全 文 ：第 8 卷 第 11 期 环 境 工 程 学 报 Vol． 8，No． 11
2 0 1 4 年 1 1 月 Chinese Journal of Environmental Engineering Nov . 2 0 1 4
鼠李糖脂与菌剂对原油污染土壤的联合修复
王冬梅1 陈丽华1* 雒晓芳1 赵连彪2
(1．西北民族大学实验中心，兰州 730030;2． 西北民族大学化工学院，兰州 730030)
摘 要 为研究 ＲL强化 MI修复原油污染土壤的效果，通过盆栽实验，测定了修复过程中微生物、脱氢酶、原油降解率
和正构烷烃等变化。结果表明，提取 ＲL具有良好表面和乳化活性。修复过程中微生物数目、脱氢酶和石油降解率具有相
关性。ＲL + MI联合修复对原油的降解效果最显著，第 14、21 和 28 天的降解率分别达 67. 6%、78. 6%和 81. 3%，较 MI 和
ＲL处理分别提高了 22% ～24%和 32% ～38%;细菌、放线菌和霉菌最高生物量分别比 CK提高约 20、5. 8 和 4. 7 倍;GC-MS
示修复 14 d后∑C21 － /∑C22 +(1． 334)和 Pr /Ph(1. 152)均大于 CK，说明降解早期具有高碳正构烷烃、奇数烷烃的降解优
势以及对类异戊二烯烷烃的降解。
关键词 鼠李糖脂(ＲL) 微生物菌剂 原油污染 生物修复
中图分类号 X172;X53 文献标识码 A 文章编号 1673-9108(2014)11-5003-07
Combined remediation effects of rhamnolipid-microbial inoculant
on petroleum contaminated soils
Wang Dongmei1 Chen Lihua1 Luo Xiaofang1 Zhao Lianbiao2
(1． Experimental Center，Northwest University of Nationalities，Lanzhou 730030 China ;
2． Institute of Chemical Technology，Northwest University of Nationalities，Lanzhou 730030 China)
Abstract To investigate remediation effects of application ＲL and /or microbial inoculant (MI)on petrole-
um contaminated soils，a pot experiment was carried out． The changes of microorganism，dehydrogenase，petro-
leum degradation rate and n-alkanes were detected during remediation process． The results showed that the ex-
tracted ＲL has better surface activity and emulsion effect． There was a correlation among microorganism and de-
hydrogenase and petroleum degradation． MI + ＲL treatment significantly promoted petroleum degradation． After
14，21 and 28 days of incubation，petroleum degradation rates of ＲI + MI reached 67． 6%，78. 6% and 81. 3%，
respectively，increased by 22% ～ 24% and 32% ～ 38% than MI treatment and ＲL treatment． Compared with
CK，the maximum biomass of bacteria，actinomycetes and fungi increased 20，5． 8 and 4． 7 times，respectively．
GC-MS analysis showed that ∑C21 － /∑C22 +(1． 334)and Pr /Ph (1． 152)in 14 d were higher than CK． The
higher molecular weight n-alkanes，odd numbered alkanes and isoprenoid alkanes appeared a significant degrada-
