全 文 ：携带污染物降解基因的可移动基因元件
及其介导的生物修复*
李摇 慧1**摇 周丽莎1 摇 王亚菲1 摇 Eva M. Top2 摇 张摇 颖1 摇 徐摇 慧1
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所中国科学院陆地生态过程重点实验室, 沈阳 110016; 2Department of Biological Sciences,
University of Idaho, Moscow ID 83844, USA)
摘摇 要摇 可移动基因元件(mobile genetic elements,MGEs)在环境微生物群落中的水平转移是
细菌基因组进化和适应特定环境压力的重要机制.在污染土壤和水体中接种携带具有降解基
因 MGEs的菌株后,随着 MGEs的水平基因转移,可使降解基因转移至具有竞争性的土著微生
物中并在其中表达,从而不必考虑供体菌在环境中是否能够长期存活.这种由可移动降解基
因元件水平转移介导的生物修复为探索新的生物修复途径提供了可行性.本文重点综述了环
境样品中携带降解基因 MGEs的多样性及其在促进污染物降解过程中的重要作用,介绍了从
环境样品中分离代谢 MGEs的方法,并列举了在污染土壤、活性污泥、其他生物反应器等生态
系统中 MGEs水平转移的几个实例.
关键词摇 可移动基因元件(MGEs) 摇 水平基因转移(HGT) 摇 外源分离法摇 生物修复
文章编号摇 1001-9332(2011)02-0526-11摇 中图分类号摇 Q938. 1摇 文献标识码摇 A
Degradative mobile genetic elements (MGEs) and their potential use in MGE鄄mediated bio鄄
degradation. LI Hui1, ZHOU Li鄄sha1, WANG Ya鄄fei1, Eva M. TOP2, ZHANG Ying1, XU Hui1
( 1Key Laboratory of Terrestrial Ecological Processes, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of
Sciences, Shenyang 110016, China; 2Department of Biological Sciences, University of Idaho,Moscow
ID 83844,USA) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(2): 526-536.
Abstract: The horizontal transfer of mobile genetic elements (MGEs) in environmental microbial
communities plays an important role in the evolution of bacterial genomes and the adaption of micro鄄
bial populations to specific environmental stress. Inoculation of the bacterial strains with MGEs with
pollutant鄄degrading gene and the subsequent horizontal transfer of the MGEs to one or various well鄄
established and competitive indigenous bacterial populations in an ecosystem will allow the catabolic
gene to be transferred and expressed in indigenous microbial populations, and hence, the survival of
the introduced donor strains is no longer needed to be considered. The MGE鄄mediated bioremedi鄄
ation provides the feasibility for developing new bioremediation strategies. This paper summarized
the diversity of MGEs with pollutant鄄degrading gene in the environment and the important roles of
these MGEs in promoting pollutant degradation, introduced the methodological approaches for the
isolation of the MGEs from environmental samples, and listed several studies that monitored the hor鄄
izontal transfer of the MGEs in polluted soil, activated sludge, and other bioreactors.
Key words: mobile genetic elements (MGEs); horizontal gene transfer (HGT); exogenous isola鄄
tion; bioremediation.
*国家自然科学基金项目(31070102)资助.
**通讯作者. E鄄mail: huili@ iae. ac. cn
2010鄄07鄄06 收稿,2010鄄11鄄10 接受.
摇 摇 可移动基因元件 ( mobile genetic elements,
MGEs)主要包括插入序列 ( IS)、转座子 ( trans鄄
posons)、整合子 ( integrons)、自转移广宿主质粒
(self鄄transmissible broad host range plasmids)、基因岛
(genomic islands)和噬菌体(phage)等.目前,诸多科
学家已开始广泛关注 MGEs 水平转移 ( horizontal
gene transfer)在细菌基因组进化和适应特定环境压
力过程中的重要作用. 最为大家熟知的例子就是由
滥用抗生素导致的抗生素抗性基因的广泛传播[1],
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 2 月摇 第 22 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2011,22(2): 526-536
目前已从临床耐药菌株中分离出多种携带抗性基因
的MGEs,并对其开展了较为深入的研究.
然而,人们很少关注污染环境样品中的 MGEs.
近年来,随着现代工农业的发展导致大量人造的异
生化合物( xenobiotic),如药物、杀虫剂、致癌物等,
进入各种生态系统(土壤、地表水、地下水等),这些
污染物为微生物代谢功能的进化提供了强大的选择
压力.在适合的环境条件下,某些土著微生物种群也
确实得以进化,具有了代谢一系列难降解物质的能
力,而编码这些代谢活性的遗传信息往往由具有自
我转移特性的质粒或其他 MGEs 所携带[2-4] . 对这
些具有代谢功能 MGEs特性的分析能够进一步揭示
在污染生态系统中,微生物群落是如何在原位建立
新的代谢途径的. 此外,在污染土壤和水体中接种
MGEs后,随着 MGEs在环境中的水平转移,代谢基
因转移至土著细菌并在其中表达,可使具有竞争性
的土著微生物获得降解能力,从而不必考虑供体菌
能否长时间存活.这种由可移动降解基因元件水平
转移介导的生物修复为探索新的生物修复途径提供
了可行性.
本文重点综述了环境样品中携带降解基因
MGEs的多样性及其在促进污染物降解过程中的重
要作用,介绍了从环境样品中分离 MGEs的方法,并
列举了在污染土壤、活性污泥和其它生物反应器等
生态系统中 MGEs水平转移的几个实例.
