全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2011，27(1) :62 ～ 65
樊金娟，王 平，刘长远，等． 应用巢式 PCR检测葡萄根癌病菌［J］．江苏农业学报，2011，27(1) :62-65．
应用巢式 PCR检测葡萄根癌病菌
樊金娟1，2， 王 平1， 刘长远2， 赵奎华2， 邢荆涛3
(1．沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110161;2．辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁 沈阳 110161;3．河北
省保定市唐县第一中学，河北 保定 072350)
收稿日期:2010-04-12
基金项目:国家农业科技成果转化基金项目(2008GB2B000060) ;辽
宁省农业科学院博士后工作站研究项目
作者简介:樊金娟(1972-) ，女，辽宁宽甸人，博士，副教授，主要从事
植物分子生物学研究。(E-mail)jinjuanf@ sohu． com
通讯作者:赵奎华，(E-mail)zkhua55@ sina． com
摘要: 为建立葡萄根癌病菌的分子检测方法，应用细菌核糖体基因间隔片段(16S ～ 23S ribosomal DNA inter-
genic spacer，ITS)通用扩增引物 1405f /456r和葡萄根癌病菌 ITS特异引物fI / rI，采用巢式 PCR(Nested-PCR)技术对
2株葡萄根癌病菌［即葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis) ］和 10 株非葡萄根癌病菌进行扩增，并且对接种葡萄根癌
病菌的葡萄植株进行检测。结果表明，仅有葡萄根癌病菌能扩增出 1 条长度为 607 bp的片段;巢式 PCR检测方法
可从接种 15 d后的葡萄植株中特异性检测出病原菌，而病症的出现需要30 ～ 35 d的时间。说明该研究建立的巢式
PCR方法可用于快速检测葡萄根癌病菌。
关键词: 细菌核糖体基因间隔序列;葡萄根癌病菌;巢式 PCR;分子检测
中图分类号: S436． 631． 1 + 6 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2011)01-0062-04
Detection of Agrobacterium vitis by nested-PCR
FAN Jin-juan1，2， WANG Ping1， LIU Chang-yuan2， ZHAO Kui-hua2， XING Jing-tao3
(1． College of Biological Science ＆ Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China;2． Institute of Plant Protection，Liaoning A-
cademy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China;3． No． 1 Middle School of Tangxian，Baoding 072350，China)
Abstract: Agrobacterium vitis，which causes crown gall，was detected by nested-PCR using primer pairs 1405f /
456r and fI / rI． A band of 607 bp was amplified from two Agrobacterium vitis strains but not from other 10 non-Agrobacteri-
um vitis strains． The pathogenic bacteria could be detected by nested-PCR technique from inoculated individuals at day 15，
while symptoms could be observed at about day 35． The results of field detection also recommended that nested-PCR tech-
nique could be used in quickly earlier detection of crown gall．
Key words: intergenic spacer(ITS) ;Agrobacterium vitis;nested-PCR;molecular detection
葡萄根癌病是由葡萄土壤杆菌(Agrobacterium
vitis，原 A． tumefaciens，biotype Ⅲ )致病菌株引起的
土传细菌性病害［1］。伤口是病原菌侵染的唯一途
径，病菌从侵入到显瘤需数周到一年，多为 2 ～ 3 个
月。而寄主细胞变成瘤细胞后，没有病菌时仍能继
续扩展。葡萄根癌病是世界性的重要病害，在中国
东北、华北、西北、黄河及长江流域的许多省市区都
常有发生，阻碍了葡萄产业的发展。
