全 文 ：2 0 3中 国 科 学 基 金
` 成果简介 ·
绿色荧光蛋白基因 ( gP ) f在华癸中生根瘤菌与
紫云英共生固氮作用研究中的应用
周俊初 史巧娟 谢 波
( 华中农业大 学农业部农业 微生物重点实验室 , 武汉 4 3 00 70)
【关键词 〕 绿色荧光蛋白基 因 ( g fP ) , 华癸中生根瘤菌 ,启动子探针载体
绿色荧光蛋 白 (缈 e n fl u o er s e e nt p or t e in , G F p )最
初是从维多利亚多管水母 ( eA q uD ir a 。 ict ior a) 中发现
的发光蛋白! ` 。 天然 G F P 的生色团 由 6 5 一67 位 S er -
yr
r 一
lG y 的氨基酸残基组成 , 并经环化和脱氢形成一
个咪哇环巨 。 其最大激发峰为 395 n m ,在 4 75 n m 处
有一副激发峰 ,最大发射峰位于 5 10 n m 。 脚作为一
种新型的报告基因具有许多优越性 : 首先它分子量
较小 , 只编码 2 38 个氨基酸 的多肚 , 对 细胞 没有毒
性 ,不 于扰标记蛋白的功能和定位 。 其分子结构及
光谱特性稳定 , 能在 多种条件下研究 。 在多数情况
下 , G F P 的异源表达并不影 响细胞的正常 活动 , 另
外 , G F P 是 目前唯一能在异源细胞 内表达并 自发产
生荧光的蛋白 , 由于不需要辅助因子的参与 ,故可直
接用于活体测定 。 可以说 , G F P 是 当前研究 活体细
胞中基因表达和蛋 白质分布的最好手段之一 ,具有
广` 阔的应用前景 。 自从 19 94 年 Ch al if e 等首次在大
肠杆菌和线虫中表达 脚上’ 〕以来 , 迄今为止 , G FP 已
在多种生物 , 如细菌 、 蓝细菌 、 粘菌 、 酵母 、植物和哺
乳动物中表达和应用 。 G F P 的这一种属不依赖的特
性使其成为广泛运用的荧光标记分子 ,尤其适用 于
监测基因表达和活体内蛋白质定位等研究 。
豆科植物紫云英 ( sA t r “ g 口 lus 、 in ic us )是生长于我
国南方的一种重 要绿肥 和蜜源 , 华癸 中生 根瘤 菌
( Me so hr o ib
u m h au ku i )感染紫云英后形成有效固氮
的根瘤 , 在互接 种族 中独属一族风 5子。 华癸 中生根
瘤菌一紫云英共生 固氮体 系是我 国独特的共生固氮
资源 ,与其他代表性根瘤菌相 比 , 目前有关华癸 中生
根瘤菌参与早期结瘤过程 的基因定位 、 结构和功能
等的报道仍十分落后 。 本研究室过去已在营养 、 生
理 、 共生过程的细胞分化及分类地位等方面进行 了
大量的研究工作 。 近年来在国家 自然科学基金的支
持下 ,又以 脚 为报告基 因开展了华癸 中生根瘤菌 -
紫云英早期共生关系的研究 , 主要研究 内容有 : 验证
抑 在华癸 中生根瘤菌中的异源表达 ,探讨其表达条
件与可能存 在的问题 ; 构建基于 蜘 的广宿主 范围
启动子探针载体 ,通过鸟枪 克隆技术从华癸中生根
瘤菌基因组 D N A 中钓取脚 组成型表达与受紫云英
种子浸提物诱导 表达的启动子片段 ; 以 抑 为报告
基因原位活体监测华癸中生根瘤菌侵染紫云英的早
期结瘤过程 。
1 利用 野生型 wt g fP 作报告基 因的启 动 子
探针载体的构建
1
.
