全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2012 年
第 51卷第 10 期
2012年 5 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.10
May．，2012
收稿日期：2011－10－12
基金项目：国家自然科学基金项目（31101202）；长江大学博士启动基金项目
作者简介：刘志雄（1977－），男，湖北汉川人，讲师，博士，主要从事园林植物生物技术方面的研究，（电话）0716－8066260（电子信箱）
zxliu1977＠yahoo．com．cn。
重瓣榆叶梅（Prunus triloba var． Plena）属蔷薇
科（Rosaceae）李属落叶灌木，有很高的观赏价植，是
中国北方地区园林绿化和景观建造中常见的观赏
花木。 由于重瓣榆叶梅雌蕊出现不同程度的退化，
致使其传粉结实出现障碍，自然结实率低，种子实
生繁殖效率低，故生产上主要用分株和嫁接方式进
行繁殖。 在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AGL1 ／
SHP1 和 AGL5 ／ SHP2 是控制雌蕊和胚珠正常发育、
促进成熟果实开裂的关键基因，主要在拟南芥发育
中的心皮、胚珠和角果中表达［1－4］。
目前有关 SHP 同源基因调控模式植物拟南芥、
金鱼草（Antirrhinum majus）及其他重要经济作物雌
蕊和果实发育的分子机制的研究已比较广泛，但关
于调控木本观赏花木榆叶梅及其变异品种花和果
实发育方面的研究未见报道。 深入研究参与控制重
瓣榆叶梅花和果实发育特征的 SHP 的同源基因编
码的蛋白质的结构和功能，不仅有助于解析重瓣榆
叶梅雌蕊退化、胚珠败育和自然结实率低的分子机
制，同时也可为重瓣榆叶梅的花型改良和品种创新
提供新的理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
2011 年 4 月初在北京林业大学校园采集重瓣
榆叶梅蕾期新鲜的雌雄蕊。
1．2 方法
1．2．1 RNA分离与 cDNA合成的方法 用 EASYspin
植物 RNA 快速提取试剂盒 （北京艾德莱生物科技
重瓣榆叶梅 PrtSHP的基因克隆与序列结构分析
刘志雄，于先泥
（长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025）
摘要：采用同源克隆法结合 3′－RACE 技术从重瓣榆叶梅（Prunus triloba var． Plena）中分离得到了 1 个雌
蕊和果实发育调控基因 SHP 的同源基因 PrtSHP 的全长 cDNA（GenBank 登录号：JF911701）。 其 cDNA 全
长 970 bp，包括 1 个编码 244 个氨基酸的 735 bp 的完整开放阅读框。蛋白质序列比对和分子系统发生分
析表明，PrtSHP 是拟南芥的 SHP 的同源基因， 其编码的蛋白质的 C 末端结构域具有 2 个高度保守的模
体（AG I 模体和 AG II 模体），属 C 类转录因子中 PLE 进化系。
关键词：重瓣榆叶梅（Prunus triloba var． Plena）；雌蕊和果实发育；基因克隆；序列分析
中图分类号：Q949．751．8；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）10－2124-04
Gene Clone and Sequence Analysis of PrtSHP from Prunus triloba var. Plena
LIU Zhi－xiong，YU Xian－ni
（College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： The total cDNA sequence of PrtSHP（GenBank accession code， JF911701） of Prunus triloba var. Plena， the homol-
ogous gene of pistil and fruit developmentally regulated gene SHP， was obtained by homology cloning combined with 3′－
RACE． The full length of PrtSHP cDNA was 970 bp， including an open reading frame （ORF） of 735 bp which code a
polypeptide of 244 amino acids． Sequence comparison and phylogenetic analysis revealed that PrtSHP was highly homologous
to protein SHP in Arabidopsis and belonged to the PLE clade of class C． The C－terminal domain of the predicted amino acid
sequence of PrtSHP harbored two highly conserved motifs （AG Ⅰand AG Ⅱ）．