检疫是防止葡萄根癌病传播蔓延的第一道防
线。许多国家一直采用检疫苗木的方法，并已研究
出一些检测手段和技术，如血清取样法［2］、水-排量
方法［3］、滑动凝集试验［4］、单克隆抗体［5］等方法。
但传统方法存在着操作复杂、检测周期过长、灵敏度
低的缺点。因此，非常有必要建立一种简单快速准
确的诊断方法来检测葡萄根癌病菌。巢式 PCR 是
指利用 2 套 PCR 引物对进行 2 轮 PCR 扩增反应。
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在第 1 轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物
在内引物的存在下进行第 2 轮扩增。由于巢式 PCR
反应有 2 次 PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点
的可能性，增加了检测的敏感性;而且 2 对 PCR 引
物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。
本研究应用细菌核糖体基因间隔片段(ITS)通
用扩增引物 1405f /456r和葡萄根癌病菌 ITS特异引
物 fI / rI，采用巢式 PCR 技术检测葡萄根癌病菌，为
葡萄根癌病的早期诊断和进出口检疫提供科学依据
和方法。
1 材料与方法
1． 1 菌株和试剂
葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)、埃希式大
肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphy-
loccocus aureus)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae
pv． lachrymans)和甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas
campestris pv． campestris)等菌株由沈阳农业大学生
物科学技术学院实验室保存。葡萄土壤杆菌阳性
菌株由中国农业科学院植物保护研究所赵庭昌研
究员提供。PCR试剂购自凯基生物科技发展有限
公司。
1． 2 接种方法
取植株大小基本一致、健康状况良好的葡萄品种
京亚，将其分成 2组。试验组以针刺法接种葡萄土壤
杆菌悬浮液(1 ml 1 ×108个) ，对照组接种清水。
1． 3 葡萄土壤杆菌病菌 ITS扩增
参照细菌 ITS 扩增通用引物［6］，扩增菌株的
rDNA 16S ～ 23S ITS。引物为 1405f(5-TGYACA-
CACCGCCCGT-3)和 456r(5-CCTTTCCCTCACGG-
TACTG-3)。将所得序列与 GenBank 中已提交的序
列进行对比，根据同源比对结果，选取葡萄根癌病菌
特异区段使用 Oligo 6． 0 软件设计 1 对葡萄土壤杆
菌特异扩增引物，并对该引物进行 PCR 扩增检测。
检测结果切胶回收、测序，并与原序列同源比对，确
认扩增的准确性。
1． 4 葡萄土壤杆菌病菌巢式 PCR检测
1． 4． 1 PCR 引物 采用巢式 PCR，所用引物为内
外引物对。外引物对为细菌 ITS 扩增通用引物
1405f /456r，内引物对为葡萄土壤杆菌特异扩增引
物 fI / rI。
1． 4． 2 PCR反应体系 采用巢式 PCR 反应体系，
体系 1:10 × PCR buffer 2. 5 μl，模板 DNA 1 μl ，25
mmol /L Mg2 + 2 μl，1405f、456r (10 μmol /L)各 0. 5
μl，Taq DNA聚合酶(2. 5 U /μl)0. 25 μl，dNTPs 0. 5
μl，加灭菌 ddH2 O 至终体积 25 μl。在 BIO-RAD
PTC-200TM 热循环仪中进行:94 ℃预变性 5 min;94
℃变性 1 min，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，20
个循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保温。
体系 2:模板为体系 1 的 PCR 产物 1 μl，引物
fI、rI各 1 μl，其余成分同体系 1。热循环仪中进行:
94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 45
s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;72 ℃延伸 10 min，4
℃保温。最终的巢式 PCR产物用 1． 5%的琼脂糖电
泳进行分离。
1． 5 田间检测
取田间未发现和已发现病症的葡萄茎，剪成 1
cm左右的小段，PBS缓冲液浸泡 2 h，12 000 r /min离
心 5 min，取离心液，利用建立的 PCR反应体系检测。
2 结 果
2． 1 葡萄根癌病菌 ITS特异性扩增
利用细菌 ITS通用引物 1405f /456r对葡萄根癌
病菌(葡萄土壤杆菌阳性菌株)进行 ITS 扩增，获得
长为1 673 bp 的序列。序列提交 GenBank 进行同源
