全 文 ：植物生理学报 , 19 9 2 , 1 8 ( 3 ) : 2 3 9 一 2 4 5
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2 3 9
紫云英根瘤菌胞外多糖缺失变种及其结瘤性状的变化
龙北 国 王 江海 宋鸿遇
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2 0 0 0 32)
提 要
根据紫云英根瘤菌在寄主豆科植物紫云英上
的结瘤能力 , 经转座子 T ns 诱变获得的18 株 xE o -
变种可分为 4种结瘤类群 ( A 一 D ) : A 类变种诱导
植物产生小的瘤状突起 , 不具固氮能力 ; B 类变种
形成无效根瘤 ; C 类变种产生固氮效率降低的根
瘤 ; D 类变种丧失了结瘤能力 。电镜分析显示 : 无
效瘤和瘤状突起中不存在类菌体区 , 根瘤细胞均
为不含细菌的空细胞 ,侵染线不能穿透到根瘤细
胞中 。 说明紫云英根瘤菌胞外多糖很可能参与有
效根瘤的形成 。
性 没有改变 , 或 固氮效率降低 ( M ul le r 等
1 9 8 8 )
。
转座子诱导技术可用于分离紫云英
根瘤菌 E x o 一变种 , (陈汉才等 19 9 0 ) 。 从紫
云英根瘤菌菌株 1 07 中 , 我们分离到一批
E x 。 一变种 。这些变种诱导寄主植物产生不
同的结瘤反应 , 表明 E P S 合成 的缺陷会导
致根瘤菌共生特性的改变 。
材 料 与 方 法
关链词 : 转座子诱变 , 胞外多糖合成 , 根瘤菌 , 结
瘤
根瘤菌与豆科植物相互作用 ,导致有
效根瘤的形成 ( aB u e r 1 9 5 1 , L o n g 19 8 9 ) 。 两
者的最初接触涉及双方的细胞表面分子 ,
因此根 瘤菌 胞外多糖 ( e x o卯 l y sa c c h a t id e ,
EsP ) 的研究备受重视 。越来越多的证据表
明 : E P s 对根瘤菌侵染植物和有效根瘤的
形 成有 着重 要作用 ( H a l v e r s o n 等 19 8 6 ,
n j o r d je v ic M A 等 19 5 7 ) 。 筛选各种根瘤菌
胞外多糖缺陷型 ( E邓 一 d e f i e i e n t , E x o 一 )变
种 已成为研 究 E P S 在共 生固氮 中生理作
用 的重要手 段 ( e h e n 等 1 9 8 5 , G la z e b r o k
等 198 9 ) 。 一些 E xo 一变种丧失了结瘤能力
( eL ig h 等 19 8 5 ) ,一些变种形成没有 固氮
活性的 空瘤或瘤状突 起 ( oL gn 等 1 9 8 8 ,
G l a z e b r o k 等 1 9 8 9 ) 。 一些变种 的共生特
菌种和培养方法 紫云英根瘤菌 (勿瘫动勿阴 酬川 -
州璐 )菌株 107 作为分离 E xo 一 变种的出发菌 。介
c饭护幼几如戚 s m l o 一 SP u P 1 0 1 1 ( S im o n 等 19 8 2 )用于
转座子 T sn 诱变菌株 1 07 。 根瘤菌生长培养基为
B M M
、
T Y 或 m in ima l ( R of f e 等 1 9 5 0 ) , 温度 为
2 8℃ 。 E . 械 生长培养基为 L B ( R of f e 等 1 9 8 0 ) , 温
度为37 ℃ 。
转座子诱变 E .碱 S m lo 一声U P 1 0 1 1携带的质粒
p A C Y C 18 4一M ob , , T n s不能在根瘤菌中复制和传
代 , 但 T ns 能以转座方式插入到根瘤菌基因组中 ,
方法见陈汉才等 ( 1 9 91 ) 。
胞外多枪产 t 的分析 参见 lG az e br o k 等 ( 1 9 8 9)
的方法 。
质粒显示 参见 p la z in s ki 等 ( 1 9 8 5 )的方法 。
结 果
E x o 一变种的分离
z 9 9 x
一
07
一
0咬收到 , 19 9 1一 12 一2 7修回 。
国家基础性研 究重大关键项目基金资助课题 。
植 物 生 理 学 报 1 8卷
图 1 紫云英根瘤菌菌株17 0及其 Exo 一衍生菌的菌落形态比较
F i g
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紫云英根瘤菌菌株 1 07 能产生大量的
胞外多糖 ( EsP ) , 在各种实验培养基上 ,
形 成含大量粘液的光滑 型 ( E xo +) 菌落
(图 l a) 。通过筛选转座子 hT s随机插人的
变种 , 获得 18 株粗糙型 ( E xo 一 )菌落 ( 图
l b)
, 出现频率约为瓜 (卡那霉素抗性 ) 菌
落的 l x 1 0一“ 。 所有 E xo 一变种的 ESP 产量
明显降低 , 约为亲本菌菌株 E p S 水平的
0
.