Key words： Prunus triloba var． Plena； pistil and fruit development； gene clone； sequence analysis
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.10.053
第 10 期
有限公司）提取重瓣榆叶梅雌雄蕊的总 RNA，并用
M－MLV 逆转录酶 （TaKaRa 公司 ） 合成第一链
cDNA，反应体系和操作均按说明书进行。
1．2．2 重瓣榆叶梅 PrtSHP 的克隆 根据 NCBI 上
现有的其他蔷薇科植物 SHP 的同源基因的 5′端非
翻译区（5′－Untranslated region，5′－UTR）的保守序
列设计 3′－RACE 引物 ， 使用 3′－full RACE Core
Set Ver．2．0 试剂盒（TaKaRa 公司）进行全长 PrtSHP
的克隆， 操作按说明书进行。 PCR 反应体系为 25
μL， 包括雌雄蕊的 cDNA模板 2 μL，1×cDNA Dilu-
tion Buffer II 3 μL，10 mmol ／ L dNTPs 1 μL，10 ×Ex
Taq Buffer 2．5 μL，10 μmol ／ L PrtSHP 基因特异引物
GSP 1 μL，10 μmol ／ L 3′ Race Outer Primer 1 μL，5U ／
μL Ex Taq DNA聚合酶 0．3 μL，ddH2O 14．2 μL。 PCR
扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性45 s，58
℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃延伸
10 min。在 1％琼脂糖凝胶上电泳扩增产物后回收目
标片段，然后克隆到 pMD18－T 载体（TaKaRa 公司）
上，鉴定后送样测序，从而克隆出全长 PrtSHP。 所有
引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，DNA
测序由华大基因完成。
1．2．3 蛋白质序列比对与系统发生分析 将重瓣
榆 叶 梅 PrtSHP 的 开 放 阅 读 框 （Open Reading
Frame，ORF） 编码的氨基酸序列在 EBI 数据库中进
行 BLAST分析。 用 Clustal W程序［5］将 PrtSHP的氨
基酸序列同 NCBI 上 SHP 的同源蛋白质序列 Prse-
SHP（日本晚樱，Prunus lannesiana）、PperSHP （桃，
Prunus persica）、MdMADS14（苹果，Malus x domes-
tica）、MASAKO D1（玫瑰，Rosa rugosa）、TrSHP（太行
花，Taihangia rupestris）、GhMADS7（陆地棉，Gossyp-
ium hirsutum）、TAGL1（番茄，Solanum lycopersicum）、
FBP6（矮牵牛 ，Petunia x hybrida）、TFPLE2A （蓝猪
耳 ，Torenia fournieri）、AGL1 ／ SHP1 （拟南芥 ，Ara-
bidopsis thaliana）、AGL5 ／ SHP2（拟南芥，Arabidopsis
thaliana）、PLE（金鱼草，Antirrhinum majus）进行多重
比较。 在对上述来自不同类群植物的 13 个 SHP 的
同源蛋白质进行系统发生分析时，同时选择拟南芥
的 AP1、 AP3、 PI、 AG、 AGL11 ／ STK、 AGL2 ／ SEP1、
AGL4 ／ SEP2、AGL9 ／ SEP3 和 AGL3 ／ SEP4， 以及梅
（Prunus mume）的 PmAG 共 10 个 A、B、C、D、E 类转
录因子作外类群，采用 MEGA4软件［6］通过连接近邻
算法（Neighbour joining，NJ）进行分子系统发生分析。
2 结果与分析
2．1 重瓣榆叶梅 PrtSHP全长 cDNA的克隆
根据 NCBI 上现有的其他蔷薇科植物的 SHP
的同源基因的 5′-UTR的保守序列设计的 3′－RACE
引物为 5′－CATCTTTGCAACAATGGAGTTC－3′ ，直
接用 3′－RACE 技术克隆得到了包括起始密码子和
Ploy A 的大小为 970 bp 的 PrtSHP 全长 cDNA 序
列。结果表明，PrtSHP全长 cDNA序列包括 12 bp的
5′-UTR、223 bp 的 3′－UTR 和 735bp 的完整 ORF，
其编码 244个氨基酸和 1个终止密码子。 蛋白质序
列 BLAST 比对与序列分析表明 PrtSHP 与 MADS－
box 基因家族中 PLE 进化系基因的同源性最高，属
调 控 花 发 育 的 C 类 基 因 ，GenBank 登 录 号 为
JF911701。
2．2 重瓣榆叶梅 PrtSHP的序列结构特点
从蛋白质序列结构相似性比对发现 （图 1），重
瓣榆叶梅 PrtSHP 拥有 1 个高度保守的 MADS 结构
域（MADS domain）、1 个次级保守的 K 结构域、1 个
保守性相对较低的 I 结构域（I region）和 1 个变异
较大的 C 末端结构域 （C－terminal region）。 其中，