1 基于野生型 w t g fP 的广宿主范 围启 动子探 针
载体 p H N 1 27 的构建及验证
将含 抑 编码区的 D N A 片段连接到大肠杆菌表
达载体 p E T 一 1 I C 上获得 的重组质 粒为 p H N I巧 , 用
E e o R I 和 X b a l 双酶切质粒 p H N l l s , 回收 1 k b 片段 ,
再连接到质粒 p U2 9 25 上 , 得 到重组 质粒 p HNl l7 。
这样 ,脚 上游区保 留了 S D 序列 , 但没有启动子区 ,
载体上 多克隆位点 中的 x b a l 、 B a m H I 、 S m a l 、 K p n l 和
as d 可 以作 为克隆启动子 的酶切 位点 。 用 Bgl l 酶
切质粒 p H N l l 7 回收 1 k b 片段连接到 B a m H I 酶切并
去磷酸化的广宿主载体 p T1R 02 上 ,得到广宿主范围
启动子探针载体 p HN 12 7 。 将质粒 p BR 32 2 上 66 5 b p
具 et A八 et R 双向启动子活性 的 S au 3AI 片段连 接到
B am IH 酶切并去磷酸化的载体 p H M 27 上 ,将连接物
转化大肠杆菌 D Ha5 , 28 ℃培养 。 形成的菌落受长波
国家 自然科学基金资助项 目 .
本文于 2仪 》1 年 3 月 21 日收到
第 5 期 周俊初等 :绿色荧光蛋白基 因 (咖 ) 在华癸 中生根瘤菌与紫云英共生固氮作用研 究中的应用 3 03
紫外灯照射 时 , 可 以检测 到发绿 光的微菌落 , 表 明
p HN 127 具有启动子探针 的功能 。 其中一个质粒命
名 p HN 12 9 。
1
.
2 组成型表达的华癸 中生根瘤菌 7 6 53 R 中具启
动子活性片段的钓取
提取 华 癸 中 生 根 瘤 菌 7 6 53 R 的 总 DN A , 用
S au 3 A I部分酶切 后和 B am IH 酶 切并 去磷酸化 的载
体 p H N 127 混合连接 。 将连接物转化 DSH 。 , 28 ℃ 培
养 。 形成的菌落受 长波紫外光照射时 , 可 以检测到
个别菌落发绿光 , 将发光最强的菌落 ,提取质粒命名
为 p HN1 36 。 酶切验证结果表 明克隆到具有转录调
节活性 的 D N A 片段 。
1
.
3 共生条件下野生型 脚 在华癸中生根瘤菌 中
表达的原位监测
用电转化法将 p HN 13 6 , p HN 12 9 和 p HN 12 7 分别
导人华癸 中生根瘤菌 7 6 53 R , 采用微根盒栽 培法 。
将 7 6 53 (R p H Nl 3 6) 接种紫云英 , 在共生的不 同时期
用荧光显微镜原位检测早期结瘤阶段根瘤菌侵染植
物的过程 , 由于受植物本身较强的自发荧光的干扰 ,
未观察到预期的侵染过程 。 从紫云英所结的完整根
瘤中也检测不到明显的荧光信号 ,这 可能是 因为根
瘤 中的微 氧环境不利于 G F P 的成熟 所导致 的 。 但
从根瘤 中分离出的根瘤菌受长波紫外光 的激发 , 仍
可检测到绿色荧光 。 表 明 p H N 13 6 在共生条件下能
在华癸中生根瘤菌中稳定存在 。
此外还发 现启 动子探 针载 体 p HN1 27 上 的 蜘
受载体 pRT 102 上的启动子转录通读 可产生荧光本
底 ,只能筛选到转录活性较强的启动子片段 , 而无法
筛选到弱启动子 ,这给钓取诱导型启动子带来 困难 。
而新一代 GF P 突变体 的出现 ,使 G F P 荧光信号 的敏
感性和蛋 白的可溶性都进一步 改善 。 从 而拓 宽 了
G F P 的应用范围 ,并提高了敏感性 。
2 基于 g fP m u 3t 的广宿主稳定启动 子探针
载体 p H N 1006 的构建与应用
oC ~ ck 等人利用核昔酸定点诱变法对编码 发光基 团的 eS -r 肠卜 lG y 与侧翼 的 5 5一7 位 氨 基酸 的
D N A 序列进行替代诱变 , 在大肠杆菌中构建 了受严
谨可诱导型启动子 R ac 控制的 脚 突变基 因库困 。
用荧光激活细胞分选术 ( FA C)S 筛选出 比 wt G F P 发
光强 20 一35 倍 E G FP m ut l 一 3 三类突变蛋 白 。 其中适合
于在细菌 中表达的 E G F Pm u t 3 ( S 65 C , S 72 A )的激发波
长为 5 01 n m ,发射波长为 5 1 I n m , 荧光强度 比 wt GF P
提高了 21 倍 ,在单个 细胞 中可产生强荧光 , 是研究
细菌基 因表达的最佳选择 。
2
.