性比对，结果显示，该序列与已公布的葡萄根癌病菌
ITS序列一致。根据比对结果和特异区段设计 1 对
葡萄土壤杆菌特异扩增引物，fI / rI :5-ATGATGC-
CATCGACGTGTT-3 /5-GTTGCCGAGCTGAAGGTT-
TAC-3，预期扩增片段大小为 607 bp。用该引物进
行 PCR扩增检测，在 600 bp 位置出现 1 条扩增条
带，与预期扩增片段大小相符(图 1)。对条带切胶
回收测序，结果显示与目的扩增片段一致。
2． 2 PCR检测的特异性
利用细菌通用扩增引物 1405f /456r 和葡萄根
癌病菌 ITS 特异引物 fI / rI 对 2 株葡萄根癌病菌及
10 株非葡萄根癌病菌进行巢氏 PCR 扩增，结果表
明，只有葡萄根癌病菌能扩增出 1 条长度为 607 bp
的片段，而对照细菌均没有扩增带(图 2) ，说明所采
用的引物具有很好的特异性。
2． 3 接种葡萄根癌病菌的葡萄植株 PCR检测
分别从感病品种京亚接种组和对照组中取处理
时间为1d、5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d、40d
36樊金娟等:应用巢式 PCR检测葡萄根癌病菌
1 ～ 2:引物 1405f /456r 扩增结果;M:DNA marker DL2000;3 ～ 4:
引物 fI / rI扩增结果。
图 1 引物 1405f /456r 和 fI /rI 对葡萄根癌病菌 DNA 的 PCR
扩增结果
Fig． 1 PCR of Agrobacterium vitis using primers 1405f /456r
and fI /rI
的样本，以其葡萄茎的 PBS 提取液为模板进行 PCR
扩增。结果表明:未接种的植株和接种 1 d、5 d、10
d的植株没有扩增条带，接种 15 d 后的葡萄植株均
能扩增出 607 bp的清晰片段(图 3) ，接种30 ～ 35 d
葡萄植株上能观测到瘤状物。说明巢式 PCR 可以
在症状出现前 15 ～ 20 d 检测到侵入的病原菌。
2． 4 田间检测
取田间未发现和已发现病症的葡萄茎，利用建
立的 PCR反应体系进行检测。结果表明，肉眼可见
病症的葡萄茎 PBS 提取液均可扩增出 607 bp 的条
带，未见病症的 PBS提取液，6 株中除 2 株外其余都
未出现任何条带(图 4)。对检测的植株进行跟踪
观察，未发现病症却出现特异条带的植株1个月后出
M:DNA marker DL2000;1:葡萄土壤杆菌阳性菌株;2:葡萄土壤杆菌;3:大肠杆菌;4:金黄色葡萄球菌;5:根癌农杆菌;6:黄瓜细菌性角斑病
菌;7:甘蓝黑腐病菌;8:奇异变形菌;9:粪链球菌;10:单增李斯特菌;11:迟缓爱德华菌;12:蜡样芽孢杆菌。
图 2 2 株葡萄根癌病菌和 10 株非葡萄根癌病菌的 Nested-PCR扩增结果
Fig． 2 Nested-PCR of two Agrobacterium vitis strains and 10 non-Agrobacterium vitis strains
M:DNA marker DL2000;1 ～ 9:分别为接种后 40 d、35 d、30 d、25 d、20 d、15 d、10 d、5 d、1 d的植株;10:未接种对照。
图 3 接种葡萄根癌病菌后葡萄植株的巢式 PCR检测结果
Fig． 3 Nested-PCR products obtained from grape plants inoculated with Agrobacterium vitis
现冠瘿瘤，没有扩增出特异条带的植株也一直没有 观察到冠瘿瘤的发生。说明巢氏 PCR 引物能够准
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确地对已表现病症的病原菌和潜伏期的病原菌进行 特异性检测。
M:DNA marker DL2000;1 ～ 7:表现病症的样本;8 ～ 13:未表现病症的样本。
图 4 引物 1405f /456r和 fI /rI对田间葡萄样本根癌病菌的检测结果
Fig． 4 Detection of Agrobacterium vitis of grape samples in field using primers 1405f /456r and fI /rI
3 讨 论
随着葡萄产业的发展和葡萄苗木的频繁调运，
葡萄根癌病呈迅速蔓延扩展趋势，危害日益严重，已
成为阻碍葡萄生产发展的主要因素之一。提高对葡
萄接穗和砧木母株及苗木的准确检测是有效控制该
病的重要手段，尤其是在大面积普查时。核糖体基
因间隔序列(ITS)在进化过程中承受的自然选择压
力非常小，因而有一定程度的特异性，根据病原菌核
糖体 ITS区段的特异性检测病原菌已成为研究热
点。本研究以葡萄根癌病菌 ITS 为对象，建立了巢
式 PCR 检测病原菌技术，提高了检测的特异性，对
病原菌的检测灵敏度比单一 PCR高，克服了从发病
植物的典型病症上分离病原菌费时(3 ～ 4 d)且漏检
率高的缺点，成功地用于田间病害检测，为有效防止
该病的传播和扩散提供了保障。
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