全 文 ：葎草内生真菌 SS3 的分离与鉴定
张慧茹 李 帅 赵红月 刘来亭
张慧茹，河南工业大学生物工程学院，副教授，450001，河
南工业大学莲花街校区 322信箱。
李帅、赵红月、刘来亭，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2011-10-14
摘 要：植物内生菌是产生新型抗生素的微生物资源。试验欲从中草药葎草中分离具有抗致病菌
的内生真菌，为防治畜禽疾病提供新型抗菌药物的微生物来源。试试从葎草中分离出 21株内生真菌，
通过平板对峙试验筛选出 SS3具有良好的抗菌活性。对该内生真菌进行形态学和分子生物学鉴定。结
果表明：内生真菌 SS3具有镰刀菌属的表型特征，经过 rDNA的 ITS序列（GenBank登录号：JF262912）
分析，该菌与镰刀菌属的同源性达到了 99%。本试验首次分离药用植物葎草的内生真菌，其中具有抗
菌特性的内生真菌 SS3经形态学和分子学鉴定，其属于子囊菌亚门 [Amon Ascomycetes]、镰刀菌属
[Fusarium]。
关键词：葎草内生真菌；抗致病菌；鉴定
中图分类号：S811.6 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2012）01-0026-03
植物内生真菌能产生大量具有生物活性的次级
代谢产物，特别是药用植物内生真菌可以产生与宿主
植物相同或相近的药性成分，是新的天然产物类药物
的重要来源[1-2]，因此，植物内生真菌成为微生物资源
开发的一个热点。
葎草属于桑科植物，可以全草入药，种子中含有
多种酮类物质，具有良好的抗菌消炎效果，可以用来
治疗皮肤瘙痒、水肿以及常见炎症；其叶子中含有多
糖，具有抗氧化、清除自由基、抗衰老的作用。已有许
多对于葎草的研究[3-5]，但尚无从葎草中分离抗致病菌
的内生菌的研究，因此，本研究旨在从葎草中分离具
有抗致病菌作用的内生真菌，为进一步开发以及在饲
料中充分利用葎草提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
葎草：采自郑州高新技术开发区东史马村和河南
工业大学校园内，挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜
袋包装，送实验室备用。
致病菌：鸡大肠杆菌（Escherichia coli., O78），菌
株编号：CVCC1490；鸡金黄色葡萄球菌（Staphylocco－
cus aureus），菌株编号：CVCC2241。
1.2 试验方法
1.2.1 内生菌的分离
将采集的葎草全草用自来水冲洗干净，置无菌操
作台中紫外灯照射 5 min后晾干。用 75%酒精进行全
草消毒 1 min，将葎草剪成根、茎、叶各组织块，不同组
织升汞消毒时间分别为：根 65 s、茎 50 s、叶 35 s。再用
无菌水冲洗干净，将上述组织块剪成 0.5 cm×0.5 cm
大小，置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 ℃
恒温培养箱中培养约 5~7 d，待内生菌长出后，挑取单
个菌落进行纯化，PDA培养基斜面保菌。
1.2.2 表面消毒效果的检测
分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于
营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、
叶各组织贴压在 PDA培养基平板内；在超净工作台
内放置一敞开的 PDA平板。将上述 3种对照平板置
于 28 ℃恒温培养箱内培养 7 d，用于检查表面灭菌效
果。若没有菌落出现，说明植物表面菌被彻底消毒，所
生长的菌为植物内生菌。
1.2.3 抗致病菌的内生真菌的筛选
通过平板对峙抑菌试验筛选具有抑制致病菌作
用的葎草内生真菌。分别将致病性大肠杆菌和葡萄球
菌活化，配制致病菌浓度约为 106 CFU/ml的菌悬液，
取 100 μl涂布于营养琼脂平板上。用直径为 0.7 cm的
打孔器自生长旺盛的葎草内生菌菌落上打孔，挑取带
菌丝的菌饼贴放到涂布过致病菌的营养琼脂平板上，
37 ℃培养 24 h，观察内生真菌对两类致病菌的抑制
情况。每个内生真菌菌落至少挑取 3个菌饼。抑菌圈直
径采用游标卡尺测量，抑菌直径为 3个菌饼的平均数。
1.2.4 形态学鉴定
将 PDA培养基滴于消毒的载玻片上，冷却后接
种葎草内生菌，盖上盖玻片，置于培养皿中，28 ℃恒温
《饲料工业》·2012年第 33卷第 1期试 验 研 究
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培养约 10 d，显微镜下观察菌丝和孢子形态，并照相。
1.2.5 分子生物学鉴定
PCR引物：由上海生物工程技术服务有限公司合
成的通用引物 ITS4、ITS5扩增真菌 rDNA片段。ITS4：
5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。ITS5：5′-GGAAG－
