全 文 ：第 35卷 第 9期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vo .l 35 No. 9
2007年 9月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UN IVERSITY Sep. 2007
黄波罗的愈伤组织培养 1)
亓　磊 　詹亚光
(东北林业大学 ,哈尔滨 , 150040)
　　摘　要　通过组织培养技术研究了 NAA、NAA与 6 -BA组合 、培养基类型 、培养基 pH值、蔗糖质量浓度、接种量 、
培养时间及继代次数对黄波罗愈伤组织生长的影响。结果表明:单独使用 NAA时 ,以 1. 0 mg L -1愈伤组织生长率最
高;NAA与 6 -BA组合 ,以 0. 3m g L- 1 6 -BA+1. 0 mg L -1 NAA最好, 其生长量明显大于单独使用 NAA的处理。黄
波罗愈伤组织最佳的培养体系为:NT+0. 3mg L- 1 6 -BA+1. 0m g L- 1 NAA,培养基 pH值为 6. 3左右, 蔗糖质量浓度
为 20 g L -1 ,接种量 0. 4 g,继代时间为 20 d,愈伤组织生长量在培养 4代后达到最大,达 2. 14 g左右。
关键词　黄波罗;愈伤组织;继代培养
分类号　Q813. 1
Callus Cu lture of Phellodendron amurense Rupr. /Q i Le i, Zhan Yaguang (Northea st Forestry University, H arb in
150040, P. R. China) / /Journal o fNo rtheast Forestry University. - 2007, 35(9). - 14 ～ 15, 23
The effec ts of different concentrations of NAA , com bina tion o fNAA and 6-BA, types of culturem ed ia, pH o fm ed ia,
ca rbon sources, inocu lating quantity, cu lture tim e, and subculture num ber on ca llus cu lture of Phe llodendron am urense
w ere stud ied by tissue cu ltu re. Resu lts show tha t 1. 0 mg L - 1 NAA is the best for ca llus cu ltu re when it is used sing ly.
The op tim a l comb ination is 1. 0 mg L - 1 NAA +0. 3m g L - 1 6-BA w hen bo th NAA and 6-BA are used, and the ca llus
y ield is significan tly higher than that using NAA sing ly. The best cu lture sy stem ofP. amurense is ob ta ined as medium
supp lemented w ith NT, 0. 3 mg L - 1 6-BA and 1. 0 m g L - 1 NAA , pH 6. 0, carbon sources 20 g L - 1 , inoculating
quantity 0. 4 g, and cu lture tim e 20 day s. The callus y ie ld up to 2. 14 g afte r the subcu lture is repea ted 4 tim es.
K ey words　Phellodendron amurense Rupr. ;C allus;Subcu lture
　　黄波罗 (Phellodendron am urense Rupr. )是芸香科黄檗属
植物 , 为我国东北地区三大珍贵阔叶树种之一 , 材质优良 , 树
皮富含小檗碱 、药根碱等多种生物碱成分 , 是传统中药学珍贵
的三大木本药材之一 ,其是提取小檗碱的重要原材料 [ 1] 。然
而 , 从天然植株上提取小檗碱受到季节 、资源等条件的约束 ,
提取量有限 , 难以满足市场需求 [ 2] 。因此 , 利用植物组织培