9% ~ 10
.
3% (表略 ) 。 每个 E xo 一变种只
对 K 。 ( hT s携带的抗药标记 )具有抗性 , 而
对青霉素 ( T sn 的载体质粒 p A C Y C 1 84 所
携带的抗药标记 ) 敏感 , 说明突变是 由于
nT s插入 ,而不是 T sn 连同载体质粒整合
( i n t e g r a t e )到菌株 l p 7的基因组所致 。菌株
10 7含有 2个超大质粒 ( m e g a p las m id ) ,每个
E x o 一 变种也含有 2个大小与亲本菌相似
的质粒 (图 2 ) ,进一步证实这些变种是菌
株 1 07 的衍生菌 。
E x 。 一变种的结瘤分析
野生型菌株 1 07 能诱导寄主植物紫云
英产生有效根瘤 (F ix + ) 。根瘤通常在接种
约 1个星期后出现 , 3个星期后呈绿色圆柱
型 (图版 卜 l ) ,并具有 固氮活性 。 为了研
图 2 凝胶电泳显示菌株 107 及其 Exo 一衍生菌的
质粒情况
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比 n e l , 1 0 7 ; lan e Z , N A 一 0 1 ; l a n e 3 , N A 一 0 2 ·
究胞外多糖合成的缺陷是否影 响根瘤菌
的共生特性 ,我们将所有 18 株 Exo 一 变种
回接到紫云英植株上 , 以检测根瘤能否
3期 紫云英根瘤菌胞外多糖缺失变种及其结瘤性状的变化
两`砚名,.
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表 l
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宿主紫云英对紫云英根瘤菌 E sP 合成缺陷型变种的结瘤反应
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6 8
5 2
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o f P l a n t s t e s t e d a r e 1 8
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形成 、 根瘤出现 的起始时间 、 根瘤的发育
及固氮能力等 ,结果见表 1 。
菌株 1 07 经转座子 T n s诱变后 , 随机
挑取 10 个 K 耘 E xo + 菌落分别接种到紫云
英上 ,均能产生有固氮能力的根瘤 , 这表
明 T n s的插入并不影响 E xo + 结合子的有
效结瘤能力 。 E xo 一变 种则引起植物产生
不同的结瘤反应 。根据共生特性的不同 ,
18 株 Exo 一变种可分为 4种结瘤类群 ( A ,’
B
,
C 和 D ) 。
A 类 E xo 一变种形成 小的瘤状突起结
构 ( 图 版 I 一 2 ) ( e a 一11一或 。 a l l u s 一 l ik e S t r u e -
ut er s )
, 不具 固氮活性 。 B 类变种产生圆球
形无效根瘤 ( iF x 一 ) 。 c 类变种诱导植物形
成有效瘤 , 但固氮效率低于亲本菌 。根瘤
或瘤状突起出现的时间比亲本菌延迟 3~
5天 。 D 类变种丧失了结瘤能力 。
按照 D ho e r t y 等 ( 1 9 8 8 )方法 , 我们从
根瘤或 瘤状 突起 中重新分离 出大量 的
E x 。 一菌落 , 它 们的抗药性标记和共 生特
性都和原接种菌一致 。 可见 , E xo 一变种的
遗传性状稳定 。
植 物 生 理 学 报 1 8卷
上述 结果 表明 : 根瘤菌合成 E PS的
生理缺陷 , 导致了共生特性的改变 。
根瘤组织的电镜分析
电镜观察发现 ,亲本菌 1 07 所形成 的
有效根瘤具有明显的类菌体区 ,根瘤细胞
中充满了杆状类菌体 ,包裹根瘤菌的侵染
线广泛存在于根瘤细胞或细胞间隙中 (图
版 五一 ) 。
由 B 类变种产生的无效瘤以及 A 类
变种产生的瘤状突起在电镜切片分析中
都显示 : ( )] 没有类菌体区 ,根瘤细胞都是
不含细菌的空细胞 。 ( 2) 侵染线仍然形成 ,
但只存在于细胞间隙中 , 不能穿透到细胞
内 (图版 l 一 2 ) 。 ( 3) 根瘤菌被侵染线包围 ,
偶尔有少数释放到根瘤细胞间隙或表层
细胞中 。 和无效瘤不同的是 , 瘤状突起 中
侵染线数量明显减少 。
讨 论
利用转座子 T n s诱变技术 ,我们成功
地筛选到一批紫云英根瘤菌胞外多糖缺
陷型变种 ,这些基因型不同而表现型相似
的 E x o 一变种在宿主植物上引起不同的共
生缺陷 ,这 表明紫云英根瘤菌 E P s 可能
参与有效根瘤的形成 。 根据 E xo 一 变种在
紫云英上的结瘤能力 , 18 株变种可分为 4
种结瘤类群 。
电镜观察显示 : 变种产生的无效瘤或
瘤状突起中没有类菌体区 ,侵染线不能穿
透到根瘤细 胞中 , 这说明 由于变 种 E P s
合成的生理缺陷 ,可能导致 : ( l) 变种不能
被宿主植物识别 ,从而丧失侵染能力 ; ( 2)
变种侵入根毛后 ,其进一步侵染受到植物
合成的抗菌物质的干扰 ,根皮层细胞分化
增殖和侵染线发育受阻 ,形成瘤状突起结
构 ,或结瘤起始延迟 ,根瘤菌分化受到影
响不能产生有效根瘤 。 带有菌株 107 多糖
位 点 D N A 片段 的 R一 rP im 。 质粒 , 不仅可
以互补 E xo 一变种 E P S 合成的缺陷 , 而且
恢复了这些变种的有效结瘤能 力 (待 发
表 ) 。上述结果简言之 : E xo 一变种 的共 生
缺陷是因 E SP 合成改变所致 。
E P s 在共生固氮 中可能具有 多重作
用 ( H a lv e r s o n 等 19 8 6 , D jo r d je v ie M A 等
198 7 )
, 如作为细菌屏障抵抗或逃避植物