1摇 环境样品中的可移动基因元件(MGEs)
编码特定代谢基因的 MGEs在微生物适应环境
污染选择压力的过程中发挥着重要作用. 其机制可
能有两种,一种是通过代谢基因在微生物群落中传
播进而增加具有降解能力的功能微生物的多样性,
另一种是微生物群落中原来已存在的一些代谢基因
或部分基因片段通过重组从而构建出新的代谢途
径.这些携带代谢基因的 MGEs包括质粒、转座元件
以及一些带有类似噬菌体整合酶的元件(表 1).
1郾 1摇 代谢质粒
具有 MGEs 特征的代谢质粒大都具有广宿主
(broad host range)特性,所谓的“广宿主质粒冶被定
义为至少能够在变性细菌(proteobacteria)两个亚纲
(例如 茁鄄,酌鄄)之间互相转移并稳定传代的质粒[5] .
目前,已报道的参与污染物代谢的广宿主质粒还不
到 20 个,其中大部分为分子量大于 50 kb 的大质
粒.这些质粒包括: 降解 4鄄氯苯甲酸的 pSS60[6];降
解 3鄄氯苯甲酸的 pBRC60[7]、pAC25[8]、pENH91[9];
降解 2, 4鄄二氯苯氧乙酸 ( 2, 4鄄D) 的 pJP4[10] 和
pEMT1[11];降解对鄄甲苯磺酸的 pTSA[12];降解 1,3鄄
二氯丙烯的 pPC170[13];降解对硫磷的 pCS1[14];降
解 2鄄氯丙酸的 pUU204[15];降解 3鄄氯苯胺的 pC1鄄
3[16];降解 1,2,4,5鄄四氯苯的 pPS12鄄1[17];降解氯苯
的 pP51[18];降解阿特拉津的 pADP1[19];参与卤代乙
酸代谢的 pUO1[20] .还有新近报道的降解 酌鄄六氯环
己烷(六六六)的 pLB1[21] .此外,还包括参与石油烃
污染物降解的广宿主质粒,研究比较深入的有能够
降解甲苯、二甲苯的 pWW0(第一个被发现的 TOL
质粒) [22-23]和降解萘的 pDTG1 质粒[24] .随着相关研
究的深入,广宿主代谢质粒的数量仍将不断增加.在
已发现的这些广宿主代谢质粒中,编码降解天然存
在污染物的质粒与编码参与人造异生化合物代谢的
质粒存在很大差别. 编码天然有机污染物降解基因
的质粒大多为 IncP鄄2 和 IncP鄄9 质粒,而编码人造异
生化合物(如卤代芳烃)代谢基因的质粒往往属于
IncP鄄1 不相容群.
研究表明,携带降解基因的广宿主质粒在建立
新代谢途径的过程中发挥着非常重要的作用,这种
新的代谢途径通常是由来自不同微生物的代谢基因
或基因片段在一个合适的新宿主中进行重组而获得
的.例如,氯代芳烃降解质粒 pPS12鄄1[17]和 pP51[18],
其中的甲苯降解基因使氯代芳烃转化为氯代邻苯二
酚,与编码氯代邻苯二酚代谢的基因重组后,则构成
了针对异生化合物的新代谢途径.
1郾 2摇 转座子及其他可移动基因元件
根据携带污染物降解基因的代谢转座子结构,
可将其分为 I 类转座子和 II 类转座子. I 类转座子
是一种复合转座子,代谢基因的两端为正向或反向
插入的两个相同或高度同源的 IS序列;而 II类转座
子两端为短的末端反向重复序列,且 II 类转座子是
通过复制模式进行转座,需要转座酶和解离酶的参
与.代谢转座子通常位于质粒上,最为典型的是位于
TOL质粒和 NAH7 质粒上的 II 类转座子[4] . 此外,
还有一些 I 类代谢转座子由 IncP鄄1 质粒携带,例如
能够降解 3鄄氯苯甲酸的 pBRC60[7,27] .
