全 文 ：第 7卷 第 6期
4年 1 2月
林 业 科 学 研 究
F O R E S T R E S EA R C H
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7
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6
【笼 e . , 1 9 9 4
毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究 ’
顾小 平 吴晓丽
摘要 对毛竹和浙江淡竹利用 N Z 回充法测定根系固氮活性 , 分别可达 9 . 9 和 2 . 1 pm o1 C : H . /
( g 干根 · h) ;用半固体培养基富集后的根系固氮活性范围在 20 ~ 10 n m ol c Z H . / ( g 鲜根 · h) 的占
4 0% 以上 。 对浙江淡竹根际各部位固氮菌数采用乙炔还原一M P N 法计测结果是根际土壤 3 . 4 又 1 05
菌数 / g 干土 ;根表 、 根内分别为 2 . 2 义 1 0 5 、 3 . o x l 少 菌数 / g 干根 。 采用划线法在浙江淡竹根际分离
到 3 株具较高活性的固氮菌 , 经鉴定 G 一 4 属肺炎克雷伯氏菌 。 G 一 7 和 G 一 12 菌的形态和培养特征相
同 , 目前尚未确定种属 。 对 G 一 4 和 G 一 7 的固氮特性研究表明 : 培养 18 ~ 24 h 后 固氮酶活性最高 ;从
p H 4
.
5一 9 . 2 固氮酶活性都很高 , 最适值分别为 6 . 5 和 7 . 5 左右 ; 培养温度以 30 ℃ 为最适 ;均可利
用多种碳源 固氮 。
关链词 毛竹 、 浙江淡竹 、 联合固氮菌 、 固氮酶活性 、 肠杆菌科
自从 70 年代 D 6 be er ine r 报道了含脂刚螺菌 ( SP i lr’ lu m il 户ofe ur m )与玉米根系具有联合
固氮作用以来 , 引起 了国内外学者的广泛注意 。 目前 已先后从玉米 、 小麦 、 高梁 、 甘蔗 、 水稻和牧
草等多种禾本科作物根系分离出一些固氮微生物 , 因此人们认为禾本科植物具有和一些微生
物联合固氮的习性 。 并对禾本科作物的联合固氮进行了大量的研究 〔’ 一 ` 〕 。
竹类 植物是我国南方重要森林资源 , 种类多 、 分布广 、 面积大 , 在分类学上也归属于禾本
科 。 然而它是否和其它禾本科作物一样也存在根际联合固氮作用呢 ? 至今还未见有报道 。 本
文通过对 毛竹 ( p 勺 l l o s ta c勺 5 P u b e s c e n s M a z e l e x H . d e L e h a ie )和浙江淡竹 ( p h . m卿 e ir M e -
C l a er )根系固氮活性的测定 , 对浙江淡竹的根际土壤 、 根表和根 内各部位联合固氮菌的计数和
固氮细菌的分离鉴定 ,首次发现竹类植物根际也存在着联合固氮体系 。
1 材料和方法
L l 根系固氮酶活性测定
1
.
1
.
1 材料 为毛竹和浙江淡竹的根系 。 毛竹生长在本所山地红壤 ,浙江淡竹生长在富春江
边沙土地上 。
1
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1
.
2 培养基 采用修改的 D o b er ie en r 无氮培养基 , 每升含苹果酸 、 蔗糖 、 葡萄糖各 5 9 , 其
中 : 半固体培养基含琼脂 0 . 2 % , 固体培养基 含琼脂 2 % 。
1
.
1
.
3 浏定方法 用 N Z 回充法和半固体培养基富集法处理 s[] ,在气相色谱仪上利用乙快还
原法测定固氮酶活性 。
1
.
2 根际不同部位稀释液制备 ,固氮菌计数
1 9 9 4一 0 2一 25 收稿 。
顾小平助理研究员 , 吴晓丽 (中国林业科学研究院亚热带林业研究所 浙江富阳 31 1 40 0)
, 本文为中国林科院亚热带林 业研究所 1 9 91 青年科研基金资助课题内容 。
6期 顾小平等 :毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究
1
.
2
.
1根际土攘稀释液的制备 从浙江淡竹竹株基部顺竹莞连土挖取竹根 , 除去根表浮土 ,
选带土健壮竹根剪成 1 ~ 2 。 m 根段 , 放入盛有 45 m L 无菌水并预先称重的三角瓶 中轻轻振
动 ,洗下泥土 ,拣出根段 ,泥土定量至 5 9 ,然后逐级稀释至 1 0一 日。
1
.
2
.