tion during the early MI + ＲL remediation process．
Key words rhamnolipid(ＲL);microbial inoculant(MI);petroleum pollution;bioremediation
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41361070);中央高校基本
业务费专项资金项目(ZYZ 2011103，31920130022);甘肃
省自然科学基金项目(1308ＲJZA187);2013 年西北民族
大学创新团队项目
收稿日期:2014 － 04 － 22;修订日期:2014 － 06 － 25
作者简介:王冬梅(1969—)，女，硕士，副教授，主要从事环境微生物
学的研究工作。E-mail:467636407@ qq． com
* 通讯联系人，E-mail:clh@ xbmu． edu． cn
随着石油工业的迅猛发展，石油烃已成为土壤
及其含水层最主要的污染物，严重影响着生态环境
的稳定，污染土壤的生物修复成为当前环境领域研
究的热点［1-6］。韩慧龙等［3-6］构建的微生物混合菌
剂提高了石油烃的降解率，但疏水性物质石油烃很
难溶于水，其低分散程度直接降低了微生物与油珠
接触的表面积，生物利用性较低。添加表面活性剂
的增溶修复(surfactant enhanced remediation，SEＲ)
技术可增加疏水性污染物在水相中的传递速率，是
一种行之有效的生物降解强化手段，但该技术中化
学表面活性剂的应用又会导致新的二次污染问
题［7］，绿色环保的生物表面活性剂(biosurfactant，
BS)的应用和研究越来越受到研究者的青睐，在土
壤污染的生物修复及水体有机污染物的降解方面有
极大的利用潜力［8-13］。迄今，对由铜绿假单胞菌
环 境 工 程 学 报 第 8 卷
(Pseudomonas aeruginosa)产生的鼠李糖脂(Ｒham-
nolipid，ＲL)的研究最多，大多的研究重点集中在
ＲL的理化特性、降解增效机制、ＲL对单个菌株降解
效果的影响等方面［8-15］，关于它对复合微生物菌剂
降解石油烃的影响方面的报道不多。微生物脱氢酶
(DHA)是微生物降解有机污染物过程中的必需
酶［4，6］，关于 BS 对土壤中脱氢酶活性影响的报道
很少。
ＲL对水相中微生物菌剂降解原油的影响已有
研究［13］，本实验进一步以产 ＲL 的铜绿假单胞 A6
菌和微生物混合菌剂为对象，制备并测定了 ＲL 的
表面和乳化活性，通过盆栽实验，测定修复过程中微
生物、脱氢酶、原油降解率和正构烷烃的演化等变
化，重点研究了 ＲL强化 MI修复原油污染土壤的效
果，以期为土壤中原油污染的修复提供一定的途径。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1． 1． 1 供试 ＲL粗品
ＲL粗品:将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugi-
nosa)A6 经发酵培养后提取 ＲL粗品［12］。每升发酵
液中 ＲL粗品含量约 2. 0 g。经苯酚-硫酸比色法和
线性回归可计算出 1 g ＲL 粗品中含纯 ＲL 约 0. 19
g。盆栽实验中每盆添加 ＲL粗品 7. 5 g(即纯 ＲL700
mg·kg土样)。
1． 1． 2 供试微生物菌剂(MI)
MI由活化至对数生长期的原油降解菌株 A5、
D4、F1 和 F2 按优化比例(5∶ 2 ∶ 2 ∶ 1)混合而成。菌
株均从甘肃陇东长庆油田长期受石油污染土壤中筛
出，D4 菌株为蒙氏假单胞菌(P． monteilii)，A5 菌株
为鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)，F1 菌株为黄
色类诺卡氏菌(Nocardioides luteus)，F2 菌株为暗黑
微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)。
1． 1． 3 供试土壤及原油
土样:多点采集未受石油污染表层土壤(10 ～
20 cm)。从土壤理化性质来看，干物质占 98. 76%，
有机质 0. 928%，pH 7. 78，可溶性盐含量 0. 165 mS /
cm;土壤较为贫瘠，有效磷 12. 77 mg /kg、速效钾
65. 27 mg /kg、总氮 0. 180 g /kg。将土壤自然风干后
用尿素和磷酸二氢铵调节土壤 N∶ P = 8∶ 3。
原油样:西 27 * 原油取自甘肃陇东西峰某油
田。油样各族的质量含量分别为饱和烃 64. 34%、
芳烃 15. 58%、非烃 17. 67%和沥青质 2. 45%。
1． 1． 4 药品与试剂
牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 1 号培养基和察氏
培养基。
试剂:硫酸铵、盐酸、正十六烷、正己烷、无水硫
酸钠、氯化三苯基四氮唑(TTC)、三羟甲基氨基甲烷
(Tris)等均为分析纯。
1． 2 实验设计与实施
盆栽实验分 4 个处理:(1)对照组(CK ):不添
加 MI和 ＲL;(2)MI 处理:只添加 MI 50 mL;(3)
ＲL处理:只添加 ＲL粗品 7. 5 g;(4)MI + ＲL 处理:
同时添加 ＲL粗品 7. 5 g 和 MI 50 mL。每个处理设
置 3 次重复。实验采用底部有孔的盆钵，在实验室
室温中进行。
每盆装土样 2 kg，用喷壶均匀喷洒原油 20 g(原
油浓度为 1%)，用铁铲将原油和土样搅拌均匀。按
不同处理分别向盆中添加 MI 和∕或 ＲL。MI 用灭
菌移液管添加，ＲL 粗品研细后称量加入，用铁铲搅
拌均匀后在室温下培养。每 2 天加无菌水 1 次，保
持含水率在 40%左右。于培养第 7、14、21 和 28 天
分别采用五点法取样，经 100 目样品筛过筛后，测定
土壤中的石油降解率、脱氢酶活性及微生物数量。
CK和 MI + ＲL 处理的部分样品进行正构烷烃的
GC-MS检测。
1． 3 测定方法
1． 3． 1 ＲL的表面活性及乳化性能
(1)排油圈实验［16，17］。取盛有 20 mL去离子水
的玻璃平皿，加入 200 μL 经苏丹红染色的液体石
蜡，使其在水面形成油膜，油膜中央分别滴加发酵培
养基和 100 mg /L 的 ＲL 溶液各 20 μL，测量排油圈
直径。
(2)乳化性能测定［9-11］
试管中依次加入液体石蜡∕原油和 100 mg /L
的 ＲL 溶液各 5 mL，80 W 超声波乳化处理 30 s，
25℃下静置观察 7 d。测定不同时间(t)各管中油、
水及乳化相的体积，以乳化相体积占总体积的百分
比(%)来表示测定时间 ＲL 的乳化指数(Et)。E40
表示 40 h时 ＲL的乳化指数。
1． 3． 2 土壤中石油烃的降解率及正构烷烃的 GC-
MS检测［18］
采用重量法测定总石油烃(TPH)降解率。称取
5. 0 g 过筛土壤于 40 mL 的玻璃离心管中，加入 25
mL石油醚，超声萃取 l h，4 000 r /min 离心 10 min，
将萃取液转移至已烘干至恒重的磨口圆底烧瓶中，
4005
第 11 期 王冬梅等:鼠李糖脂与菌剂对原油污染土壤的联合修复
每份土样萃取 3 次。萃取液用旋转蒸发仪蒸发至近
干，放入通风橱中直至石油醚挥发干净，称出磨口圆
底烧瓶的质量，按重量法计算土壤中 TPH 含量。原
油降解率 =(A － B)/A × 100%。式中:A 为对照组
残余 TPH量;B为实验组的残余 TPH量。
取 CK和 MI + ＲL 处理第 14、28 天的总石油烃
30 mg，加入 30 mL 正己烷，静置 12 h 后，经塞有脱
脂棉的短颈漏斗过滤，正己烷洗涤数次，将收集滤液
在旋转蒸发仪上浓缩至 5 mL，采用 1∶ 1 的硅胶∕氧
化铝层析柱、正己烷淋洗分离得到饱和烃，进行 GC-
MS检测。分析条件为:气化温度 260 ℃;载气 He;
柱温 200 ℃;柱 SE30(50 m);质谱条件为:电子能量
70 eV，扫描范围 40 ～ 450 amu。
1． 3． 3 脱氢酶活性的测定
土壤样品中脱氢酶活性的测定采用 TTC 分光
光度法［19］。用 GENESYS 10S 分光光度计在波长
485 nm处测吸光度值，依标准曲线计算出样品的脱
氢酶活性。
1． 3． 4 土壤中微生物数量测定
采用平板稀释涂布法测定［20］。细菌、放线菌和
霉菌分别采用牛肉膏蛋白胨、改良高氏 1 号和察氏
培养基培养。在两级稀释度中，选细菌和放线菌的
菌落数为 30 ～ 200 个、真菌菌落数为 20 ～ 40 个的培
养皿各 5 个，取其平均值计算出每组的菌落数。
土壤微生物数量(cfu /g)=MD/W
式中:M 为菌落平均数;D 为稀释倍数;W 为土
壤烘干质量(g)。
2 结果与分析
2． 1 ＲL的表面活性及乳化性能
由图 1 和图 2 可知，ＲL溶液对液体石蜡的乳化
指数 E24 为 25%，E40 达 60%，对原油的乳化指数
E40 接近 100%，排油圈直径达 5． 5cm。李琦［9］、强
婧［14］报道的 P． Aeruginosa S6 和 BD-5 菌株对原油的
乳化能力均达 95%，排油圈直径与本菌相近。C． J．
B． de Lima 等［21，22］报道的 P． Aeruginosa PACL 和
MＲ01 菌对食用豆油和十六烷的 E24 分别达 100%
和 70%。本研究 P． Aeruginosa A6 所产 ＲL 具有较
好的乳化活性和表面活性，在原油的生物修复中有