1999 年,从多氯联苯 ( PCB)降解菌 Ralstonia
oxalatica A5 中分离到一种新的代谢 PCB 的
MGE[29],结构中包含了一个 55 kb 的联苯代谢转座
子 Tn4371,该转座子能彻底降解 4鄄氯联苯. 与 I 类
和 II类转座子不同的是,Tn4371 是以一种“剪切 /整
合冶的模式进行转座,而不是通过复制模式转座.对
该转座子的进一步分析表明,Tn4371 与接合转座子
7252 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李摇 慧等: 携带污染物降解基因的可移动基因元件及其介导的生物修复摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 1摇 不同类型代谢移动基因元件的典型示例
Table 1摇 Typical example of different types of catabolic mobile genetic elements
移动元件
Mobile elements
菌株
Strain
底物
Substrate
MGE大小
Size of
MGE (kb)
不相容群
Inc group
参考文献
Reference
质粒 plasmid
pSS60 Achromobacter sp. LBS1C1 4鄄氯苯甲酸 4鄄chlorobenzoic acid 53 P1 [6]
pBRC60 Alcaligenes sp. BR60 3鄄氯苯甲酸 3鄄chlorobenzoic acid 75 P1 [7]
pAC25 Pseudomonas putida AC858 3鄄氯苯甲酸 3鄄chlorobenzoic acid 117 - [8]
pENH91 Alcaligenes eutropha NH9 3鄄氯苯甲酸 3鄄chlorobenzoic acid 78 P1 [9]
pJP4 Ralstonia eutropha JMP134 2, 4鄄二氯苯氧乙酸 2,4鄄dichlorophenoxy acetic
acid
75 P1 [10]
pEMT鄄1 Exogenously isolated from 2,4鄄D鄄
treated soil
2, 4鄄二氯苯氧乙酸 2,4鄄dichlorophenoxy acetic
acid
- - [11]
pTSA Comamonas testosteroni T鄄2 对鄄甲苯磺酸 Toluene sulfonic acid 85 P1 [12]
pPC170 Pseudomonas cichori 170 1, 3鄄二氯丙烯 1,3鄄dichloropropene 60 P1 [13]
pCS1 Pseudomonas diminuta 对硫磷 Prarathion 68 - [14]
pUU204 Pseudomonas sp. E4 2鄄氯丙酸 2鄄chloro鄄propanoic acid 293 - [15]
pC1鄄3 Delftia acidovorans CA28 3鄄氯苯胺 m鄄chloroaniline - P1 [16]
pPS12鄄1 Burkholderia sp. PS12 1, 2, 4, 5鄄四氯苯 1,2,4,5鄄tetrachlorobenzene 85 P1 [17]
pP51 Pseudomonas sp. P51 氯苯 Chlorobenzene - - [18]
pADP1 Pseudomonas sp. ADP 阿特拉津 Atrazine 109 - [19]
pUO1 Delftia acidovorans B 卤代乙酸 Haloacetic acid 67 P1 [20]
pLB1 Exogenously isolated from HCH鄄
contaminated soil
酌鄄六氯环己烷(六六六)Hexachlorocyolohexane 66 - [21]
pWW0 (TOL) Pseudomonas putida mt鄄2 甲苯 / 二甲苯 Toluene / dimethyl benzene 117 P9 [22-23]
pDTG1 Pseudomonas putida NCIB 9816鄄4 萘 Naphthalene 83 P9 [24]
I 型转座子 Class I transposons
Tn5542 Pseudomonas putida ML2(pHMT112) 苯 Benzene 12 [25]
Tn5280 Pseudomonas sp. P51(pP51) 氯苯 Chlorobenzene 8郾 5 [26]
Tn5271 Alcaligenes sp. BR60 (pBRC60) 3鄄氯苯甲酸 3鄄chloro鄄Benzoic acid 17 [27]
Tn5707 Ralstonia eutropha NH9(pENH91) 3鄄氯苯甲酸 3鄄chloro鄄benzoic acid 15 [25]
DEH Pseudomonas putida PP3 氯代脂肪酸 Chloro鄄fatty acid 9郾 74 [28]
II 型转座子 Class II
transposons
Tn4651 Pseudomonas putida mt鄄2(pWWO) 甲苯 /二甲苯 Toluene / dimethyl benzene 56 [4]
Tn4653 Pseudomonas putida mt鄄2(pWWO) 甲苯 /二甲苯 Toluene / dimethyl benzene 70 [4]
Tn4656 Pseudomonas putida MT53(pWW53) 甲苯 / 二甲苯 Toluene / dimethyl benzene 39 [4]
Tn4655 Pseudomonas putida G7(NAH7) 萘 Naphthalene 38 [4]
其他 MGEs Other MGEs
Tn4371 Ralstonia oxalatica A5 联苯 / 4鄄氯联苯 Biphenyl / 4鄄Chlorobiphenyl 55 [29]
bph鄄sal element Pseudomonas putida KF715 苯 /水杨酸盐 Benzene / salicylate 90 [30]
clc element Pseudomonas sp. B13 氯代儿茶酚 Chloracetyl catechol 105 [3]
类似,其分子结构中包括类噬菌体整合酶基因、类假
单胞菌代谢基因和类质粒转移基因.
另一类比较特殊 MGEs 具有噬菌体相关功能,
被称为“ clc鄄元件冶,该元件是从 3鄄氯苯甲酸降解菌
Pseudomonas sp. B13 中分离出来的,编码氯代邻苯
二酚降解基因. 这个大小为 105 kb 的 MGE 可能是
利用类似于 P4 噬菌体的整合酶进行转座,先将代谢
基因从原来位置剪切下来,然后整合到新的靶 DNA
中.此外,该元件在整合过程中具有位点特异性,特
异识别甘氨酸 tRNA 基因位点. 在其他 MGEs 中也
发现了类似的 P4 型整合酶,包括致病性基因岛
(pathogenicity island)和共生岛( symbiosis island),
但 clc 元件的整合酶包含 250 个氨基酸,比其他 P4
型整合酶都要长.编码芳香化合物降解的基因通常
按整合酶类型进行分类,因此 clc元件有可能成为一
种新的“代谢基因岛冶的代表[3] .