养技术快速繁殖小檗碱含量高的黄波罗植株 , 或者通过组培
繁殖愈伤组织进行大规模细胞培养生产药用次生产物 , 具有
重要的实践意义。至今 ,应用组织培养技术生产次生代谢产
物的植物已超过百种 ,一半以上次生代谢产物含量超过原植
株 [ 3] 。该技术在人工控制的条件下改变培养条件 , 筛选出高
次生代谢产物量的优良细胞系 ,为下一步大规模细胞悬浮培
养以及利用生物工程手段改良细胞 , 生产有用次生代谢产物
提供了材料保证 [ 4] 。但迄今国内对黄波罗愈伤组织培养及
其次生代谢产物的研究还未见报道 , 多数为离体快繁研
究 [ 5] 。笔者旨在通过比较不同的激素组合 、培养基类型 、培
养条件等 [ 6]对黄波罗愈伤组织继代培养的影响 , 筛选黄波罗
愈伤组织继代培养最佳的生长条件 , 为通过细胞悬浮培养进
行黄波罗中小檗碱的代谢调控及生产等工作奠定基础。
1　材料与方法
2005年 5月份 , 采集成年黄波罗枝条 , 水培。取下休眠
芽 , 经体积分数为 3%的次氯酸钠表面消毒后 ,接于 MS培养基
上 , 诱导形成无菌枝条。取茎段作为愈伤组织诱导材料 , 在
M S+0. 3 mg L - 1 6 - BA +2. 0 mg L -1 NAA上诱导的愈伤
组织 ,经 NT+0. 3 mg L - 1 6 - BA+1. 0 mg L - 1 NAA培养基
1)大庆市科学技术计划项目(大庆地区抗旱耐盐绿化树种资源
的选择 、引种及产业化繁殖技术研究)。
第一作者简介:亓磊 ,男 , 1982年 6月生 ,东北林业大学生命科学
学院 ,硕士研究生。
通讯作者:詹亚光 ,东北林业大学生命科学学院 ,教授。
收稿日期:2006年 11月 6日。
责任编辑:张建华。
上继代培养一代后 , 进行愈伤组织继代培养的研究。每个处
理接种 20瓶 , 每瓶接种外植体 2块。接种量均控制在 0. 4 g
左右 ,培养 3周后收获 , 观察并记录生长情况。
愈伤组织增长量 =收获量 /瓶 -接种量 /瓶;
愈伤组织增长率 =愈伤组织增长量 ×100 /接种量。
培养基中加入蔗糖 20 g L - 1 , 琼脂 5. 3 g L -1 , 添加抗
坏血酸 1. 0m g L - 1 , pH 值(酸度计测量)控制在 6. 0左右。
培养温度控制在(25±2)℃,光照 12 h d-1 ,光照强度 1 000 ～
1 500 lx。
2　结果与分析
2. 1　激素对黄波罗愈伤组织培养的影响
2. 1. 1　NAA对愈伤组织培养的影响
取继代培养一代的新鲜愈伤组织 , 分别接种到 NAA质量
浓度为 0、0. 1、0. 5、1. 0、2. 0、 4. 0 mg L - 1NT培养基上 , 进行
NAA对愈伤组织培养的影响试验。由表 1可知 ,不同质量浓
度的 NAA对黄波罗愈伤组织继代生长的影响差异较大。 低
质量浓度 NAA的处理 , 愈伤组织增长量较小;当 NAA质量浓
度为 1. 0m g L - 1时 , 愈伤组织生长最旺盛 , 呈浅黄色 , 表面
富有光泽;当 NAA质量浓度在 2. 0m g L - 1以上时 , 愈伤组织
鲜质量增长量有所下降。培养 20 d左右 , 部分愈伤组织出现
褐化现象 ,说明高质量浓度的生长素对愈伤组织生长有一定
的抑制作用。
表 1　NAA质量浓度对愈伤组织生长的影响
NAA质量浓度 /mg L -1 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长量率 /%
0 0. 09±0. 01 25
0. 1 0. 24±0. 02 63
0. 5 0. 54±0. 02 134
1. 0 0. 67±0. 16 170
2. 0 0. 53±0. 03 147
4. 0 0. 46±0. 04 113
2. 1. 2　NAA与 6 -BA交互作用对愈伤组织培养的影响
以 NAA最佳质量浓度 1. 0 m g L- 1为基础 , 分别接种到
添加质量浓度为 0、0. 1、0. 3、 0. 5、 1. 0、 2. 0m g L - 1 6 -BA的
NT培养基上 , 进行 NAA与 6 -BA交互作用对愈伤组织培养
的影响试验(表 2)。另外 ,进行了单独使用 2, 4 -D及与 6 -
BA组合对愈伤组织继代培养的试验。
表 2　NAA与 6 - BA交互作用对愈伤组织生长的影响
6 -BA +NAA /mg L - 1 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长量率 /%
