物膜的
形成是微生物用以抵抗外界环境中有毒有害物质毒
性,从而维持生存的一种策略. 越来越多的研究表
明,生物膜内的微生物能进行与多细胞生物体内细
胞分化类似的细胞特殊化过程[42-43] . 因此,生物膜
群体具有浮游细胞所没有的多种功能.其中,最典型
图 2摇 HipBA控制回路示意图[38]
Fig. 2摇 Schematic graph of HipBA control circuit[38] .
图 3摇 抗生素对细胞的作用模型(据文献[28-29]修改)
Fig. 3 摇 Model for effects of antibiotic on cells (Modified from
[28-29]).
A:抗生素与靶位点相结合并破坏其功能,导致细胞死亡 In normal
cell, the antibiotic bound to the target altering its function, which caused
cell death; B:基因突变菌株的细胞靶位点被改变,抗生素无法与之
结合,细胞维持生长,对抗生素表现出抗性 In mutant cell, the target
of the antibiotic was altered so that it failed to bind the antibiotic and the
cell became resistant to treatment with the drug; C:持留菌细胞中毒素
分子的存在可阻止抗生素与靶位点结合后对其功能的破坏,细胞进
入休眠状态,并对抗生素表现出耐性 In persister cell, a toxin molecule
inhibited the antibiotic target. This prevented the antibiotic from corrup鄄
tion functions, resulting in tolerance.
的是生物膜比游离微生物细胞具有更高的耐受抗生
素、杀菌剂和有毒金属离子的能力[44-46] .
研究表明,生物膜对抗生素、杀菌剂、重金属等
有毒有害物质的高耐受性是多种因素共同作用的结
果.例如,由微量营养元素与氧气的限制导致微生物
代谢的差异[47-48];群体效应调节基因表达所导致的
细胞生理状态与行为的改变[49-50];以及生物膜胞外
多聚物基质对有机分子和金属离子的吸附、水分的
保持和膜内外物质转运的调节作用[51]等. 然而,近
年来研究表明,生物膜的高耐药性与多金属耐性同
生物膜中持留菌的存活有着密切关系[52-53] .这类特
殊的细胞在微生物群落活动中发挥着极为重要的作
用,对生物膜的耐受力具有不可忽视的贡献.
4郾 1摇 持留菌对生物膜多药耐受性的影响
疾病预防控制中心的资料表明,发达国家中
65%的人类疾病都是由生物膜感染所致,如导致囊
性纤维化不治之症的绿脓杆菌(Pseudomonas aerugi鄄
nosa) [54],导致体内器官感染的金黄色葡糖球菌
(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococ鄄
cus epidermidis) [55]等都是通过生物膜的形式进行感
染.医学实践证明,绝大多数生物膜感染疾病具有高
复发性和难彻底治愈性,从而成为医学突破的一大
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瓶颈[56-57] .
研究表明,微生物生物膜中的持留菌数量比对
应游离细胞群体中的持留菌数量高 100 ~ 10000
倍[58],与之相对应,生物膜对抗生素的耐受能力比
游离微生物细胞高 10 ~ 100 倍[59-60] .在高浓度的杀
菌型抗生素药物的作用下,绝大多数致病性生物膜
内细胞与游离细胞可被杀死,持留菌则通过进入休
眠状态得以存活;游离的持留菌随后可被机体的免
疫系统进一步清除[61-63],而生物膜中大量多聚物的
存在可保护膜内持留菌免受免疫系统的攻击,因此,
生物膜中的持留菌能够在抗生素与免疫系统的双重
攻击下幸存;当停止用药或用药间隔期过长时,在非
药物或低浓度药物环境下,生物膜内存活的持留菌恢
复生长和增殖,再生出新的致病菌,导致继发生物膜
感染(图 4).因此,生物膜中持留菌的存在使生物膜
具有多药耐受性,从而导致相关疾病难以彻底治愈.