综上,编码一系列天然存在污染物和人造有机
化合物代谢酶的基因往往由各种各样的 MGEs 携
带.并且有研究表明,这些元件在环境样品中通过不
同的转移、整合或复制机制使降解基因在土著微生
物群落中转移,是微生物群落适应环境选择压力和
构建新的污染物代谢途径的重要机制.例如,较确凿
的研究证据表明,在煤焦油污染土壤中,萘双加氧酶
基因在土著微生物群落中发生了自然水平基因转
825 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
移,并且其中一个萘降解质粒的水平转移是微生物
群落适应煤焦油污染压力的重要机制[31] . 此外,在
研究一株从氯苯(CB)污染地下水中分离出来的 CB
降解菌时发现,由于在水体环境中细菌之间发生了
基因重组,从而在该菌株中构建了一条新的 CB 代
谢途径,这也是该菌株适应 CB 污染的重要机制.这
种在原位发生的基因重组显著提高了环境中 CB 的
去除率[32] .
2摇 从水平基因库(HGP)中分离MGEs的方法
在自然生境中,介导细菌水平基因转移的MGEs
统称为水平基因库(horizontal gene pool,HGP) [33] .
研究环境样品中 MGEs 的分布和多样性,首先要从
环境样品 HGP中分离大量 MGEs,并进行全序列分
析.从环境样品中分离代谢质粒的技术大致有两类:
一是内源分离法 ( endogenous isolation),另一种是
外源分离法(exogenous isolation,图 1). 目前研究比
较透彻的代谢 MGEs,大都是从可培养的污染物降
解功能菌株中分离的(如表 1 中的大部分质粒),提
取质粒后进行自我转移性和遗传多样性分析,这种
传统的方法被称为内源分离法.近年来,也有一些新
的代谢质粒是直接通过外源质粒分离方法获得的.
例如: 表 1 中降解 2,4鄄D的 pEMT1[11];降解六六六
的 pLB1[21];还有一些类 pDTG1 质粒[31-34] .
2郾 1摇 从纯培养菌株中分离 MGEs(内源分离法)
传统内源质粒分离方法的一般技术流程为,纯
培养菌株在选择性培养基(添加抗生素、重金属、有
机污染物)或非选择性培养基中进行培养后,提取
质粒以验证其是否存在,该技术仅适用于环境样品
中优势可培养菌株含有质粒的情况. 对于质粒所编
码的表型特征的鉴定需要进行质粒消除 ( plasmid
curing)试验,或者将质粒转入一个表型特征已知的
宿主进一步研究.目前,分子生物学方法的应用也大
大推动了质粒编码表型特征的鉴定,例如 DNA 探
针、基因芯片及大规模高通量测序技术. 然而,对质
粒的全序列分析并不一定都能揭示其潜在的表型特
征.例如,在植物病原菌 Xylella fastidiosa 的基因组
序列中,就发现了一个隐秘质粒的存在[35] .
诸多研究表明,从不同环境样品中分离的许多
菌株均含有质粒. Powell 等[36]从糖甜菜叶表分离了
435 株细菌,其中 18%含有质粒. 在 62 株携带质粒
的革兰氏阴性菌中,有 61 株能够转移 IncQ 质粒
R300B. Erwinia herbicola 和 Brenneria salicis 中的可
自我转移质粒携带氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和
铜抗性基因,或镍抗性基因,或镍、铜、锌抗性基因,
而来自 Pseudomonas fluorescens中的自转移质粒编码
汞抗性基因. 提取这些质粒 DNA,与 Couturier 建立
的inc / rep探针系统进行杂交并初步确定其不相同
图 1摇 自然环境微生物群落水平基因库中质粒和其他 MGEs特性的研究方法
Fig. 1摇 Approaches for the characterization of plasmids and other MGEs from the horizontal gene pool in naturally occurring microbial
communities.
9252 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李摇 慧等: 携带污染物降解基因的可移动基因元件及其介导的生物修复摇 摇 摇 摇 摇 摇
群,结果表明,大部分 Klebsiella 和 Erwinia 菌株能够
与 repFIB或 repFIIA 探针杂交,而来自于其他宿主
的质粒与 Couturier 探针无同源性. Sobecky 等[37-38]
通过内源质粒分离法,研究了海洋底泥微生物及海
滩湿地杂草根区固氮菌的质粒多样性和丰度. 从海
洋底泥中所分离的菌株大部分都含有质粒,并且这
些质粒均不能与 Couturier 建立的探针系统杂交.从
海洋底泥分离的 琢鄄或 酌鄄 proteobacteria 菌株中提取
的质粒大小为 5 ~ 60 kb,扩增其复制起点功能区的
片段,通过杂交和序列分析表明,这些复制起点的序
列与以前所报道的质粒复制起点没有同源性. 应用
RAPD指纹图谱技术对质粒进行进一步遗传分型,
结果表明,这些质粒多样性很高并且绝大多数为隐
秘质粒.
内源质粒分离法的优点是可以明确知道所分离
质粒的原宿主,根据宿主的特性,可以预知质粒在不
同生态环境中的归宿. 但这种方法存在很大的局限
性,首先,大部分细菌是不可培养的,因此这种传统
的从可培养宿主中分离质粒的方法大大低估了广宿
主质粒的多样性;其次,这种方法不涉及质粒的转移
过程,因此在分离过程中不能确定所分离质粒的自
我转移特性.为了避免这一问题,建立了外源质粒分
离(exogenous plasmid isolation)方法,其中最为常见
的是“双亲配对法冶和“三亲配对法冶.