0. 0 6 -BA +1. 0 NAA 0. 67±0. 16 170
0. 1 6 -BA +1. 0 NAA 1. 35±0. 08 323
0. 3 6 -BA +1. 0 NAA 1. 62±0. 08 392
0. 5 6 -BA +1. 0 NAA 1. 11±0. 07 330
1. 0 6 -BA +1. 0 NAA 0. 85±0. 05 278
2. 0 6 -BA +1. 0 NAA 0. 76±0. 06 206
　　表 2结果表明:激素对黄波罗愈伤组织培养有很大的影
响 , 在没有添加生长素的处理中 , 愈伤组织生长很差 , 添加
NAA的处理生长较旺盛;6 - BA与 NAA组合愈伤组织生长
量较单独使用 NAA的处理大 , 其中以 0. 3 mg L- 1 6 - BA +
1. 0m g L - 1 NAA组合生长量最大。添加高 6 -BA的处理 ,
增长量明显减少 ,说明 6 - BA质量浓度过高对黄波罗愈伤组
织生长不利 , 但生长量较没有 6 - BA的处理高 , 说明 6 - BA
对愈伤组织生长有一定的促进作用。所以 6 - BA与 NAA组
合要控制在一定的范围之内。
生长素 2, 4 -D对黄波罗愈伤组织生长有一定的抑制作
用 , 无论浓度变化还是与 6 -BA组合 , 只要含有 2, 4 -D的处
理 , 在培养一段时间后 ,愈伤组织均发生褐化 ,并逐渐枯死 , 说
明黄波罗愈伤组织不宜使用 2, 4 -D继代培养。黄波罗愈伤
组织对不同激素组合的这些反应 , 说明同一类激素内不同种
类间的效应差异和植物物种或品种对激素反应的特异性 , 进
一步说明了激素作用的复杂性 [ 7] 。
2. 2　培养基类型对愈伤组织培养的影响
以激素组合 0. 3 mg L - 1 6 - BA +1. 0 m g L -1 NAA为
基础 , 进行不同培养基类型 [ 8]对愈伤组织培养的影响试验
(表 3),结果表明:NT培养基最有利于黄波罗愈伤组织继代
培养 , 其鲜质量增长量是其他培养基的 2 ～ 3倍 , 其次是 B5培
养基 , MS和 WPM 培养基继代效果最差。在 M S培养基上 , 大
多数黄波罗愈伤组织发生褐化现象严重 , 说明高盐培养基对
黄波罗愈伤组织生长不利。
表 3　不同培养基对愈伤组织生长的影响
培养基类型 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长率 /%
M S 0. 56±0. 04 137
NT 1. 62±0. 08 392
IS 0. 61±0. 05 158
W PM 0. 55±0. 04 138
B5 0. 81±0. 05 200
2. 3　培养基 pH值对愈伤组织培养的影响
以 NT+0. 3 mg L - 1 6 -BA +1. 0 m g L - 1 NAA为基本
培养基 , 在培养基可调的 pH值范围内进行不同培养基 pH值
对愈伤组织培养的影响试验 ,结果表明 (表 4):不同的 pH值
对愈伤组织生长影响不同 ,其中 pH值为 6. 3左右时 ,愈伤组
织富有光泽 , 生长最旺盛 , 鲜质量增长量最大;pH值过低 , 愈
伤组织褐化现象严重;pH值过高 , 愈伤组织逐渐失去光泽 , 生
长缓慢。所以 , 黄波罗愈伤组织继代培养的培养基 pH值宜
控制在 6. 3左右。
2. 4　培养基蔗糖质量浓度对愈伤组织培养的影响
蔗糖不仅起碳源的作用 , 而且还具有调节渗透压的作用 ,
对愈伤组织的生长影响显著。以 NT+0. 3 m g L - 1 6 - BA+
1. 0 m g L- 1 NAA为基本培养基 ,进行不同培养基蔗糖质量
浓度对愈伤组织培养的影响试验。由表 5可知 , 培养基最适
的蔗糖质量浓度为 20 g L - 1 , 而当蔗糖质量浓度为 40 g
L -1时 ,鲜质量增长量明显下降 , 说明高蔗糖质量浓度对愈伤
组织生长有一定的抑制作用。
表 4　不同培养基 pH值对愈伤组织生长的影响
培养基 pH值 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长率 /%
5. 3 0. 32±0. 07 81
5. 8 0. 78±0. 03 253
6. 3 0. 88±0. 04 261
6. 8 0. 62±0. 14 179
表 5　培养基蔗糖质量浓度对愈伤组织生长的影响
蔗糖质量浓度 /mg L - 1 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长率 /%
