全 文 ：第３３卷 第３期
２０１４年　５月
华　中　农　业　大　学　学　报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．３
Ｍａｙ　２０１４，１９～２５
收稿日期：２０１３－１０－１２
基金项目：国家自然科学基金项目 （３１３７１５４９、３１０７１３４６和３１０００１１５）
李一星，博士，讲师．研究方向：根瘤菌共生固氮的分子机理．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｉｘｉｎｇ３９＠ｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通信作者：李友国，博士，教授．研究方向：生物固氮、农业环境微生物．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｇｕｏｌｉ＠ｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
紫云英非特异性转脂蛋白ＡｓＩＢ２５９的体外酶活性
及在共生固氮中的功能
李一星　王建云　石晓峰　陈大松　李友国
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０
摘要　将紫云英ＡｓＩＢ２５９基因编码的一个预测的非特异性转脂蛋白 ＡｓＩＢ２５９（ｎｓＬＴＰ，ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ
ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）在大肠杆菌表达菌株Ｒｏｓｅｔｔａ　２（ＤＥ３）中进行了诱导表达，体外测定ＡｓＩＢ２５９蛋白的脂质结合动
力学特征，检测它对不同碳链长度脂肪酸及其衍生物的结合能力，进一步考查ＡｓＩＢ２５９超表达对紫云英毛根结
瘤情况的影响。结果表明：ＡｓＩＢ２５９具有转脂蛋白的典型特征，与１６～２２碳链长度脂肪酸的结合活性较强，对
茉莉酸也表现出一定的结合活性；ＡｓＩＢ２５９超表达导致根瘤数量增加１．５倍且固氮酶活性降低，说明该基因在
根瘤形成和固氮过程中发挥重要作用。
关键词　非特异性转脂蛋白；ＡｓＩＢ２５９；体外表达；脂质结合活性；共生固氮
中图分类号　Ｓ　１５４．３８＋１　　文献标识码　Ａ　　文章编号　１０００－２４２１（２０１４）０３－００１９－０７
　　植物非特异性脂质转移蛋白（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ
ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｎｓＬＴＰ）是广泛分布于多种植物中
的一类小分子分泌蛋白，在体外可与多种脂质结合。
它们含有高度保守的结构特征：由８个位点高度保
守的半胱氨酸残基形成４对二硫键和２个一致的五
肽模体［１］。目前已从多种植物中分离到 １０ 类
ｎｓＬＴＰ，其中在开花植物中常见的为 ＬＴＰ１ 和
ＬＴＰ２两个家族［２］。两者二级结构基本相同，但在
分子质量、等电点和脂质转运活性等方面存在差异，
且序列同源性低于３０％［３］。最初认为ＬＴＰ的作用
是参与脂类的转运［４］，但后来的研究发现，它们在植
物中以家族形式存在，在植物生长发育过程中发挥
了多种功能，如参与植物蜡质的合成和运输［５］、参与
角质层的形成［６］、增加细胞壁的延展性［７］、参与植物
对生物及非生物胁迫的抗性［８－９］、与花粉成熟有
关［１０］、和钙调素结合起调控作用［１１］等；最近还发现
ＬＴＰ在根瘤菌与植物共生过程中发挥作用［１２］。
豆科植物紫云英可与根瘤菌共生固氮，在紫云
英中存在一套与共生相关的功能基因［１３］。在前期
工作中，我们利用抑制差减杂交从紫云英中分离得
到２个转脂蛋白基因ＡｓＥ２４６和ＡｓＩＢ２５９。分子质
量和等电点预测结果表明，二者均属于ＬＴＰ１，但它
们的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 只 有 １９％［１４］。其 中
ＡｓＩＢ２５９编码蛋白预测大小为１４．８ｋｕ，ＡｓＩＢ２５９
在根瘤中特异表达，其转录水平呈现先升高后降低
的趋势，在接种根瘤菌２２ｄ左右表达量达到最高，
在接菌４０ｄ之后表达水平明显下降［１５］。这从一个
侧面说明了它可能与根瘤发育和固氮功能有关。本
研究将ＡｓＩＢ２５９编码蛋白在大肠杆菌中诱导表达，
测定了其脂质结合活性及与不同底物的结合能力，
并检测了该基因超表达对紫云英毛根结瘤表型及固
氮活性的影响，以期获得直接证据确证该蛋白的生
化性质及其在共生固氮过程中的功能表型。
１　材料与方法
１．１　材　料
大肠杆菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）表达菌株Ｒｏｓｅｔｔａ
２（ＤＥ３）购自 Ｎｏｖａｇｅｎ公司，该菌株可以识别稀有
密码子；发根农杆菌 Ｋ５９９（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ－
ｇｅｎｅｓ　Ｋ５９９）由华中农业大学生命科学技术学院张
忠明教授赠送；华癸中慢生根瘤菌 （Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｈｕａｋｕｉｉ）７６５３Ｒ、表达质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）和植物表达
双元载体ｐＢＩ１２１均为华中农业大学微生物学国家
重点实验室生物固氮研究室保存；克 隆 载 体