2郾 2摇 双亲配对外源分离法
双亲外源质粒分离法的基本原理为,环境样品
本源微生物群落作为 MGEs 的供体,通过与带有遗
传选择标记的受体菌之间进行接合转移,然后通过
质粒所编码的特定表型特征筛选接合子,从而从环
境样品中获得具有特定表型特征的 MGEs. Bale
等[39]首先将双亲配对外源分离技术用于从 Epili鄄
thon 河水样品中原位捕获汞抗性(Hgr)质粒. 所采
用的受体菌为携带利福平抗性基因(Rifr)的 Pseudo鄄
monas putida KT 2440,而河水样品土著微生物群落
作为携带 Hgr 质粒的供体. 通过接 Rifr 和 Hgr 双重
选择标记筛选接合子,就能够从环境样品中捕获具
有自我转移特性的 Hgr 质粒.这些质粒大多具有抗
UV的能力,但所有这些质粒都不编码抗生素抗性
基因.传统的不相容群测定表明,部分外源分离的质
粒属于 IncP鄄7 和 IncP鄄13 不相容群.目前,已有诸多
报道表明,采用 P. putida UWC1、P. fluorescens R2f、
Escherichia coli HB101、 Agrobacterium tumefaciens
UBAPF2、Sinorhizobium meliloti FP2鄄gfp 等菌株作为
受体菌,利用双亲外源质粒分离技术能够成功的从
环境样品中(土壤、根际、海水、污泥)分离广宿主的
重金属抗性质粒(主要为汞抗性质粒) [40-45]及抗生
素抗性质粒[46-47],但关于携带污染物降解基因的代
谢 MGEs的报道并不多.
Top等[11]采用改进的双亲外源分离法从 2,4鄄D
污染土壤中成功分离了携带 2,4鄄D降解基因的广宿
主质粒. 所采用的受体菌为携带利福平抗性基因
(Rifr) 的 Ralstonia eutropha JMP228,根据 EcoR I 限
制性酶切图谱,共分离了 7 个不同的质粒(pEMT1 ~
7),其中 6 个质粒 (pEMT2 ~ 7)属于 IncP鄄1 不相容
群,而 pEMT1 有可能是一个新型的广宿主质粒.
Stuart鄄Keil等[31]采用萘降解菌的质粒消除菌株作为
受体菌,利用双亲外源分离技术,从煤焦油污染土壤
和底泥中分离出 2 个广宿主萘降解质粒,这两个质
粒与分离自 Pseudomonas putida NCIB 9816鄄4 的萘降
解质粒 pDTG1 具有很高的同源性,因此称其为类鄄
pDTG1 质粒.
2郾 3摇 三亲配对外源分离法
双亲外源分离法的局限性在于,所分离的质粒
必须具有特定的表型特征,才能作为筛选接合子的
标记.为了克服局限性,在双亲配对法的基础上建立
了“三亲配对法冶,其接合配对的三方分别为:一个
携带小质粒的供体菌,该质粒可被移动但不能自我
转移(Tra鄄Mob+),并带有一定选择标记;一个染色
体带有选择标记的受体菌,该受体菌与供体菌在遗
传分类上最好是属于 Proteobacteria 的不同亚纲,这
样就能增加分离广宿主质粒的几率;第三方就是含
有广宿主可自我转移质粒(Tra+Mob+)的环境样品.
当三方进行接合配对时,供体菌质粒(Tra鄄Mob+)在
环境样品本源微生物群落所含有的可自我转移广宿
主质粒(Tra+Mob+)的协助下转移进入受体菌,通过
特定的筛选标记,就能够得到同时获得供体菌质粒
和自然环境中广宿主质粒的接合子(图 2),从而大
大扩展了所分离质粒的范围.
Hill等[48]率先将三亲配对外源分离技术应用
于从环境样品中分离广宿主质粒,所选用的受体菌
为 P. putida UWC5 (Rifr,Smr,Trp-),具有 Tra-Mob+
特性的小质粒为 pD10,该质粒携带卡那霉素抗性基
因(Kmr)并编码氯邻苯二酚代谢的关键基因. 经与
环境样品三亲配对,从岩石附生微生物群落中共分
离到 54 个广宿主质粒,其中 19 个质粒携带汞抗性
基因(Hgr). Top 等[49]采用改进的三亲配对法从污
染土壤和活性污泥中分离具有可自我转移特性的广
宿主质粒. 选择InQ质粒pMOL155作为三亲配对体
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图 2摇 采用三亲配对外源分离法从环境样品中分离自转移
广宿主质粒
Fig. 2 摇 Exogenous isolation of self鄄transmissible BHR plasmid
from environmental samples by triparental mating.
系中的 Tra-Mob+小质粒,该质粒的供体菌为 E. coli
CM330,并携带 czc 基因盒;所选用的受体菌为 R.
eutropha AE815 (Rifr).该三亲配对体系将 InQ质粒
从 酌鄄Proteobacteria菌株(E. coli)转移至 茁鄄Proteobac鄄
teria菌株(R. eutropha),因此大大增加了所分离质
粒的广宿主性.所分离的质粒一部分属于 IncP不相
容群,还有一些质粒与 IncP、IncN和 IncW的特异性
探针均不产生杂交信号,表明这些质粒有可能是新
型的广宿主质粒. 此后,van Elsas 等[50]又采用 Top
等改进的三亲配对体系,从小麦幼苗根际微生物群
落中分离出一个独特的广宿主质粒 pIPO2,该质粒
能够自我转移至 琢鄄、茁鄄、酌鄄Proteobacteria 菌株,也能
转移 IncQ质粒 pIE723.但 pIPO2 不属于任何已知的
不相容群,也不编码任何抗生素和重金属抗性基因.