MADS 结构域（16－72 位氨基酸序列）含 57 个氨基
酸，I结构域 （73－104位氨基酸序列） 有 32 个氨基
酸，K 结构域（105－186 位氨基酸序列）含 82 个氨基
酸，C 末端结构域（187－244 位氨基酸序列）含 58 个
氨基酸。 这 10 个同源蛋白质在 K 结构域都包括 3
个保守的区域 K1 （105－126 位氨基酸序列 ）、K2
（139－153 位氨基酸序列）和 K3（161－186 位氨基酸
序列）， 并且这 3 个保守的区域含有许多疏水氨基
酸位点 ［7，8］。 PrtSHP 的 C 末端结构域含有 2 个高度
保守的模体：AGⅠ模体（AG motifⅠ）和 AGⅡ模体
（AG motif Ⅱ）［9］。
2．3 重瓣榆叶梅 PrtSHP 序列比对结果与分子系
统发生分析
从分子系统发生分析可知，PrtSHP 属 C 类转录
因子中的 PLE进化系，是拟南芥的 SHP同源蛋白质
（图 2）。 PrtSHP与同属近缘种桃的 PperSHP序列相
似性高达 99．59％，与日本晚樱的 PrseSHP 序列相似
性高达 93．90％， 与同科植物苹果的 MdMADS14、玫
瑰的 MASAKO D1 以及太行花的 TrSHP 序列相似
性分别高达 87．76％、83．33％和 74．09％，与拟南芥的
AGL1 ／ SHP1 和 AGL5 ／ SHP2 的序列相似性也分别
达 69．32％和 65．34％，其在进化上相当保守。 分子系
统发生分析表明，重瓣榆叶梅 PrtSHP 与日本晚樱的
PrseSHP、桃的 PperSHP 同聚于进化树的一个分支，
亲缘关系最近， 与苹果的 MdMADS14 亲缘关系次
之，与太行花的 TrSHP 和玫瑰的 MASAKO D1 亲缘
关系稍远，但这些蔷薇科植物共同聚于一个大的分
支，与其他物种区别开来，这与传统分类学所得的
结果完全一致（图 2）。
刘志雄等：重瓣榆叶梅 PrtSHP 的基因克隆与序列结构分析 2125
湖 北 农 业 科 学 2012 年
图 2 PrtSHP 的分子系统发生分析
PL
F
eu
AG
B
E
A
D
C
图 1 PrtSHP 的氨基酸序列的结构相似性比对结果与 AG I 模体和 AG II 模体
PrtSHP
PperSHP
PrseSHP
FBP6
GhMADS7
MASAKO D1
MdMADS14
PLE
AGL1/SHP1
AGL5/SHP2
PrtSHP
PperSHP
PrseSHP
FBP6
GhMADS7
MASAKO D1
MdMADS14
PLE
AGL1/SHP1
AGL5/SHP2
PrtSHP
PperSHP
PrseSHP
FBP6
GhMADS7
MASAKO D1
MdMADS14
PLE
AGL1/SHP1
AGL5/SHP2
PrtSHP
PperSHP
PrseSHP
FBP6
GhMADS7
MASAKO D1
MdMADS14
PLE
AGL1/SHP1
AGL5/SHP2
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第 10 期
（责任编辑 田宇曦）
3 讨论
植物生殖发育分子调控过程中，C、D 类转录因
子参与调控雌雄蕊和果实发育，它们在核心真双子
叶植物中有 3 种不同的基因型：euAG 型、PLE 型和
AGL11 型［9，10］。 这 3 种类型的基因编码的蛋白质在
序列上极为相似， 都拥有高度保守的 MADS－box
区，具有结合 DNA、介导蛋白质二聚化以及与其他
因子结合的功能［11］。 其 K结构域也包括 3个保守区
域：K1、K2 和 K3，主要由疏水氨基酸组成，参与蛋
白质异源二聚体的形成［8］。 在 MADS结构域和 K结
构域之间，有一个保守性相对较低的 I 结构域，该结
构域主要介导蛋白质二聚化和功能特化 ［12，13］。 即使
在序列变化最大的 C 末端结构域，这 3 类基因编码
的蛋白质依然拥有 2 个保守的模体：AGⅠ模体（AG
motifⅠ）和 AGⅡ模体（AG motif Ⅱ）［9］，这 2 个模体
在异源蛋白质四聚体的形成、转录激活和蛋白质功
能特化方面发挥重要作用 ［14，15］。 重瓣榆叶梅的
PrtSHP同样具有 C、D类转录因子的结构特点，并且
其 N 末端有 15 个氨基酸残基的延伸序列， 与其他
植物同类型的蛋白质结构类似［8］。
蛋白质序列 BLAST 比对与分子系统发生分析
表明，PrtSHP 的 C 末端结构域拥有保守的 AGⅠ模
体和 AGⅡ模体，属 C类转录因子中 PLE 进化系，是
拟南芥的 SHP同源蛋白质。PrtSHP与同属近缘种桃
的 PperSHP序列相似性高达 99．59％，说明其在进化
上相当保守，在桃中 PperSHP 主要在发育中的雌雄
蕊和果实中表达，并具有促进果实成熟和果核裂开
的功能，其在番茄萼片中的异位表达能诱导萼片发
生同源异型转变，形成类似心皮的结构，具有明显
的 C类基因的功能［16，17］。由于重瓣榆叶梅 PrtSHP序
列有极高的同源性，其在花和果实发育中的生理活
性和功能是否与桃的 PperSHP 相同，以及重瓣榆叶
梅雌蕊退化、幼果脱落和自然坐果率低是否与其编
码基因表达调控的变异有关，仍需要进一步研究。
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