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第３３卷　
ｐＭＤ１８－Ｔ购自ＴａＫａＲａ大连有限公司。ＰＣＲ仪为
Ｂｉｏ－Ｒａｄ生产；荧光分光光度计ＲＦ－５３０１ＰＣ为岛津
公司产品；Ｓｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｒｍ购自
ＡＢＩ。ＥｘＴａｑ酶购自ＴａＫａＲａ大连有限公司，Ｔ４连
接酶、各种限制性内切酶及反转录酶均购自Ｆｅｒ－
ｍｅｎｔａｓ公司。ＲＮＡ抽提所用 Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎ－
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，荧光定量试剂盒ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ购自Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｉｓｔｅｒｍ公
司。ＤＮＡ分子质量标准购自广州东盛生物科技有
限公司，蛋白质分子质量标准购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。
Ｐ－９６荧光探针 （１－芘月桂酸）由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提
供，未标记的不同碳链长度的脂肪酸为 Ａｌａｄｄｉｎ公
司产品。
１．２　紫云英根瘤组织材料的采集和总ＲＮＡ的提取
　　紫云英种子先用７０％的乙醇处理５ｍｉｎ，再用
３％的ＮａＣｌＯ处理１０ｍｉｎ，然后无菌水洗涤５～６
次，将消毒后的种子用无菌水浸泡２ｈ后，平摊于含
有０．５％蔗糖和１．２％琼脂的平皿上，置于光照培养
箱中２２℃条件下萌发。待胚根长至１ｃｍ左右时，
接种于无菌花盆中培养，子叶展开后接种Ｍ．ｈｕａｋｕｉ
７６５３Ｒ。所有植株均用无氮营养液浇灌。接种后
２８ｄ，收集根瘤，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取根瘤
总ＲＮＡ，经ＤＮａｓｅⅠ处理后于－８０℃保存备用。
１．３　ＡｓＩＢ２５９大肠杆菌表达载体的构建
以接种后２８ｄ的根瘤组织总ＲＮＡ为模板，用
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８引物进行反转录得到ｃＤＮＡ，以引物５′－
ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡ－
ＣＡＡＴＧＧ－３′和５′－ＣＣＧＣＴＣＧＡ　ＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴ－
ＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧ－３′ＰＣＲ 扩增去掉信号肽的
ＡｓＩＢ２５９编 码 区。扩 增 产 物 经 回 收 连 入 载 体
ｐＭＤ１８－Ｔ，ＰＣＲ和测序验证后，用ＮｃｏⅠ 和ＸｈｏⅠ
双酶切，插入同样经双酶切的原核 表 达 载 体
ｐＥＴ２８ａ（＋）中，得到重组表达载体ｐＥＴ２５９。
１．４　ＡｓＩＢ２５９在大肠杆菌中的诱导表达
重组 质 粒 ｐＥＴ２５９ 转 化 大 肠 杆 菌 Ｒｏｓｅｔｔａ
２（ＤＥ３），经菌落ＰＣＲ和酶切验证，选择阳性转化子
测序。挑取测序正确的阳性克隆的单菌落，接种于
２０ｍＬ含有５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ液体培养基
中，２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜，以１％的接种量转接
到２５０ｍＬ　ＬＢ液体培养基中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡
培养至 Ｄ６００达到０．４～０．６，加入终浓度为０．１
ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，１６℃诱导过夜后，离心收集菌
体，经压力破碎后，上清用镍柱纯化，得到的蛋白样
品经超滤后溶于１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰＳ缓冲液。
１．５　重组蛋白的脂质结合动力学分析和体外脂质
结合活性测定
　　１）重组蛋白的脂质结合动力学。将纯化后的重
组蛋白溶于１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰＳ（ｐＨ　７．２）缓冲液中
制成酶液，终浓度为０．５μｍｏｌ／Ｌ，进行脂质结合动
力学分析：取３ｍＬ酶液加入荧光测试杯中，加入２０
μＬ　Ｐ－９６荧光探针 （３０μｍｏｌ／Ｌ），使其终浓度为０．２
μｍｏｌ／Ｌ，立即进行荧光测定。激发波长为３４３ｎｍ，
发射波长为３７８ｎｍ，自动记录１０ｓ内Ｐ－９６的荧光
强度变化。
２）重组蛋白脂质结合活性测定。取３ｍＬ重组
蛋白酶液，加入荧光测试杯中，然后加入不同体积的
Ｐ－９６母液，测定荧光强度的变化，以不含 ＡｓＩＢ２５９
的 ＭＯＰＳ缓冲液作为对照。
１．６　不同碳链长度脂肪酸与重组蛋白的竞争结合
实验
　　采用未标记荧光的不同碳链长度的脂肪酸进行
竞争性结合实验，这些脂肪酸包括：脱落酸、茉莉酸、
月桂酸 （Ｃ１２）、豆蔻酸 （Ｃ１４）、软脂酸 （Ｃ１６）、硬脂