摇 摇 尽管外源分离法较内源分离法具有很多优点,
但也存在一些缺点和局限性,例如,不能获得质粒原
宿主的信息,以及目前所采用的受体菌还局限于
Proteobacteria菌株等.因此,为了从环境样品中分离
尽可能多的广宿主质粒,有必要综合运用多种分离
技术.
3摇 MGEs的水平基因转移(HGT)及其介导的生物
修复
摇 摇 目前,对环境污染的主要微生物修复方式为,从
实验室分离高效功能微生物并投加到环境中加速污
染物的代谢.诸多研究表明,这种微生物修复技术对
降解不同土壤有机污染物是行之有效的[51] .但由于
接种的高效降解菌与土著微生物在营养和空间上的
竞争,以及环境中各种不利条件的影响,往往导致接
种的功能微生物很难定殖或长期存活,不能持久发
挥生物修复作用.这一问题成为制约微生物修复技
术高效、持久发挥作用的“瓶颈冶. 为避免上述“瓶
颈冶问题,接种携带具有特定降解基因 MGEs的菌株
是一种有效的解决方案.接种后,随着 MGEs在环境
中的水平基因转移(horizontal gene transfer),代谢基
因转移至土著细菌并在其中表达,可使具有竞争性
的土著微生物获得降解能力,从而不必考虑供体菌
的存活条件[52] . 已有报道证明,在环境样品中(土
壤、水体、生物反应器)接种携带 MGEs的菌株后,确
实能够发生水平基因转移,并且通过这种基因交换
使整个微生物群落降解污染物的能力有所提高. 这
种由可移动降解基因元件水平转移介导的生物修复
提出了与传统生物修复技术完全不同的思路和概
念,有望成为一种新的污染物生物修复途径.
3郾 1摇 由广宿主代谢质粒介导的污染土壤生物修复
De Rore等[53]最早报道了由广宿主质粒水平转
移介导的污染土壤生物修复. 供体菌 Enterobacter
agglomerans DK3 携带一个 IncP鄄1琢 质粒 RP4 宜
Tn4371,该质粒在转座子 Tn4371 中插入了编码联苯
降解的基因 bph(表 1).在接种后的 3 ~ 5 周,尽管供
体菌很快消失了,但质粒在土壤中发生了水平基因
转移(能够检测到接合子),使 bph 基因在不同的土
著微生物中表达,从而提高了联苯的去除率.
在已有的广宿主质粒介导的环境污染物生物修
复的报道中,有关除草剂 2,4鄄D 降解的研究较多.
diGiovanni等[54]的报道表明,当土壤中添加 1000
mg·kg-12,4鄄D时,IncP鄄1茁质粒 pJP4 从供体菌 Ral鄄
stonia eutropha JMP134 转移至土著微生物群落,从
而提高了 2,4鄄D 的降解率. 为了将供体菌对 2,4鄄D
的降解与接合子区分开来,Newby等[55]以 Escherich鄄
ia coli作为质粒 pJP4 的供体菌,该菌株本身及携带
质粒时均不能降解 2,4鄄D.研究结果表明,采用 2,4鄄
D处理的土壤中接合子数目显著高于无污染对照,
能够降解 2,4鄄D 的接合子主要为 Pseudomonas 和
Burkholderia. Top 等[11]采用较低的 2,4鄄D 处理浓度
(100 mg·kg鄄1)研究了不同广宿主 2,4鄄D 降解质粒
在土壤中的接合转移及其对 2,4鄄D的降解.首先,研
究了两个 2,4鄄D降解质粒 pEMT1 和 pEMT3,从供体
菌 E. coli向土著微生物群落的转移,结果表明 2,4鄄
D处理显著提高了接合子数量,同时在一定程度上
提高了 2,4鄄D 的去除率. 经过脂肪酸甲酯(FAME)
分析,含有质粒 pEMT1 的接合子属于 Stenotroph鄄
omonas 和 Ralstonia[56] . 之后, 又采用 P. putida
UWC3 作为质粒 pEMT1 的供体菌,同样检测到质粒
1352 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李摇 慧等: 携带污染物降解基因的可移动基因元件及其介导的生物修复摇 摇 摇 摇 摇 摇
在土壤中的转移和 2, 4鄄D 降解率的提高,含有
pEMT1 的接合子鉴定为 R. eutropha[57] . 最后,比较
了 2,4鄄D降解质粒 pEMT1 和 pJP4 在砂壤土不同土
层 A(0 ~ 30 cm)和 B(30 ~ 60 cm)中的水平转移,结
果显示,这两个质粒均在 B 层发生了水平转移并能
够有效促进 2,4鄄D 的降解.对 B 层土壤微生物群落
结构的 DGGE分析表明,土壤中特定微生物类群通
过水平基因转移获得了降解基因并增殖成为群落中
的优势种群,从而提高了污染物的去除效率. 对 95
个能够利用 2,4鄄D 的接合子的遗传分析表明,质粒
pEMT1 和 pJP4 的宿主范围差别不大,并且 A层和 B
层的接合子遗传归属基本相同,主要为 Burkholde鄄
ria、Ralstonia和 Stenotrophomonas maltophilia[58] .