2 根表 菌稀释液的制备 将洗去表面泥土的根剪成 1一 2 c m , 用无菌水冲洗数次 ,滤纸
吸干后称取 5 9 , 投入含 45 m L 无菌水的三角瓶中 ,振荡 10 m in , 取出根段 , 然后逐级稀释至
1 0一 8 。
1
.
2
.
3 根内菌稀释液的制备 对除去根表细菌的 5 9 根样 ,用无菌水冲洗数次 , 滤纸吸干后 ,
放入 75 写酒精中灭菌 5 m in ,再用无菌水冲洗数次 ,滤纸吸干 , 放入无菌研钵中研磨 , 根渣转入
45 m L 无菌水中 ,然后逐级稀释至
.
2
.
4 根际各部位固氮菌计数
1 0 一 8 。
采用乙炔还原一 M P N 法 。 即取上述各部位不同级别的稀释
液 0 . 1 m L , 接种于装有 2 m L 半固体培养基的青霉素小瓶中 , 32 ` C 培养 24 h 后 , 加入 0 . 8 m L
乙炔反应 3 h , 测乙炔还原活性 , 3 次重复 , 乙炔还原活性大于 1 n m ol C ZH 4 (/ 瓶 · h) 者记为阳
性 , M p N 法计数 [ “ ] 。
1
.
3 固氮菌株的分离鉴定
菌株分离 :取上述测定乙炔还原活性高的一级青霉素小瓶 , 用接种环取一环菌在固体平板
上划线 ,纯化后分离 。
菌株鉴定 : 主要依据参考文献〔7一 9〕、 1) 进行鉴定 。
生理生化特征 , 采用浙江省军区后勤部卫生防疫检验所生产的生化微量管进行 。
1
.
4 不同条件下菌株固氮能力测定
几种条件下菌株固氮能力测定是以修改的 D ob e r e in e r 无氮半固体培养基为基础 。 不同
p H 条件下的培养基是以 l / 1 5 M K H ZP O 。 和 1 / 1 5 M N a ZH P O ; · ZH : O 所配制的不同 p H 缓冲
液加入到前述培养基中配制而成 ; 不同碳源的培养基是 以该种碳源取代原培养基配方 中的碳
源配制而成 。 接种菌用培养时间在 24 h 内的幼龄菌 , 除注明反应时间外 , 所有测定均是在 32
℃培养 18 h ,反应 3 h 的条件下利用气相色谱仪测定 。
2 结果与讨论
.2 1 竹子根系的固氮酶活性
以 N Z 回充法测定的两种竹子根系固氮酶活性见表 1 。 测定时大于 1 n m ol C Z H ` / ( g 干根 ·
h ) 的样品记为有固氮酶活的样品 。 毛竹 16 个样品中最高达 3 . 87 n m ol C ZH ; / ( g 干根 · h ) ,
有酶活的占 50 % 。 同时毛竹根系
不经减压和回充 N : 也可以测 出
固氮活性 。 另外 , 测定的毛竹根系
因采 自粘重的红壤 , 根系表面有
一紧粘根表的薄土层 , 需长时间
冲洗才能洗掉 。 带着这一薄层测
表 l 氮气回充法测定的两种竹子根系固氮酶活性
竹 种 样品数
(个 )
有 固氮酶
活的样品
(个 )
占总数
(% )
最高 比活性
[
n m o l C ZH
4
/
( g 干根 · h ) j
毛 竹 16 8 5 0 3 . 8 7
浙江淡竹 16 7 4 3 . 8 2 . 1
l) 浙江省军区后勤部卫生防疫检验所 ,肠杆菌科细菌生化鉴定编码 册 .
林 业 科 学 研 究 7卷
定 ,其固氮活性可达到 9 . 9 n m ol C ZH 4 / ( g 干根 · h ) ,作者认为 : 这一薄层是毛竹根系分泌物和
土的胶合层 ,其中含有许多有机碳源和其它营养成份 ,这是微生物较活跃的场所 。 浙江淡竹因
生长在沙土上 ,这种胶合层不明显 ,水冲洗后 , 用 N : 回充法测定其固氮活性较低 。
以半固体培养基富集法测定的两种竹子根系的固氮酶活见表 2 。 从表 2 看出毛竹 、 浙江淡
竹根系经富集培养后 ,绝大多数都能测出固氮活性 , 近一半在 20 一 1 0 n m ol C ZH ; / (g 鲜根 ·
h) 范围内 。 另外 ,在富集培养前如用 75 %酒精灭菌 5 5 后 ,再用 0 . 1 %升汞灭菌 5 m in ,则几乎
测不出固氮活性 。
表 2 富集法测定两种竹子根系的固氮酶活性
竹 种 有酶活数(个 )
固氮活性 [ n m o l C Z H ` / ( g 鲜根 · h ) ]
< 10
(个 ) 汽 汽 2 0 ~ 1 0 0(个 ) ) 1 0 0(个 )
,自OU1,目,口`任J任`11C乙,白11
样%一29
`
:
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0叮`11,`
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亡JOqóO口亡J,口左且,曰毛 竹
浙江淡竹 :;
2
.