酸 （Ｃ１８）、花生酸 （Ｃ２０）、山俞酸 （Ｃ２２）。分别将这
些脂肪酸溶于乙醇，使其终浓度均为３ｍｍｏｌ／Ｌ。
在荧光测试杯中加入３ｍＬ　０．５μｍｏｌ／Ｌ的酶液，再
加入５０μＬ　Ｐ－９６母液使其终浓度为０．５μｍｏｌ／Ｌ，此
时记录最大荧光强度值。然后向测试杯中加入不同
体积的未标记脂肪酸，检测荧光强度变化。
１．７　ＡｓＩＢ２５９超表达载体的构建
　 　 以 引 物 ５′－ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴ－
ＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＡ－３′和 ５′－ＣＧＧＧＡＴＣ
ＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴ－３′扩
增两端带有ＢａｍＨⅠ和ＸｂａⅠ酶切位点的ＡｓＩＢ２５９
编码区序列，产物经回收后克隆到ｐＭＴ１８－Ｔ载体，
测序正确后用ＢａｍＨⅠ和ＸｂａⅠ双酶切，正向连接
到植物双元载体 ｐＢＩ１２１ 上，得到超表达载体
ｐＢＩ２５９。
１．８　发根农杆菌介导的紫云英毛根转化实验
　　将超表达载体和空载体分别用电转化法转入发
根农杆菌 （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ｋ５９９，在含
有１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素和５０ｍｇ／Ｌ链霉素的ＬＢ平
板上筛选。挑选阳性克隆，接入添加了１００ｍｇ／Ｌ
卡那霉素和５０ｍｇ／Ｌ链霉素的２０ｍＬ　ＬＢ液体培养
基中，２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜。然后将２００ !Ｌ菌
液接种于１００ｍＬ不含抗生素的ＬＢ液体培养基中，
０２
　第３期 李一星 等：紫云英非特异性转脂蛋白ＡｓＩＢ２５９的体外酶活性及在共生固氮中的功能 　
振荡培养至Ｄ６００达到１．０。将萌发５ｄ的无菌苗从
下胚轴中部切断，在上述菌液中侵染１０ｍｉｎ，吸干
多余菌液后置于 ＭＳ平板上共培养。共培养３ｄ
后，转到含有５００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素的 ＭＳ培养基
上继续培养。约３周后，将每条毛根的根尖进行
ＧＵＳ染色，剪去未转化的根，使每株植株保留１～３
条转基因毛根。然后将植株转入无菌花盆，饥饿培
养３ｄ后，接种野生型Ｍ．ｈｕａｋｕｉｉ　７６５３Ｒ菌株进行
结瘤试验，以转化了空载体的毛根为对照。
２　结果与分析
２．１　ＡｓＩＢ２５９大肠杆菌表达载体的构建
为了检测ＡｓＩＢ２５９是否具有脂质结合活性，我
们将该蛋白在大肠杆菌中表达并体外检测其脂质结
合活性。以接种后２８ｄ的根瘤组织总 ＲＮＡ为模
板，ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到去掉信号肽的ＡｓＩＢ２５９编码
区序列，预期大小为３９９ｂｐ，琼脂糖凝胶电泳显示
扩增产物符合预期大小（图１Ａ）。重组表达质粒
ｐＥＴ２５９用ＮｃｏⅠ 和ＸｈｏⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电
泳 （图１Ｂ）显示有２条带，其中１条位于４００ｂｐ处，
用ＮｃｏⅠ单酶切得到１条带。将双酶切得到的４００
ｂｐ条带测序，结果证明与ＡｓＩＢ２５９完全一致，说明
载体构建成功。
　Ａ：去掉信号肽的ＡｓＩＢ２５９基因的琼脂糖凝胶电泳，泳道１、２：
ＡｓＩＢ２５９基因Ａ：Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＡｓＩＢ２５９ｗｉｔｈｏｕｔ
ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｌａｎｅ　１，２：ＡｓＩＢ２５９ｇｅｎｅ；Ｂ：重组质粒ｐＥＴ２５９的
酶切验证，泳道１：ＮｃｏⅠ 和ＸｈｏⅠ双酶切验证，泳道２：ＮｃｏⅠ单酶
切验证 Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ２５９，
Ｌａｎｅ　１：Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂｙ　ＮｃｏⅠａｎｄ　ＸｈｏⅠ，Ｌａｎｅ　２：Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｎｃｏ
Ⅰ．Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ．
图１　大肠杆菌表达载体ｐＥＴ２５９的酶切验证
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ２５９
２．２　重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
将原 核 表 达 载 体 ｐＥＴ２５９ 转 入 大 肠 杆 菌
Ｒｏｓｅｔｔａ　２（ＤＥ３），以０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导１６ｈ，
破碎细胞后，将上清、沉淀和总蛋白样品进行ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳检测，结果发现重组蛋白主要存在于总
样和上清中（图２）。重组蛋白的Ｃ端带有 Ｈｉｓ－ｔａｇ
标签，因此上清蛋白用镍柱纯化，得到重组蛋白。将