1 广宿主稳定启动子探针载体 p H N 1 0 06 的构建
本研究首先构建了大肠杆菌启动子探针载体
P HN l 0 0 0 5
。
Bgl l l 酶解 p H N 10 o s 回收含启动子探针
单元 的 1 . 7 kb 片段连接到 aB m IH 酶解并去磷酸化
的质粒 p T 1R 02 上 , 即得到基于 抑 mu 3t 的广宿主范
围启动子探 针载体 p H M o 6 。 该 载体具有如 下特
点 :
( l) 其 5 ’ 端的 Bam IH 位点可用来克隆具有启动
子活性的 D N A 片段 和用于定量分析插入的启 动子
强度 ;
( 2) 该载体上 蜘mu 3t 结构基 因的 3 ’ 端含 rR N A
1T 代 终止子 , 可允许克隆强启动子 ;
( 3) 在 B a m IH 上游 同样插人 rR N A IT 犯 终止子
以 防止载体 p u 1C 9 上启动子的转录通读 ;
( 4 )脚nur 3t 结构基 因上游还插入一段 内含子序
列 ,可使正反六种读码框 的翻译均被终止 , 以保证
脚mu 3t 按正确的读码框翻译 。 aB m IH 两侧的 s m al 、
助 nI 和 S ac l 等位点可用于鉴定克隆的启动子片段 。
2
.
2 华癸 中生根瘤菌 7 6 53 R 基因组 中调控活性片
段的克隆
提取 华 癸 中生 根 瘤 菌 76 53 R 的 总 DNA , 经
S au 3 A I 部分 酶解 后 , 与 aB m IH 酶解并 去磷 酸化 的
p HN l o 6 酶连 ,将连接物电转化 7 6 53 R 感受态细胞 ,
在 YT + A p 平板上筛选转化子 。 用长波紫外激发可
观察 到 部 分转 化 子 发 绿 色 荧 光 , 而 对 照 7 653 R
( p HM o 6 )则检测不到绿色荧光 。 表 明已克隆到含
不同转录水平的组成型启动子 。 挑取其中最亮 的转
化子 ,抽提质粒 ,命名为 p HN Z一3 。 将转化平板 中不
发光或发光较弱的转化子同时点种 YT 十 A p 十 紫云
英种子浸提物和 YT + A p 平板 ,从上万个融合子中 ,
筛选到一个添加种子浸提物前无荧光 , 但添加种子
浸提物后 有显 著荧光 的重 组子 , 抽提 质粒命名 为
pNI 犯 ,重新 电转化 7 653 R 并验证菌落发光表型后 ,
命名为 NI 32 。
本研究构建了严格意义上的 脚 m ut 3 为报告基
因的广宿 主范 围启动子探针载体 p H M 006 , 经过大
量筛选获得 了一批具有不 同强度 GF P 荧光表型的
重组子 ,表明已克隆到具有调控序列的 DN A 片段 ,
不同程度 的 GFP 荧光信号表 明其间存在转录水平
的差异 。 并在进一步的筛选中获得了一个受紫云英
种子浸提物诱导表达并产生可视荧光信号 的重组
子 。 这为进一步大量钓取共生 固氮基 因提供了新 的
思路 ,也为推进紫云英根瘤菌分子遗传学研究积 累
任/。,嫩冷称(汁一6犷à若
3 04 中 国 科 学 基 金 2你 ” 年
J’ 材料 。
3华癸中生根瘤菌标记菌株 - 23与紫云英
共生早期结瘤阶段的原位监测
用 咖 组成型表达的华癸中生根瘤菌标记菌株
2
一
3为代表原位监测其与紫云英共生早期结瘤阶段
中细胞发育与形态变化的可行性 。
3
.