应用潜能。
2． 2 土壤中原油的降解率变化
不同处理土壤原油降解率如图 3。CK 的降解
率基本在 16% ～25%之间，说明土壤中的土著菌具
图 1 排油圈
Fig． 1 Ｒesult of oil spreading method
图 2 ＲL的乳化实验结果
(1、2 分别为 24 h、40 h对液体石蜡;
3、4 分别为 24 h、40 h对原油)
Fig． 2 Ｒesult of emulsion by ＲL solution
有一定的自我修复能力。ＲL 处理的降解率较 CK
提高了 9% ～10%，考虑是所添加 ＲL良好的表面和
乳化活性改善了石油烃的溶解性和分散程度，促进
其对土壤的吸附，增加了土壤中土著微生物与油珠
接触的表面积，增强了对石油的降解效果。处理后
土壤中原油的降解率最高，降解第 14、21 和 28 天的
降解率分别达 67. 6%、78. 6%和 81. 3%，较菌剂组
和 ＲL组分别提高了 22% ～24%和 32% ～38%。以
降解率为因变量，用 SPSS软件对主体间效应的检验
分析显示，ＲL + MI 处理与其他处理差异性极显著
(P = 0. 000 ＜ 0. 01)，ＲL处理与 CK差异性显著。
2． 3 土壤脱氢酶活性的变化
脱氢酶为微生物降解有机污染物和获得能量的
必需酶，它可使石油烃的氢原子活化并传递给特定
的受氢体，实现烃的氧化和转化。脱氢酶活性被作
为评价微生物降解污染物能力的指标［4，6，23］。由图
4 可知，各处理下脱氢酶活性随培养时间的延长而
逐渐升高。同一时间内，CK 和 ＲL 处理下的酶活性
基本一致，ＲL + MI 和 MI 处理的酶活性接近，但较
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环 境 工 程 学 报 第 8 卷
图 3 不同处理下原油的降解率
Fig． 3 Petroleum degradation rate in different treatments
图 4 不同处理脱氢酶活性
Fig． 4 Dehydrogenase activity in different treatments
CK和 ＲL处理高约 2 ～ 2． 5 倍。这表明 ＲL 对酶活
性的影响不大，添加 MI 主要影响土壤的脱氢酶
活性。
2． 4 土壤中微生物数量的变化
由图 5 可知，各处理土壤中细菌数于降解第 7
天达高峰，第 7 ～ 14 天基本保持在高峰水平，ＲL、
MI和 ＲL + MI 处理的生物量分别比 CK 提高约
3. 7、15. 6 和 20 倍，最高生物量达 3. 2 × 109cfu /g，后
期细菌量呈平缓下降趋势。土壤中霉菌和放线菌的
高峰期出现于降解的第 14 ～ 21 天，ＲL、MI 和 ＲL +
MI组的霉菌生物量分别比 CK组提高约 1. 4、2. 0 和
4. 7 倍，放线菌数则提高约 1. 7、2. 3 和 5. 8 倍，它们
的最高生物量分别达 1. 32 × 108 cfu /g 和 3. 28 × 108
cfu /g。ＲL可作为碳源和能源被微生物所利用，在
一定程度上刺激土壤中土著微生物的生长。菌剂的
添加促进了土壤中原油的降解，降解产物及菌剂的
代谢产物也可成为新的碳源和能源，促进各类微生
物的生长和繁殖，这更有利于污染物的降解。降解
后期随着土壤中各种碳源和能源的逐渐消耗，各类
微生物的生长和繁殖能力趋于衰减。降解过程中各
类微生物生物量高峰出现时间及高峰持续时间的差
异与各自生长周期的不同也有关。
图 5 不同处理下微生物数量变化
Fig． 5 Biomass of microbial in different treatments
2． 5 降解期间正构烷烃组分的变化
微生物对土壤中石油污染物的降解受其化学结
构和性质的制约，一般正构烷烃、低分子量芳烃等组
分被微生物优先降解，支链烷和高分子量芳烃次之，
后期残留的则是极难被降解的胶质和沥青等［4-6］。
陈丽华等的研究表明［4］:供试西 27* 原油演化程度
和成熟度都高，其组分主要包括饱和烃(正构烷烃、
霍烷、甾烷系列)，非烃和多环芳烃在成烃环境中多
数演化为类异戊二烯烷烃等烃类物质，含量很少。
GC-MS分析了 ＲL + MI处理后第 14、28 天样品中正
构烷烃的降解演化规律，结果如表 1 和图 6 所示。
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表 1 降解后正构烷烃组分分析
Table 1 Analysis of N-alkane component after degradation
烷烃主峰
14 d 28 d
0EP
14 d 28 d
∑C21 － /∑C22 +
14 d 28 d
Pr /Ph
14 d 28 d