2 浙江淡竹根际固氮微生物计数
在对浙江淡竹根际土壤 、 根表及根内各部位的固氮菌数采用乙炔还原一M P N 法进行计
数结果是 , 根际土壤为 3 . 4 x 1 s0 菌数 / g 干土 ;根表 、 根 内分别是 2 . 2 X 1 s0 、 3 . 0 X 10 ` 菌数 / g 干
根 。 根表大于根 内近一个数量级 。
2
.
3 浙江淡竹根际固氮微生物的分离鉴定
2
.
3
.
1 菌株的 来源及其固氮酶活性 对上述采用乙炔还原一M P N 法测固氮菌数的一级青
霉素瓶中经培养基富集后的稀释菌液 ,选活性高的 , 采用划线法进行分离 , 结果得到 3 株菌具
较高的固氮活性 ,它们分别是 自根表分离的 G 一 4 、 G 一 7 ; 自根际土分离的 G 一 1 2 。 其活性均超过了
1 0 0 n m ol C
Z
H
;
/ (瓶 · h ) , 与前人在小麦根系分离的固氮微生物活性相似 l[ “ 〕 。
2
.
3
.
2 菌株的形 态及培养特征 因 G 一 7 和 G 一 12 菌体和菌落形态完全一致 ,故本实验 只对 G -
4 和 G 一 7 菌进行分析鉴定 。 两株菌的主要区别见表 3 。
表 3 两株菌的形态及培养特征
测定项 目 G 一 4 号 菌 G 一 7 号 菌
革兰氏染色
细胞形态
细胞排列
细胞大小
鞭 毛
英 膜
菌落形态
菌落颜色
菌落粘性
阴性
短秆到卵 圆
单个或短链
0
.
7 ~ 0
.
9 X 1
.
0 ~ 2
.
0
无
有
不规 则 、 凸 ,边缘半透明 , 中心质浓
肉色
粘液状 ,用接种针挑拉不成丝
阴性
短秆到卵圆
单个或短链
0
.
8~ 0
.
g X I
.
l ~ 2
.
0
周生
有
圆形有光泽和弹性 . 凸 , 边缘半透 明 ,中心质浓
肉色
粘液状 ,用接种针挑可拉成长丝
2
.
3
.
3 菌株的生理生化特性 G 一 4 和 G 一 7 菌的生理生化特征见表 4 。
2
.
3
.
4 菌株 的鉴定 根据 G 一 4 和 G 一 7 菌革兰 氏染色阴性 、 氧化酶阴性 、 发酵葡萄糖产酸产
气 、 不形成芽抱的特性 , 可初步确定为肠杆菌科 ( E nt e or b a c t e ir ac e ae )细菌 , 再进一步利用《肠
杆菌科细菌生化编码册 》和其它参考资料 , 鉴定 G 一 4 号菌为肺炎克雷伯氏菌 ( K lc bs ic la P n eu -
6 期 顾小平等 :毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究
m onia ` )
。
G
一
7 菌在形态 、 培养特征及生化特性上与 G 一 4 菌存在一定的差异 ,利用上述生化编码
册 没能确定种名 , 由于其 V P 反应 为阴性不属于肠细菌属 ( E nt e or b ac t er ) , 其形态也不同于
A z o s P i ir l u m的螺旋状 ,可能属欧文氏菌属 ( E~ i n山 ) , 尚待进一步鉴定 。
表 4 两株菌的生理生化特性
PV
硝酸盐还氛 原化钾侧 木糖胶金盏衣醇山梨酸棉子糖鸟氨酸脱酶赖氨酸脱酶力动产气
拘椽
素酸盐
甲红基靛基醇
糖酸盐葡萄化氧苯丙氨酸脱酶
硫化氢氧 接触酶化酶
糖氧葡萄化发酵
菌种
发酵
产酸
发酵
产酸
+ + + + +
+ 一 + + + + + + + + + +
\ .一入\ \、G/一
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/打仔产ú ]
初加0即60一(上·婆à\ ,工氏,é一。已`ì
3 6 4 8
时 ! ld ( h )
6 0 7 2
0勺J仔心`荤华泛袋互
2
.
4 菌株在不同培养条件下的固氮特性
2
.
4
.