10 1. 86±0. 04 476
20 2. 14±0. 07 571
30 1. 84±0. 08 512
40 1. 38±0. 09 369
2. 5　接种量对愈伤组织培养的影响
由表 6可知:当接种量在 0. 20 ～ 0. 40 g范围内, 随着接种
量的增加 ,愈伤组织增长量逐渐增大;当接种量到 0. 40 g时 , 愈
伤组织增长量达到最大;当接种量为 0. 40 g以上时 ,愈伤组织
增长量与增长率明显下降 ,说明较大块的愈伤组织更不利于增
殖培养。其中 ,接种量为 0. 20 g的愈伤组织增长率最高 , 但是
由于接种量较小 ,愈伤组织容易褐化 ,对大量继代培养不利 , 所
以 ,最适的接种量为 0. 40 g。
表 6　不同接种量对愈伤组织生长的影响
接种量 /g 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长率 /%
0. 20 0. 98±0. 03 490
0. 30 1. 02±0. 04 351
0. 35 0. 99±0. 10 287
0. 40 1. 31±0. 05 329
0. 45 0. 82±0. 03 182
0. 50 0. 88±0. 05 165
2. 6　培养时间对愈伤组织培养的影响
取继代第三代愈伤组织接种于 NT+0. 3mg L- 1 6 - BA+
1. 0 m g L- 1 NAA的培养基上培养 , 每隔 4 d取一次样 ,测定
愈伤组织鲜质量 , 做愈伤组织培养的生长曲线 (图 1)。由图
1可知 ,黄波罗愈伤组织生长曲线大致为 S形:0 ～ 4 d, 处于生
长延迟期 , 生长量很低;8 ～ 16 d, 愈伤组织生长明显加快 , 进
入对数生长阶段 , 生长量为延迟期的 10倍以上;20 d左右 , 愈
伤组织生长量达到最大 ,之后逐渐开始下降 ,所以 ,愈伤组织
最适的继代时间为 20 d。
图 1　黄波罗愈伤组织生长曲线
2. 7　继代次数对愈伤组织培养的影响
取黄波罗无菌幼茎诱导出新鲜愈伤组织接(下转 23页)
15第 9期　　　　　　　　　　　　　　　　亓　磊等:黄波罗的愈伤组织培养　　　　　　　　　　　　
径超过其他混交距离的油松。这个结果说明当混交距离大于
等于 760 cm时混交对油松的生长有一定的促进作用 ,发展油
松 -元宝枫混交是可行的 ,但混交距离不应小于 760 cm。
表 8　油松平均胸径与油松 、元宝枫距离间关系
树种间距 /cm 调查株数 平均胸径 /cm 标准差 /cm
100～ 195 4 7. 65 1. 10
200～ 450 6 8. 23 1. 42
450～ 645 7 9. 26 1. 30
650～ 750 7 10. 10 0. 75
760～ 800 6 10. 50 1. 28
4　结论与讨论
不同混交模式林分生产力 、生物量及其分配状况 、林分土
壤养分分配状况 、混交距离对油松生长的影响与不同林分土
壤水源涵养能力的试验数据表明:不同模式的油松 -元宝枫
混交林种间关系具有不同的结构与功能。一方面 ,油松 -元
宝枫块状混交林的生产力、生物量及其分配状况均好于油松 -
元宝枫带状混交林与油松纯林。另一方面 ,油松 -元宝枫块状
混交林林下枯落物分解速度较快 ,积累量明显少于油松 -元宝
枫带状混交林与油松纯林, 从而油松 -元宝枫块状混交林具有
较好的改良土壤的作用 , 从而导致油松 -元宝枫块状混交林
的土壤物理 、化学性质及其涵养水源功能好于油松 -元宝枫
带状混交林。
无论是在地上还是在地下 , 元宝枫对油松生长都有一定
的抑制作用 ,这种作用随着 2个树种混交距离加大而减小 , 但
当油松与元宝枫的距离大于 760 cm时 , 油松生长不受影响 ,
相反对油松生长起到一定的促进作用。混交方式采用块状混
交能起到较好的效果。 本研究结果可以作为 15年生油松 -
元宝枫混交林健康经营的指导参数。
参　考　文　献
[ 1] 　汪有奎 ,袁虹.祁连山森林健康保护与恢复策略 [ J] .北华大学
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[ 2] 　陈高 , 代力民 , 范竹华 , 等.森林生态系统健康及其评估监测
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元素的含量与分布 [ J] .北京林学院学报 , 1985(4):1 -14.