CK nC26 nC25 1 1 1 1 1 1
ＲL + MI nC25 nC23 0． 974 1． 067 1． 334 1． 255 1． 152 0． 99
图 6 ＲL + MI处理后正构烷烃离子流图
Fig． 6 TIC of remaining N-alkanes in ＲL + MI treatment
原油正构烷烃的碳数分布均为 C14-C39。参数
∑C21 － /∑C22 +是低碳数烷烃总和与高碳数烷烃
总和的比值，反映烷烃遭受微生物作用时高碳数烷
烃向低碳数转化的趋势。参数 OEP 值为奇数碳烷
烃与偶数碳烷烃含量的比值，该值越小说明降解奇
数碳烷烃的能力越强，反之降解偶数碳烷烃能力越
强。MI + ＲL处理后第 14 天和 28 天的∑C21 － /∑
C22 +均大于 CK，主峰碳前移较明显，说明 MI + ＲL
处理对高碳数正构烷烃有较强烈的去甲基作用，对
高碳数正构烷烃的降解速率大于低碳数的，这种高
碳降解优势于处理早期更为明显。处理后第 14 天
时 OEP值略低于 CK，28 d 时则大于 CK，说明对奇
数烷烃的降解优势主要处于降解早期。
姥植比(Pr /Ph)为类异戊二烯烷烃中姥鲛烷与
植烷的比值，一般认为，原油遭受微生物不太强烈的
降解时类异戊二烯烷烃不受降解的影响。经 MI +
ＲL处理第 14 d 的 Pr /Ph(1． 152)明显大于 CK，第
28 d则与 CK很接近，表明在降解早期原油中的类
异戊二烯烷烃发生了明显的降解，使支链烃中部分
植烷 (C20H42)脱 去 甲 基 转 化 成 为 姥 鲛 烷
(C19H40)。
2． 6 数据分析
各处理下土壤微生物数量与脱氢酶活性、原油
降解率之间的相关性经 SPSS软件进行了分析，结果
如表 2 所示。
表 2 微生物数量与脱氢酶活性和降油率间的相关性分析
Table 2 Correlation analysis between microorganism and
dehydrogenase activity or petroleum degradation rate
处 理 脱氢酶活性 降解率
CK 1． 000＊＊ 0． 990＊＊
ＲL 0． 630* 0． 669＊＊
MI 0． 548* 0． 723＊＊
ＲL + MI 0． 784＊＊ 0． 850＊＊
注:* 在 0． 05 水平(双侧)显著相关。＊＊ 在 0． 01 水平上显著
相关。
不同处理下土壤中微生物数量与微生物脱氢酶
活性和原油降解率均显著相关。ＲL + MI 处理下降
解第 7 ～ 14 天细菌量处于高峰，第 14 ～ 21 天霉菌和
放线菌生物量达高峰期，期间脱氢酶活性升高幅度
较明显。土壤中微生物的大量适应性生长与繁殖、
以及随之出现的微生物脱氢酶高活性状态，可能就
是降解早期(第 7 ～ 21 天)高碳烷烃、奇数烷烃降解
优势以及植烷向姥鲛烷转化的原因所在。
国内外研究表明，BS强化作用主要是通过其乳
化作用、胶束增溶作用和增加微生物细胞表面的疏
水性等机制来实现的［8-13，23，24］。BS 良好的表面活
性、乳化作用以及胶束对有机物的分配作用等，可将
石油烃分散成小液滴，增大其在水相的溶解度，增加
烃类与降解菌细胞之间的接触面积;BS 对菌细胞表
面进行修饰，增大细胞表面疏水性，改变细胞和烃类
化合物之间的亲和力，利于烃类的吸收和转化，从而
有效提高了其生物可利用性，强化了微生物的降解
效果。添加 BS是提高难溶有机污染物生物可利用
性的有效方法。刘魏魏等［23，25］的研究指出，土壤中
多环芳烃(PAHs)的降解率与土壤中脱氢酶活性显
著正相关，并应用 HPLC 证实 ＲL 可强化降解菌株
对 PAHs修复的效果。Carlos A． Ｒocha 等［25］的研究
认为，降解体系中 ＲL 的存在可改变异构烷烃的执
7005
环 境 工 程 学 报 第 8 卷
拗型趋向，其乳化作用可弥补支链烷烃甲基化引起
的溶解性的降低，从而提高底物的生物可利用性，增
加微生物对底物的降解效果。本研究证实添加 ＲL
可强化菌剂对原油污染土壤的修复作用，土壤中脱
氢酶活性、微生物数量和原油的降解密切相关。
3 结 论
P． Aeruginosa A6 所产 ＲL具有良好的表面和乳
化活性。
ＲL + MI处理下土壤中原油的降解效果最好，
微生物数量、脱氢酶活性和原油的降解密切相关。
降解第 14、21 和 28 天的降解率分别达 67. 6%、
78. 6%和 81. 3%，较 MI 和 ＲL 处理分别提高了
22% ～24%和 32% ～38%。
GC-MS分析显示在 MI + ＲL降解早期石油遭受
到了微生物强烈的降解，存在明显的高碳烷烃、奇数
烷烃降解优势和类异戊二烯烷烃的降解。
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