防御反应 、 专一性识别 、 作为信号 、 诱导侵
染线和根瘤的形成 、 构成侵染线等 。 目前
认为 : E P S 的特定结构影响根瘤菌有效结
瘤能 力 ( M o l le r 等 2 9 8 8 , D j o r d je v i e S p 等
19 87 )
。 尽管本研究的所有变种的表型均
是 E xo 一 , 但突变可能是 由于转座子 T ns
直接插入到编码 E P s 生物合成的 ex o 基
因中 ,或者插入到编码细胞膜表面分子的
基 因中 , 使 E P s 不再合成 。 因此 , 不同的
E x 。 一变种在 E P S 产量和结构上可能存在
某些差异 , 从而表现 出不同的结瘤性状 。
为 了阐明胞外多糖在共生固氮中的生理
作用 , 需要对 E xo 一 变种的遗传背景及多
糖组分作更深入的研究 。
参 考 文 献
陈汉 才 、 郁宝麟 、 郭 一松 、 宋鸿遇 。 更 豆 根 瘤 菌
N G R 23 」和紫云英根瘤菌 1 09 感染紫 云英的 比较
研究 。 实验生物学报 一9 9 0 , 2 3 : 35 1一 3 5 9
陈汉才 、 龙北国 、 宋鸿遇 。 紫云英根瘤菌胞外多糖缺
陷型变种的分离及遗传分析 。 生物工程学报
19 9 1 , 7 : 1 24一 13 1
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3期 紫云英根瘤菌胞外多糖缺失变种及其结瘤性状的变化 2 4 3
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A l l t h e m u at n t s ( T a bl e l )
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A e e o r d i n g t o t h e s e d i f f e r
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,
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e r e e l a s s i f i e d i n t o 」
t h e i r 曲 e n o t y pe s w e r e n o t a l t e r e d b y g r o u P s ( A , B , C , D ) .
d i f f e r e n t k i n d s a n d e on e
e n t r a t i o n s o f
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T h e b a e t e r i a l i s o l a t e s r e e o v e r e d
e a r b o h y d r a t e s s u P lP e m e n t e d t o t h e f r o m b o t h F i x + a n d F i x 一 n o d u l e s a n d
g r o w i n g m e d i a
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一
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e n i n s e r t e d i n t o hR i及乃触 n l g e n e t i e s e 一 m i e r os e o P i e e x a m i n a t i o n t h e F i x 一 n od -
q u e n e e , w h i le t h e v e e t o r Pl a s m i d d i d n o t u l e s a P p e a r e d t o e o n t a i n n o
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s id e n t i e a l w i t h b a e t e r i a ( P l a t e 皿 一 2 ) , w h i l e t h e
t o t h o se o f t h
e 胆 r e n t a l s t r a i n ( F i g . 2 ) , s u g g e s t t h a t E SP o f R . 吕宽沪。州从 , 15 i n t i -
d e m o n st r a t i n g t h a t a l l E x o 一 m u at n t s m a t e l y i n v o lv e d i n t h e d e v e l o Pm e n t o f
w e r e d e r i v e d f r om t h
e 阳 r e n at l s t r a i n . e f f e e t i v e n do u le s .
T h e w i l d t y p e s t r a i n 1 0 7 c
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一 K e y w or 山 :
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、 , t r a n s因 s o n m u t a g e n e s i s , e x -
d u e e d o n it s h o s t
, 月皮了a卯 l之绍
~
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b r o w n
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