1 不 同培 养时间下 两菌株 固氮酶活性 变
化 从图 1 可以看出培养时间对两菌株固氮酶
活性有很大的影响 。 s h 培养均未测到固氮活
性 。 经 18 一 24 h 培 养后测定 的固氮酶活性最
高 。 G 一 7 菌在 18 h 后 , G 一 4 菌在 24 h 后固氮活
性开始下降 。 然而两株菌经 3 d 培养 ,仍能测到
一定 的固氮活性 。 另外 , 可以看到在此培养条件
下 , G 一 7 菌比 G 一 4 菌固氮活性要高 。
图 l 不同培养时间对苗株固氮酶活力 影响
2
.
4
.
2 不 同 p H 条件下 两菌株 固氮酶活性 变
化 从 图 2 看出两株菌在较高和较低的 p H 条
件下均 有较强的固氮酶活性 ,但似乎在碱性条
件下的固氮活性 比酸性条件下更高 。 最适 p H
G
一
7 菌大致在 7 . 5 左右 , G 一 4 菌大致在 6 . 5 , 但
汉\一
。八协/一
、卜多一. 一 一一一一
40523ǐǎ二·宾à\ 甲工酬奋10产仁u
一干山二逆城互
4 5 5
.
0 6
.
0 7 0 8
.
0 9
.
0
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图 2 不同 p H条件对菌株固 氮活性的影响
一 夕0 0卫
16 0
,
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士匕
飞 1 2 0
00Oé 月件
一工él气à尸t三一干定遨减三
不太 明显 。 两株菌相对来说更适于在碱性条件
下固氮 , 这可能和两株菌均为发酵产 酸型细菌
有关 。
2
.
4
.
3 不 同温度对两株 菌固氮酶活性 的影响
从图 3 可以看出 ,两株菌的固氮酶活性均是
温度 ( C )
图 3 不同温度条件对菌株固氮活性的影响
林 业 科 学 研 究 7卷
在 3 o C左右的温度下最高 , 37 C 仍有较高的固氮活性 ,低于 1 7 C 和高于 40 C 时 , 固氮活性
趋近于 O。
2
.
4
.
4 不 同碳源对 两株菌固氮酶活性的影响 从表 5 可以看出 ,两株菌对 6 种碳源的利用均
是以甘露醇最好 ,而对其它碳源 ,两菌株喜好程度各不相同 ,唯有淀粉不能被 G 一 4 菌利用 。
表 5
菌 号 葡萄糖
3 7
.
0 3 3 8
6 4
.
5 3 2 4
不同碳源对两株菌固氮活性的影响
糖 麦芽糖 甘露醇
G
一
4
G
一
7
1 2
.
6 4 3 0
7 9
.
1 7 6 9
1 4
.
3 1 9 3
2
.
8 8 5 8
5 7
.
2 9 8 5
1 17
.
16 1 5
[单位 : n m o l C Z H 。 (瓶 · h )〕
苹果酸 淀 粉
44
.
13 8 8 0
36
.
10 2 6 2 1
.
1 22 3
3 结 语
竹林在我国是集约经营程度较高的森林生态系统 , 为使竹林保持较高的生产力 , 以往在经
营活动中都是通过施肥来维持地力 。 但就我国国情来看 ,在山区对大面积竹林施用化学 N 肥 ,
无论从成本 、 化肥的供应状况以及对环境保护方面看都是不现实的 。 由于生物固氮是使大气中
氮素向森林生态系统中输 入的一个重要途径 , 因此 , 随着集约农业的发展 , 人们已开始重视对
生物固氮的研究 , 以期通过建立高效的生物 固氮体系 , 实现生物 自我营养的目的 。
本文首次提出竹类植物根际存在着联合固氮体系以及从竹类植物根际分离到两株具较高
活性的固氮菌 , 为今后开展竹类植物 固氮领域的研究及其利用带来了希望 。此外 ,研究发现 ,联
合固氮菌种类及固氮活性一方面取决于植物种类 , 另一方面也决定于所使用的培养基 。改进培
养基是进一步发现联合固氮能力强的竹类植物和利用价值高的固氮微生物的重要途径 。
参 考 文 献
2 Y o s h ld a T
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N
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15 8
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6 期 顾小平等 :毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究 6 2 3
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.
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.
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,
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P h l l o s t ar c hy
s m 卿e r i , a s s o e i a t i v e d ia z o t r o P h s , N Z一 f i x -
a t i o n e n z y m e a e t i v i t y
,
E n t e r o b a e r e r i a e e a
G u X i a o p in g
,
A s s i s t a n r P r o fe s , o r
,
w u X i a o l i ( T he R e
s e a r e h I n
s t i t u t e o f S u b t r o p i e a l F o
r e s t r y
,
C A F F u y
a n g
,
z h e j i
a n g
3 1 1 4 0 0 )
.