4郾 2摇 持留菌对生物膜多金属耐性的影响
随着学科的交叉与研究的拓展,一贯扮演着
“医学瓶颈冶角色的持留菌却由于其在逆境胁迫下
特殊的 “休眠鄄生长鄄增殖冶代谢模式而引起了环境
微生物学家的极大兴趣[65-69] .
Teitzel等[44]研究表明,Pseudomonas aeruginosa
生物膜对 Cu2+、Zn2+、Pb2+的耐性比其游离细胞高 2
~ 600 倍. Harrison 等[70]对 Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 的重金属耐受性研究也获得了相似的
结果:将该菌株以生物膜和游离细胞形式分别进行
图 4摇 生物膜药物抗性示意图[64]
Fig. 4摇 Schematic graph of biofilm drug resistance[64] .
培养后置于 Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+ 6 种不
同金属阳离子环境中,经 2 ~ 4 h 暴露后,其生物膜
对各种金属阳离子的耐性比对应游离微生物的金属
耐性高 2 ~ 25 倍. 含氧金属阴离子 CrO4 2-、AsO4 3-、
AsO2 -、SeO3 2-、TeO4 2-、TeO3 2-对生物膜和游离微生
物的毒性差异亦证实:生物膜比游离细胞具有更高
的耐受含氧金属离子的能力,对 TeO4 2-的耐受力高
出 310 倍.该试验中,螯合剂连二亚硫酸钠加入后并
未检测到有毒含氧金属离子在细胞膜上的滞留,这
说明生物膜对含氧金属离子的高耐受力更多地取决
于膜内持留菌在胁迫下的存活,而不是胞外多聚物
的鳌合作用[71] .
持留菌对生物膜多金属耐受性的贡献对于维持
微生物群落结构稳定有着重要意义,尽管其数量甚
微,且所再生的新生物膜与游离细胞并未体现出升
高的重金属抗性,但它们在高浓度重金属环境中存
活能够提高废水生物处理过程中生物膜抵抗高浓度
重金属污染废水的冲击负荷,对于维持系统稳定具
有重要作用.
5摇 总结与展望
持留菌对逆境的不应答性和代谢活动变化性使
其能够耐受抗生素、重金属等有害物质而存活,进而
在胁迫减弱或消失的条件下恢复增殖,持留菌的这
一特性使其在生物膜的多药耐受性与多金属耐受性
中扮演着重要的角色,对于维持微生物种群与群落
结构稳定具有重要意义.
目前有关持留菌的研究已逐渐受到医学微生物
学、环境微生物学、微生物生态学等领域研究者的广
泛关注,然而,仍有许多问题值得深入的探讨:1)成
熟的分离与检测方法的建立. 有关持留菌研究滞后
而难于广泛、深入开展的主要原因在于持留菌的数
量少、难于分离、不易培养.因此,很难获得满足试验
需要的足够量的持留细胞. 尽管 hipA7 基因的引入
可以提高持留菌的数量,但对于最能反映实际环境
的野生型持留菌的研究,仍需要将分离、培养方法这
一瓶颈作为突破点. 2)明确的形成与调控机理的探
明.目前已有关于持留菌形成机理的研究,但尚未获
得一致的结论.形成与调控机理的复杂性导致研究
条件难于把握,看似细微的试验条件差异很有可能
导致极大的持留菌数量差异,从而导致数据的平行
性差,处理困难,难以获得确定性结论.因此,有关持
留菌形成与调控机理的深入研究将成为未来研究工
作的一个重点. 3)有效的资源与工程应用研究. 持
117210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 龙冬艳等: 持留菌及其对微生物膜的耐受性影响研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇
久性生物膜感染疾病的治愈需要以持留菌的清除作
为突破,而环境污染物生物处理工程中所需要的耐
冲击负荷性能的获得可以持留菌的培育作为出发
点.因此,需要针对不同的研究目的和工程目的进行
有效的资源筛选并进行工程应用研究,从而为医学
研究的突破和环境治理的成功创造条件.
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作者简介摇 龙冬艳,女,1985 年生,博士研究生. 主要从事环
境微生物与土壤修复研究. E鄄mail: ldongyan210@ gmail. com
责任编辑摇 肖摇 红
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