(上接 15页)种于 NT +0. 3 m g L - 1 6 - BA +1. 0 m g L - 1
NAA的培养基上进行继代培养 , 试验继代次数对愈伤组织生
长的影响(表 7)。结果表明 ,随着继代次数的增多 ,愈伤组织
的增长量逐渐增加 , 到第 4代增长量达到最大 ,之后增长量逐
渐下降。经过几代培养后 , 愈伤组织质地变得松散 , 颜色多为
浅黄色 , 这种松散 、生长旺盛的愈伤组织适合进行愈伤组织的
悬浮培养 , 所以 ,进行液体悬浮培养的最佳材料为继代 4次的
愈伤组织。
表 7　继代次数对愈伤组织生长的影响
继代次数 愈伤组织增长量(鲜质量) /g 愈伤组织增长率 /%
1代 0. 60±0. 07 146
2代 1. 12±0. 05 264
3代 1. 16±0. 10 300
4代 2. 14±0. 07 571
5代 1. 85±0. 05 435
3　结论与讨论
试验表明 , 激素对黄波罗愈伤组织继代培养有很大的影
响 , 在没有添加生长素的处理中 , 愈伤组织生长很差 , 添加
NAA的处理 , 愈伤组织生长较旺盛。 6 - BA与 NAA组合 , 愈
伤组织生长量较单独使用 NAA的处理大 , 其中以 0. 3 mg
L - 1 6 -BA+1. 0m g L- 1 NAA组合生长量最大。另外 , 生长
素 2, 4 -D对黄波罗愈伤组织生长有一定的抑制作用 , 转接
一段时间后 , 愈伤组织褐化现象严重 , 不宜用于继代培养。
不同培养基的无机元素浓度差异很大 , 对植物细胞生长
和次生代谢产物的形成必然会有较大的影响。试验表明:高
盐培养基(MS)培养 ,愈伤组织褐化现象严重 , 严重影响细胞
增殖 , 不利于黄波罗愈伤组织继代培养;NT培养基继代培养 ,
愈伤组织的增长率明显高于其他培养基类型 , 最适合于黄波
罗愈伤组织继代培养 。
黄波罗愈伤组织继代培养过程中 , 早期培养褐化现象严
重 , 对其继代生长影响严重。其中 , 主要的影响因素有:植物
外植体基因型 、外植体材料的生理状态 、培养基成分 (无机
盐 、细胞分裂素等浓度过高容易发生褐化)、继代时间过长 、
转接过程中操作不当等 [ 9] , 因此 , 控制愈伤组织的褐化对下
一步愈伤组织液体悬浮培养 、次生代谢产物生产有很重要的
意义。试验表明 , 在选择合适的培养成分的基础上 ,添加 1. 0
mg L - 1还原性物质抗坏血酸 ,在继代操作过程中尽量减少
对愈伤组织的损伤 , 均可有效地减少黄波罗愈伤组织的褐化
现象。
培养条件对愈伤组织生长有较大的影响 , 说明控制生长
条件可以有效地提高愈伤组织分化增殖效率。培养条件不
同 ,愈伤组织的质地 、颜色也有较大差异 , 这些生理生化特征
及分化能力有较大差异的愈伤组织 , 在次生代谢产物含量方
面是否存在差异 , 还需进一步的研究。
参　考　文　献
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23第 9期　　　　　　　　　　　鲁绍伟等:华北土石山区油松 -元宝枫混交林的结构与功能