纯化后的蛋白用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，其大小约
１５ｋｕ，与预期相符。
　泳道１：重组菌诱导后的总蛋白 Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ；泳道２：重组菌诱导破碎后的上清蛋白Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｓｕｐｅｒｎａ－
ｔａｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｒｕｓｈｉｎｇ；泳道
３：重组菌未加ＩＰＴＧ诱导的总蛋白 Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＩＰＴＧ；泳道４～１０：纯化后的 ＡｓＩＢ２５９－
Ｈｉｓ重组蛋白Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＡｓＩＢ２５９－Ｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
图２　ＡｓＩＢ２５９蛋白在大肠杆菌中诱导表达的
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测
Ｆｉｇ．２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ＡｓＩＢ２５９　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ
２．３　重组蛋白的脂质结合动力学特征
当２０μＬ　Ｐ－９６荧光探针加入重组 ＡｓＩＢ２５９蛋
白溶液后，溶液的荧光强度迅速增加，达到半数最大
值的时间约为４ｓ，６ｓ之后进入平台期，荧光强度不
再增加 （图３）。这一曲线的特征与谢万钦等［１６］报
道的白菜ＣａＭＢＰ－１０和Ｇｕｅｒｂｅｔｔｅ等［１７］报道的玉米
ｎｓＬＴＰ与Ｐ－９６结合的动力学曲线特征一致，说明
ＡｓＩＢ２５９具有典型的转脂蛋白特性。
图３　ＡｓＩＢ２５９重组蛋白与Ｐ－９６结合的动力学曲线
Ｆｉｇ．３　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｓＩＢ２５９　ｔｏ　Ｐ－９６
１２
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第３３卷　
２．４　重组蛋白体外脂质结合活性
在重组蛋白酶液中加入不同体积的Ｐ－９６荧光
探针，测定 ＡｓＩＢ２５９的体外脂质结合活性，以不含
ＡｓＩＢ２５９的 ＭＯＰＳ缓冲液作为对照。Ｐ－９６在水溶
液中所发荧光极弱，当进入ｎｓＬＴＰ分子的疏水空穴
并与之结合后，荧光大大增强，然而当第２个脂肪酸
分子 （Ｐ－９６）进入时，荧光开始淬灭［１６］。我们的检
测结果表明ＡｓＩＢ２５９与Ｐ－９６的结合符合这一典型
特征，如图４所示：随着Ｐ－９６浓度的增加，荧光逐渐
增强，直至最大，当Ｐ－９６＞１．２μｍｏｌ／Ｌ，荧光强度不
再增加。
图４　重组ＡｓＩＢ２５９蛋白的脂质结合活性
Ｆｉｇ．４　Ｌｉｐｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｓＩＢ２５９
２．５　重组蛋白与不同脂肪酸底物的结合活性
利用未标记的脂肪酸与Ｐ－９６荧光探针竞争结
合重组蛋白检测荧光强度变化，结果显示各脂肪酸
均可以和Ｐ－９６竞争结合重组蛋白，但是竞争结合能
力根据其碳链长度不同表现出一定差异性 （图５）。
与较短碳链长度的脂肪酸相比，碳链长度为１６～２２
个碳原子的脂肪酸竞争结合能力更强，其中１６个碳
原子的脂肪酸竞争结合能力最强。另外，重组蛋白
对茉莉酸也表现出一定程度的亲和性，而脱落酸的
竞争结合能力较弱。
图５　不同脂肪酸与重组ＡｓＩＢ２５９蛋白的竞争结合能力
Ｆｉｇ．５　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆａｔｙ　ａｃｉｄｓ
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｓＩＢ２５９
２．６　ＡｓＩＢ２５９超表达对紫云英毛根结瘤表型的
影响
　　取接种根瘤菌Ｍ．ｈｕａｋｕｉｉ　７６５３Ｒ３０ｄ后的超
表达和对照嵌合型植株各１０株，收获根瘤，采用
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ方法检测超表达效率，引物为
５′－ＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣ－３′ 和 ５′－ＣＧＡＧＴ－
ＧＡＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣ－３′，结果如图６所示。超表
达根瘤中，ＡｓＩＢ２５９的转录水平平均为对照根瘤的
３．５倍，说明该基因被超表达。盆栽结果表明对照
和超表达的发根均正常结瘤，接种后３０ｄ观察转化
植株地上部分发现，超表达植株与对照植株相比长
势稍好，但差异不显著（图７Ａ）。然而分别从不同植
株上采集超表达和对照发根各１０根，统计根瘤数量
发现：超表达发根平均根瘤数量增加为对照的
１．５倍，二者在根瘤颜色和形态上无显著差别（图７
Ａ、Ｃ）。以上结果说明：ＡｓＩＢ２５９超表达对结瘤具有
促进作用。
　荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法检测接种３０ｄ根瘤中的超表达效率，对