1标记质粒的稳定性和 G P F表达对宿主细胞生
理代谢与共生性能的影响
分别任选在连续转接 8次过程中的平板上的单
菌落 , 用 长波紫外激发 , 比较不 同转接次数后菌落的
荧光信 号 ,未发 现有 明显的区别 。 连 同用菌落记数
法得到的菌落发光率的测定结果表明标记质粒在宿
主根瘤菌营养生长条件下具有很高的稳定性 。 用 2 -
3 接种微根盒 内培养 的紫 云英幼苗进行植物结瘤
实验 , 并 以 7 653 R 作为对照 , 选取早期根瘤 和现 瘤
ZO d 左右的成熟根瘤用荧光显微镜均可检测到很强
的荧光信号 ,从 2一3 所结根瘤中分离的根瘤菌长出
的单菌落在 U V 激发后可检测到所有 菌落均发绿色
荧光 。 表明标记质粒在共生条件下也能稳定存在 。
而利用透射电镜和扫描电镜对根瘤的超微结构进行
分析 ,结果表 明 7 653 R 和 2一3 所结根瘤 、 含菌细胞
和类菌体 的超微结构相似 。
对标记菌株 2一3 与 出发菌 7 6 53 R 的生长曲线
进行比较测定 ,没有发现 明显的差异 。 说明 咖mu 3t
的存在与表达对宿主菌没有明显影响 。
3
.
2 利用荧光显微镜原位监测 7 653 R 与紫云英共
生早期结瘤过程
用激光共焦扫描显微镜 ( CL SM )和微根盒栽培
法于接种 菌悬液 两天后 开始检测标记根瘤菌 2一3
在根毛区 的动态与 蜘 表达 。 已成功地观察并记录
到标记菌在紫云英幼苗根部 的定殖 、 感染及幼小根
瘤 与成熟根瘤不同层面中由咖表达的绿色荧光 。
虽然紫云英根系也有一定程度的 自发荧光 ,但
利用 L c s M 仍可较好地观察到 脚 在共生条件下的
稳定表达 。 从根瘤及根瘤不同层面成像中可以看到
只有含菌细胞才有荧光信号 ,说明荧光的确来 自于
咖 标记的根瘤菌 。
我们又选用了配置有 C C D 镜头和 F IS H 专用软
件的 z e is s 荧光显微镜 ,检测到单个根瘤菌 、 类菌体
和不同大小的根瘤产生的荧光信号 。 本研究在荧光
显微镜下看到的类菌体形态多样 , 常见的有梨形 、 Y
形 、 纺锤形和不规则形态等 ,与用电镜中观察到的类
菌体形态相一致 。
4 蓝色 荧 光蛋 白基因在华癸 中生根瘤菌 中
的表达
H ie m 等人采用倾 向错误 PC R 技术对 wt G F P 进
行随机诱变 ,在 4 7 5 n m 和 3 9 5n m 的激 发光源下筛选
到光谱改变 的突变株川 。 其 中 Y 6 H 突变株 4P 用
近紫外光激发可产生明亮 的蓝色荧光 , 并命名为蓝
荧光蛋白 ( B F )P ,相应 的基 因称为 b年。 本研究对 b印
基因进行了亚克 隆 , 并在华癸中生根瘤菌 中成功表
达 ,其意义在于以 B F P 和 G F P 组成双标记可用于原
位监测不同基因的表达调控 ,结合荧光共振能量转
移 ( FR E )T 技术 ,可检测细胞内不 同蛋 白质的亚细胞
定位等 。 为研究根瘤菌与宿主植物间的相互作用关
系提供可能 。
5 小 结
本研究初步建立起一套主要应用绿色荧光蛋白
基因 (脚 )研究根瘤菌与豆科植物共生关系早期结
瘤阶段分子遗传学的载体系统和研究方法 。 成功构
建了严谨的基于 咖mu 3t 的启动子探针载体 ,并钓取
到部分华癸 中生根瘤菌 7 653 R 组成型表达的启动子