此外,广宿主质粒水平基因转移介导的污染物
降解还应用于根际修复中( rhizoremediation). Crow鄄
ley 等[59]报道了由广宿主代谢质粒介导的 2,5鄄二氯
苯甲酸 (2,5鄄DCB)污染土壤的根际修复作用.在污
染土壤中种植菜豆(Phaseolus vulgaris)并接种携带
2,5鄄DCB 降解质粒的供体菌 P. fluorescens,结果在
接种降解质粒的土壤中发现了很多与供体菌不同的
2,5鄄DCB降解菌,这些菌株被认为是获得了代谢质
粒的接合子. 尽管缺少直接证据,但可以推断 2,5鄄
DCB降解率的提高是由质粒的水平转移介导的. Sa鄄
rand 等[60]在种植松树幼苗的土壤中接种了携带
TOL质粒的 P. fluorescens,这些松树幼苗已被乳牛
肝菌( Suillus bovinus)根际化. 经过对鄄甲苯甲酸盐
(mTA)处理 3 个月后,发现代谢质粒转移至土壤微
生物群落.尽管没有具体测定 mTA 的去除率,但接
种携带 TOL质粒的 P. fluorescens 后,对植物和菌根
真菌均表现出一定的保护作用. 由于处理后检测不
到供体菌的存在,因此,这种保护作用可以认为是获
得代谢质粒的接合子所介导的.与根外土壤相比,菌
根环境可能更有利于广宿主代谢质粒的高效转移并
发挥其代谢活性,因此,菌根修复与代谢质粒水平转
移的结合有可能取得更好的生物修复效果.
上述研究表明,在污染土壤中接种携带广宿主
代谢质粒菌株和其后的质粒水平转移能够有效促进
污染物的降解.但在这一过程中,还存在很多影响因
素,例如土壤类型、污染程度、供体菌种类、质粒、接
种和培养条件等.对这些影响因素的进一步研究,将
有助于深入开发这一新的污染土壤生物修复技术.
3郾 2摇 活性污泥及其他污水处理反应器中代谢质粒
的转移及其介导的生物修复作用
在活性污泥或其他污水处理系统中接种携带广
宿主代谢质粒菌株以促进难降解物质代谢的报道并
不多,并且在这些报道中,没有具体阐明接合子对降
解的促进作用. 1989 年,McClure 等[61]在加入 3鄄氯
苯甲酸 (3CBA)的活性污泥系统中接种了携带
3CBA降解质粒的供体菌 P. putida,该质粒为非接
合 IncQ质粒.研究结果表明,不携带质粒的供体菌
在污泥系统中能够长时间存活,但并不能降解
3CBA;而接种携带代谢质粒的供体菌后,检测到
3CBA的降解,但仍缺少直接证据证明这一降解过
程是由代谢质粒水平转移至污泥系统本源细菌群落
所介导的.
N俟sslein 等[62]在活性污泥系统中接种了基因改
造菌株 Pseudomonas sp. B13FR1,该菌株携带一个
能够同时降解 3CBA 和 4鄄甲基安息香酸盐 (4MBA)
的非接合可移动质粒 pFRC20P.接种 3 d后,与未接
种对照相比,3CBA 和 4MBA的浓度显著下降.但是
由于质粒 pFRC20P是非自我转移质粒,本身不能发
生接合转移,要依赖存在于污泥系统中的接合质粒
转移至污泥本源微生物群落,接合效率是非常低的.
因此,也不能够确定污染物降解是否与代谢质粒的
接合转移有关.
编码氯代邻苯二酚降解的“ clc鄄元件冶在活性污
泥和膜反应器中水平转移的报道相对较多. Ravatn
等[63]采用 Pseudomonas B13 作为供体菌,P. putida
F1 作为受体菌,同时接种活性污泥系统. 这两株菌
均不能降解氯苯(CB),但当 F1 接受 clc鄄元件后,通
过降解途径的互补,便可以获得降解 CB 的能力.当
污泥系统中添加供体菌底物 3CBA和 1,4鄄二氯苯甲
酸(1,4鄄DCB)时,供体菌数量增加,接合效率较高.
但该研究中并未调查这种基因交换是否对污染物的
降解产生影响.由 clc鄄元件介导 3CBA降解的直接证
据来自于 Ghyoot 等[64]的报道,他们在两个不同的
活性污泥系统中接种了 P. putida BN210,该菌株染
色体上携带 clc鄄元件. 其中一个模型为传统的活性
污泥系统(CAS),另一个活性污泥系统配有膜分离
装置(CAS鄄MS),该装置能够增加主反应器的生物
量密度.在两个反应系统中,供体菌 BN210 均消失,
但在 CAS鄄MS 系统中,参与 3CBA 降解的种群建立
的更快一些,3CBA 的降解速率也更高. 采用 PCR鄄
DGGE技术分析污泥系统中的 clc 基因,结果表明,
尽管供体菌数量减少,但 clc元件在反应器中始终维
持较高的水平,表明该元件已转移至污泥本源微生
物群落. clc鄄元件的原位水平转移在处理含 3CBA 模
式废水的膜生物反应器中也有报道[65],供体菌仍为
235 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
P. putida BN210.在膜生物反应器中,细胞间的接触
十分紧密,这促进了 MGEs 的水平转移效率. 接种
后,供体菌逐渐消失,而被一些新的 3CBA降解种群
所取代;而在未接种的反应器中,并未分离到 3CBA
降解菌,也未检测到 3CBA 的降解. 采用 clc鄄元件特
异探针与基因组 DNA 进行 Southern 杂交和倒转电
场凝胶电泳 ( field inversion gel electrophoresis,
FIGE),分析表明,在 3CBA 降解菌株中存在一个或
多个 clc鄄元件拷贝.这些数据充分证明了新的 3CBA
降解种群是通过 clc 基因的原位水平转移而获得降
解能力的,而这些本源微生物在活性污泥系统中比
供体菌更具有竞争力.