照为转化了空载体ｐＢＩ１２１的根瘤 Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｎｏｄｕｌｅｓ
ａｔ　３０ｄａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＹＢＲ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－
ＰＣＲ　ａｎｄ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｅｍｐｔｙ　ｐＢＩ１２１ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ．
图６　ＡｓＩＢ２５９在根瘤中的超表达效率检测
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ＡｓＩＢ２５９
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｄｕｌｅｓ
２．７　ＡｓＩＢ２５９超表达对根瘤固氮酶活性的影响
收获接种根瘤菌７６５３Ｒ３０ｄ后的对照和超表
达嵌合型植株各９株，剪去地上部分，收集地下部分
（包括毛根和根瘤），利用乙炔还原法测定固氮酶活
性，结果（图８）表明：超表达根瘤的固氮酶活低于对
照根瘤，只有对照组的２／３。这一结果与２种类型
植株地上部分的长势情况相符，虽然超表达毛根结
瘤数量较多，但其根瘤的固氮酶活却低于对照组，因
此２种植株地上部分长势并无显著差别。
２２
　第３期 李一星 等：紫云英非特异性转脂蛋白ＡｓＩＢ２５９的体外酶活性及在共生固氮中的功能 　
　　Ａ：对照和超表达植株的根瘤数量比较，以转化了空载体ｐＢＩ１２１的嵌合型植株为对照，图中数据为接种后３０ｄ，分别统计１０株对照
和１０株超表达植株得到的平均值，不同字母代表在Ｐ＜０．０５水平差异显著 Ｎｏｄｕｌｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ
ｐｌａｎｔｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｍｐｔｙ　ｐＢＩ１２１ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｅｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｌａｎｔｓ　ｏｒ　ｔｅｎ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｎｅｓ　ａｔ　３０ｄａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｔ　Ｐ＜０．０５；Ｂ：对
照和超表达植株的结瘤情况比较，左：对照植株，右：超表达植株 Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｐｌａｎｔｓ．
Ｌｅｆｔ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｒｉｇｈｔ：Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｃ：Ｂ图的局部放大图，左：对照植株，右：超表达植株 Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ．Ｌｅｆｔ：Ｃｏｎｔｒｏｌ，
Ｒｉｇｈｔ：Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ．
图７　ＡｓＩＢ２５９超表达对毛根结瘤的影响
Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡｓＩＢ２５９　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ
　各取９株接种后３０ｄ的对照和超表达嵌合型植株，测定根瘤固
氮酶活，对照组为转化了空载体ｐＢＩ１２１的根瘤，重复３次 Ａｆｔｅｒ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　３０ｄ，ｎｉｎｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｎｉｎｅ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ
ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｆｏｒ　ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙ．Ｃｏｍ－
ｐｏｓｉｔｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｍｐｔｙ　ｐＢＩ１２１ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ．Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．
图８　ＡｓＩＢ２５９超表达对根瘤固氮酶活的影响
Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡｓＩＢ２５９　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｎ　ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅ　ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