TAAAAGTCGTAACAAGG-3′。
采用 CTAB法提取葎草内生真菌的总 DNA，将其
作为模板，利用 ITS通用引物扩增 SS3的 rDNA片段。
通过经典 PCR试验扩增，PCR扩增程序为：94 ℃预变
性 3 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸
3 min，循环 30 次，在相同温度下延伸 10 min，最后
4 ℃保温。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的目的片
段，并将条带回收，送与上海生工测序，将所得序列提
交 GenBank获得序列号。用 BLAST比对分析，采用
Clustalx1.83软件进行序列分析并构建系统发育树，以
确定其种属地位。
2 结果与分析
2.1 葎草内生真菌的分离
经表面消毒效果检测，冲洗的无菌水、组织印迹
培养及环境培养基均无菌生长，证明表面消毒彻底，
植物切口培养的菌落为内生菌。从新鲜的葎草中共获
得 21株内生真菌，命名为 SS1~SS21。
2.2 抗致病菌的内生真菌的筛选
通过平板对峙抑菌试验，发现 SS3对大肠杆菌和
金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制效果，对大肠杆菌
的抑菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径分别为 26 mm和
19 mm。
A
B
图 1 内生真菌 SS3对大肠杆菌(A)和金黄色
葡萄球菌(B)的抑菌效果
2.3 SS3的形态学观察
菌落形态：表面蓬松如絮状，气生菌丝生长旺盛，
单菌落直径约为 4.7 cm，呈同心圆状生长，反面无色，
质地均匀，如图 2所示。
A
B
注：A 正面；B 反面。
图 2 内生真菌 SS3的菌落形态
菌丝和孢子形态：菌丝细长，分生茂密；菌丝顶端
有簇状孢子，孢子椭圆形，粒感明显，周围亦有散落的
孢子，如图 3所示。
A
B
注：A为扩大 40 倍；B 为扩大 100 倍。
图 3 葎草内生真菌 SS3的孢子形态
根据 SS3菌落形态、菌丝和孢子着生状态，通过
查阅《真菌鉴定手册》[6]，将其归属于子囊菌亚门[Amon
Ascomycetes]、镰刀菌属[Fusarium]。
张慧茹等：葎草内生真菌 SS3的分离与鉴定 试 验 研 究
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2.4 SS3的分子鉴定
通过提取 SS3的总 DNA，以设计的引物扩增出 SS3
的 rDNA的 ITS序列，大小为 547 bp，提交 GenBank，
获得序列号为 JF262912。
使用 BLAST 程序比对于 Genebank 中同源性在
95%以上的真菌序列，应用 Clustalx1.83软件，用邻位
相连法（Neighbor-Joining）绘制葎草内生真菌 SS3 的
系统发育树，结果如图 4所示。
0.006
图 4 葎草内生真菌 SS3的系统发育树
由系统发育树可以看出：菌株 SS3的 ITS序列与
镰刀菌的序列相似度达到了 99%，结合形态学鉴定结
果，最终确定葎草内生真菌 SS3为子囊菌亚门[Amon
Ascomycetes]、镰刀菌属[Fusarium]。
3 讨论
目前，国内外尚未发现有关葎草内生菌的报道。
该试验首次从葎草中共分离出 21株内生真菌，其中，
SS3菌株具有良好的抑菌活性，具有潜在的应用价
值。因此，对 SS3菌株进行形态学和分子生物学鉴定。
经形态学和分子学鉴定均将其归属为子囊菌亚门
[Amon Ascomycetes]、镰刀菌属[Fusarium]，这一结果填
补了葎草内生真菌研究方面的空白，增强了葎草的实
用价值。
表面消毒是内生菌分离的重要环节[7-9]。以下两种
情况可能引起杂菌污染：植物组织表面灭菌不完全和
超净工作台内含菌。针对以上问题，试验中采用设立
三种检测方法进行检验：最后一次漂洗液无菌检验对
照；组织印迹无菌检测对照；超净工作台无菌状态对
照检测，在三者均无菌生长的情况下，证实试验中分
离的菌为内生菌。
传统真菌分类方法是根据真菌形态学及其主要
的生理生化特征而建立的，包括培养特征、菌丝形态、
产孢结构以及孢子形态微观形态特征等。这种分类方
法存在一定的缺陷，有些微生物基因型相同，但不同
的个体、在不同的环境下发育，表型可能会出现一定
的差异，导致形态学分类的误差。随着分子生物学技
术日益发展和成熟，在微生物分类鉴定方面采用核糖
体 rRNA中 ITS保守序列进行分析和比对[10-11]，这在一
定程度上避免了形态学分类的误差，GenBank中庞大
的比对数据库，提高了分子生物学鉴定的分辨能力，
使其在真菌分类鉴定领域得到了广泛应用。
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（编辑：王 芳，xfang2005@163.com）
试 验 研 究 张慧茹等：葎草内生真菌 SS3的分离与鉴定
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