上述几例报道表明,由代谢基因转移介导的生
物修复作用在污水处理反应器中的效果与土壤系统
相比并不十分理想. 这可能是由于在污水处理系统
中的相关研究较少,因此对该系统中促进或抑制
MGEs 水平转移的因素还不是十分清楚. 质粒发生
接合转移的主要条件为细胞密度,以使供体菌和受
体菌发生紧密接触. Mancini 等[66]的研究表明,在细
胞密度较高的初沉池中,接合子数量最多,而细胞密
度较低的二沉池接合子数量较低.因此,有必要更深
入地研究在活性污泥系统中哪些是接合转移发生的
热点区域.尽管目前在活性污泥及其他污水处理反
应器中,有关代谢基因转移介导的生物修复作用研
究还很少,但我们有理由相信在这些生态系统中接
种 MGEs仍是促进污染物降解的有效手段之一.
4摇 问题与展望
代谢 MGEs的水平转移是环境样品本源微生物
群落适应污染物(特别是人造异生化合物)选择压
力和促进污染物降解的重要机制之一. 本文重点阐
述了环境样品中参与污染物降解的 MGEs,介绍了
从环境样品中分离携带特定降解基因 MGEs 的方
法,并以土壤和污水处理反应器两个生态系统为例,
列举了通过接种携带 MGEs的菌株从而促进污染物
降解的几个实例.但相关领域的研究仍有很多问题
需要进一步探索,例如,环境中的水平基因转移是如
何发生的,在哪里发生的,以什么速率发生以及在哪
些微生物之间发生? MGEs 在环境样品中是如何维
持稳定的,在没有环境选择压力的条件下,它们是否
还能稳定存在于微生物群落中,能维持多久? 这些
特定遗传元件的转移是否存在物种间的屏障? 它们
的前体基因是什么? 此外,利用 MGEs 治理环境污
染,还必须考虑 MGEs 释放到环境中后的生物安全
性问题.为了回答这些问题我们需要更多了解 HGT
调控的分子机制,以及 MGEs捕获基因的方式.
采用外源和内源分离方法从水平基因库中分离
MGEs,是研究 MGEs多样性的重要前提.但是,正如
文中所述,几种 MGEs分离方法各有优缺点,因此综
合运用图 2 中总结的多种方法从环境样品中分离
MGEs,才能更完整的获得样品中 MGEs的多样性和
丰度信息,也能更好的了解它们对细菌基因组进化
的贡献.随着 MGEs的序列信息越来越丰富,使我们
能够采用基因芯片技术对更多新分离的 MGEs进行
分析.例如,将广宿主质粒全序列以 PCR 产物或寡
核苷酸的形式制作高密度基因芯片,对我们研究新
分离 MGEs的遗传系统发育关系具有重要作用. 此
外,随着基因组学和蛋白质组学研究工具的飞速发
展,使我们能够研究更多新的问题,例如在复杂微生
物群落体系中 MGEs 的生态学,或者 MGEs 之间的
相互作用,以便更好地了解它们的生态功能.
由于在土壤和污水处理反应器生态系统中存在
诸多限制因素,携带降解基因的 MGEs 的水平转移
与环境污染物降解之间的关系尚不明确,还需要进
一步探索.例如,探究在这些生态系统中促进基因转
移的条件;某些携带降解基因的 MGEs 的天然宿主
范围及其代谢基因的表达范围;接合子在环境中的
竞争适应能力;低浓度污染物存在时 MGEs 在环境
样品中的动态.此外,我们还要了解在土壤、水体、生
物膜等微环境中,细菌之间相互作用的调控信号,例
如在微环境中细菌的生理和运动行为;它们在群落
水平对污染胁迫的响应;在环境样品中本源存在的
MGEs 是如何产生的以及它们的可转移活性;影响
群落鄄菌株行为、基因转移和突变率的环境因素等.
检测微生物群落和基因功能的分子生物学工具的进
一步发展将对这些研究起到促进和推动作用.
对于携带污染物降解基因的 MGEs的宏观和微
观行为的深入研究将有助于我们了解污染环境胁迫
下微生物群落适应污染物胁迫的生态学过程,并探
索促进污染物降解的新的生物修复手段. 尽管国外
在相关领域已开展了诸多研究,但国内尚未有科研
人员关注这一领域,相关研究也处于空白阶段.我国
幅员辽阔,环境复杂多样,必然蕴藏着丰富的 MGEs
资源.本综述旨在让国内更多微生物分子生态学领
域的学者了解这一领域,以便为以后相关工作的开
展奠定基础.
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作者简介 摇 李 摇 慧,女,1977 年生,博士,副研究员. 主要从
事微生物分子生态学和生物修复技术研究. E鄄mail: huili@
iae. ac. cn
责任编辑摇 肖摇 红
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