３　讨　论
ＡｓＩＢ２５９是我们前期分离、克隆获得的１个紫
云英根瘤特异表达的结瘤素基因，其编码蛋白具有
典型的ｎｓＬＴＰ结构域，预测其为ｎｓＬＴＰ１家族成
员。本研究将 ＡｓＩＢ２５９ 在大 肠 杆 菌 Ｒｏｓｅｔｔａ　２
（ＤＥ３）中成功表达并纯化，证实了该蛋白确实具有
ｎｓＬＴＰ的生物活性，而且该蛋白的超表达影响了根
瘤数量和固氮酶活性。
植物非特异性转脂蛋白广泛分布于各种植物
中，来自豆科植物的ＬＴＰ基因早有报道，例如绿豆
（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｍｕｎｇｏ）的 １ 个 ＬＴＰ 基因［１８］，菜豆
（Ｖｉｇｎａ　ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）的ｐｖｒ３［１９］，还有被认为与共
生早期相关的苜蓿 ＭｔＮ５［２０］等。但是有关其功能
的研究一直以来鲜有报道，直到２００９年Ｐｉ等［１２］提
供了有力的试验证据证明苜蓿 ＭｔＮ５确实与共生
固氮有关。最近该研究小组又提出 ＭｔＮ５的作用
发生于结瘤因子之后，可能参与皮层细胞中与根瘤
菌侵染相关的信号传递，调控根瘤菌的侵染［２１］。虽
然同属于ｎｓＬＴＰ，ＡｓＩＢ２５９却有着不同于 ＭｔＮ５的
特点：ＭｔＮ５ 属于 ＬＴＰ２家族，而 ＡｓＩＢ２５９属于
ＬＴＰ１家族；更重要的是 ＭｔＮ５在侵染早期即有表
３２
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第３３卷　
达且在根和根瘤中均表达，而ＡｓＩＢ２５９只在根瘤中
特异表达，这暗示着它们二者之间可能具有不同的
功能或作用机制。
在病原菌和植物的互作过程中，ＬＴＰ在植物抗
性应答的信号途径中发挥重要作用。它可与多种脂
肪酸及其衍生物如水杨酸和茉莉酸等结合，参与植
物防御反应。Ｍａｌｄｏｎａｄｏ等［２２］提出拟南芥的１个
ｎｓＬＴＰ（ＤＩＲ１）可传导１种重要的信号，且ＤＩＲ１可
以通过与１个脂类来源的分子互作来促进这种长距
离的信号传递。Ｐｉ等［２３］也提出 ＭｔＮ５和ＤＩＲ１等
一些ｎｓＬＴＰ成员组成了ＬＴＰ家族中一个新的亚家
族，即和脂质信号传递相关的ＬＴＰ亚家族。Ｂｕｈｏｔ
等［２４］对烟草ＬＴＰ的研究发现，虽然它可以和多种
脂肪酸及其衍生物结合，但是只有与茉莉酸的结合
最有效。本研究中，重组蛋白ＡｓＩＢ２５９在体外也可
以和茉莉酸结合，而茉莉酸等在共生固氮过程中可
能调控结瘤和根瘤发育［２５］；另一方面，本研究观察
到ＡｓＩＢ２５９在紫云英毛根中超表达导致根瘤数量
增加、固氮酶活降低。这些结果启示我们：ＡｓＩＢ２５９
在共生固氮过程中的功能机制是否与茉莉酸信号的
传递途径有关，或者与其他某种 （些）脂类发生互
作，从而在紫云英等豆科植物与根瘤菌的共生固氮
中发挥关键作用，这些科学问题均需要深入研究。
参 考 文 献
［１］　ＭＡＬＤＯＮＡＤＯ　Ａ　Ｍ，ＤＯＥＲＮＥＲ　Ｐ，ＤＩＸＯＮ　Ｒ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｐｕ－
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ｇｅｎｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
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ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｎ５ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａｉｓ　ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｅｐ－
ｉｄｅｒｍａｌ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ－ｈｏｓｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＢＭＣ
Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１２：２３３．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．
４２
　第３期 李一星 等：紫云英非特异性转脂蛋白ＡｓＩＢ２５９的体外酶活性及在共生固氮中的功能 　
ｃｏｍ／１４７１－２２２９／１２／２３３．
［２２］ＭＡＬＤＯＮＡＤＯ　Ａ　Ｍ，ＤＯＥＲＮＥＲ　Ｐ，ＤＩＸＯＮ　Ｒ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｐｕ－
ｔａｔｉｖｅ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｉｇ－
ｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１９：３９９－４０３．
［２３］ＰＩＩ　Ｙ，ＰＡＮＤＯＬＦＩＮＩ　Ｔ，ＣＲＩＭＩ　Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ＬＴＰｓ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ
ＬＴＰｓ　ｓｕｂ－ｆａｍｉｌｙ？［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｂｅｈａｖ，２０１０，５（５）：５９４－
５９７．
［２４］ＢＵＨＯＴ　Ｎ，ＧＯＭＥＳ　Ｅ，ＭＩＬＡＴ　Ｍ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｔｏｂａｃｃｏ　ＬＴＰ１ｂｙ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ［Ｊ］．
Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌ，２００４，１５：５０４７－５０５２．
［２５］ＶＡＮ　ＤＥ　ＶＥＬＤＥ　Ｗ，ＧＵＥＲＲＡ　Ｊ　Ｃ，ＤＥ　ＫＥＹＳＥＲ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａｇ－
ｉｎｇ　ｉｎ　ｌｅｇｕｍｅ　ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ：ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｖｉｅｗ　ｏｎ　ｎｏｄｕｌｅ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，１４１：７１１－７２０．
Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｓＩＢ２５９
ｆｒｏｍＡｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｓｉｎｉｃｕｓ　ｉｎ　ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ
ＬＩ　Ｙｉ－ｘｉｎｇ　ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－ｙｕｎ　ＳＨＩ　Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ　ＣＨＥＮ　Ｄａ－ｓｏｎｇ　ＬＩ　Ｙｏｕ－ｇｕｏ
Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｗｕｈａｎ　４３００７０，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＡｓＩＢ２５９ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｓｉｎｉｃｕｓ．
ＡｓＩＢ２５９ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｒｏｓｅｔｔａ　２（ＤＥ３）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉ－
ｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｐ－９６ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｂｅ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｉｔｓ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ａｓ　ｗｅｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｐｈｅｎｏ－
ｔｙｐｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡｓＩＢ２５９ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｓＩＢ２５９ｄｉｓ－
ｐｌａｙｅｄ　ｈｉｇｈ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏｗａｒｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ　ｗｉｔｈ　１６－２２ｃａｒｂｏｎ　ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ；ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ
ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｌｅｄ　ｔｏ　ａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　１．５－ｆｏｌｄ　ｎｏｄｕｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ，ｂｕｔ　ｔｏ　ａ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｓＩＢ２５９ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡｓＩＢ２５９；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；ｌｉｐｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ
（责任编辑：张志钰）
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