和一个受紫云英种子浸提物诱导表 达的启动子片
段 。 既为深人开展研究华癸 中生根瘤菌的分子生物
学研究积累了实验材 料 , 也提出 了应用 痴 作为报
告基 因研究根瘤菌基因表达调控 的新方法 。
参 考 文 献
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· 资料 · 信息 ·
,’2 1世纪生物科学前沿论坛 ” 在京举行
为庆祝国家 自然科学基金委员会成立 巧 周年
及 C U S B E A实施 2 0周年 , 由北京大学 、 吴瑞协会 、 国
家 自然科学基金委员会 、科技部 、 教育部等单位联合
举办的 “ 21 世纪生物科学前沿论坛 ” 报告会于 2 001
年 6 月 21 一 25 日在北京大学交流中心会议厅举行 ,
北京大学副校长陈章 良教授主持 了开幕式 , 北京大
学校长许智宏院士 、 国家 自然科学基金委员会副主
任朱作言院士 、科技部前部长朱丽兰 、教育部副部长
韦任 、 诺贝尔奖获得者 Jo s e ph olG d s t e i n 博士 、 M i e h a e l
Bor w n 博 士 、 hP il i p hs arP 博 士 、 康 奈尔大 学吴 瑞博
士 、 吴瑞协会董事会 的有 关成员等 出席 了开幕式 。
许智宏校 长 、 朱作言 副主任 、 Jo s e ph co ld s t e i n 博士 、
M i e h a e l B owr
n 博士 、 外i l li p s h a甲 博士等在开幕式上
作了重要讲话 ,近百名海外青年科学家和数百名 国
内学者参加了会议 。
诺贝尔奖获得者 Jo s e p h oG ld s te i n 博士 、 M i e h a e l
Bor wn 博士 、 hP il i p Sha 甲 博士在大会上作 了主题发
言 , 近百名青年学者作了专题报告 , 内容涉及信号传
导 、 转录及转录后修饰 、 细胞粘附 、 细胞迁移和细胞
骨架 、神经细胞 的发育和功能 、 神经细胞的死亡与疾
病 、 凋亡 、 干细胞生物学 、 细胞命运调控 、 植物生 物
学 、免疫学和基因组学等生命科学的前沿领域 ,与会
的国内代表普遍反映这些报告在一定程度上反映了
这些领域的最高水平 。
会议期间 , 国家 自然科学基金委员会生命科学
部副主任杜生明向海外学者介绍了国家 自然科学基
金委员会的情况 ,并着重介绍了生命科学部 “ 十五 ”
优先资助发展领域 的情况 , 吴瑞协会董事会的成员
及部分青年学者就此展开了讨论 , 并提出了十分中
肯和宝贵的意见 。 这些意见对生命科学部确定 “ 十
五 ” 优先资助领域具有重要的参考价值 。 另外 , 国家
自然科学基金委员会生命科学部 的有关工作人员还
介绍了生命科学部近年支持 国际合 作与交流 的情
况 ,并就海外学者感兴趣 的问题进行 了讨论 。 双方
经过讨论 ,达成了今后进一步开展合作的协议 : 双方
初步拟定今后每 2 年共同举办一次生命科学某一领
域的专题学术研讨会 , 以促进相关领域 的海 内外专
家及时交流 ;国家 自然科学基金委员会生命科学部
将继续邀请部分海外优秀学者参加国家 自然科学基
金的年度评审专家会 , 并将逐步邀请优秀的海外学
者参加国家 自然科学基金重点项 目、 杰 出青年基金
的函评工作 。
(生命科学部 吕群燕 供稿 )