全 文 ：中国农业科学 2010,43(7):1389-1396
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.07.009

收稿日期：2009-11-02；接受日期：2010-01-12
基金项目：国家自然科学基金项目（30871664）、国家“863”计划重大项目（2006AA10A211）
作者简介：朱伟杰，硕士。Tel：021-64253707；E-mail：zhuweijieooo@yahoo.com.cn。通信作者王 伟，教授，博士。Tel：021-64253707；E-mail：
weiwang@ecust.edu.cn


生防菌 Pseudomonas fluorescens 2P24
对甜瓜根围土壤微生物的影响
朱伟杰，王 楠，郁雪平，王 伟
（华东理工大学/生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

摘要：【目的】探讨生防假单胞菌 2P24 对根围土壤微生物的影响，为生防菌的安全应用提供基础。【方法】
利用平板培养计数与末端标记限制性片段长度多态性分析（terminal restriction fragment length polymorphism,
T-RFLP）相结合的方法研究施用生防假单胞菌 2P24 后不同生育期甜瓜根围土壤微生物多样性的变化。【结果】在
甜瓜定植后，生防菌 2P24 对土壤中细菌和真菌均有较强的抑制作用，对放线菌却具有促进作用。在收获期，2P24
对土壤中细菌和放线菌的影响逐渐减弱，而对真菌表现了一定的促进作用。获得了 41 个细菌菌群的 TRF 片段，其
中，2P24 对优势菌群 TRF213、TRF240、TRF513 无明显影响，而对 TRF61、TRF348、TRF365 等菌群影响显著，土
壤微生物 Shannon-Wiener 多样性指数有所提高。【结论】将传统培养法和 T-RFLP 分析技术相结合，是分析土壤微
生物种群变化较为理想的方法。生防菌 2P24 对甜瓜根围土壤微生物的生态系统影响不显著。
关键词：生防荧光假单胞菌 2P24；根围土壤微生物；T-RFLP

Effects of the Biocontrol Agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on
Microbial Community Diversity in the Melon Rhizosphere
ZHU Wei-jie, WANG Nan, YU Xue-ping, WANG Wei
(East China University of Science and Technology/State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Shanghai 200237)

Abstract: 【Objective】 The objective of this study was to investigate the influence of biocontrol agent Pseudomonas
fluorescens 2P24 on microecosystem in the rhizosphere of melon, and to provide biosafety evaluation for the application of the
bioagent. 【Method】 The influence of biocontrol agent 2P24 on microecosystem in melon rhizosphere at different growing stages
was investigated by using plate culture and terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis. 【Result】 After
transplantion, the rhizosphere biomass of bacteria and fungi in the strain 2P24-treated melon seedlings was decreased, while the
population of actinomycetes was increased. In the harvest period, the influence of strain 2P24 on bacteria and actinomycetes was not
significant, but the fungal population was promoted obviously. Totally 41 TRFs were obtained by T-RFLP analysis, among which the
dominant floras of TRF213, TRF240 and TRF513 were not obviously affected, while the floras of TRF61, TRF348 and TRF365
were influenced significantly, which was also validated by the increased biodiversity indices (Shannon-Wiener). 【Conclusion】 The
abundance bioinformation on the influence of strain 2P24 on microbial diversity was obtained by the methods combined with plate
cultivation and T-RFLP analysis, and the results showed that the biocontrol agent 2P24 did not significantly affect the diversity and
dynamics of microbial communities in melon rhizosphere.
Key words: biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24; rhizosphere microorganism; T-RFLP

0 引言
【研究意义】随着人们对土壤微生物多样性的认
识逐步加深，农用化学品[1]、重金属[2]和放射性元素[3]
等对土壤微生物的影响越来越受到重视，而用于防治
植物病虫害的生防菌对土壤微生物生态的影响研究不
1390 中 国 农 业 科 学 43 卷
多。在研究生防菌抑菌作用时，通常仅选择常见的病
原菌作为测试靶标[4]，但实际应用中，作用对象是广
泛的。生防菌对土壤中有益菌是否具有抑制作用及其
对整个土壤微生态的冲击尚不清晰[5-6]。生防菌往往大
量集中释放，能够定殖在土壤中，并呈动态变化[7]，
因此比其它外来因子对土壤微生物的影响更复杂。研
究生防菌对田间土壤微生物的影响，可为外来微生物
引入土壤的生态安全性提供重要的理论基础，对微生
物农药的安全合理使用、生态农业可持续发展具有重
要指导意义。【前人研究进展】目前有关外来微生物
对土壤微生态影响的研究主要集中在固氮菌及根围促
生菌 PGPR 等方面[8-10]，大多是采用传统的土壤微生
物分离培养方法开展的。如丛枝菌根真菌集球囊霉
Glomus fasciculatum 的引入减少了三叶草根际土壤可
培养的荧光假单胞菌 [9]，而摩西球囊霉 Glomus
mosseae 的引入提高了根际土壤荧光假单胞菌的数
量[10]。但当引入巴西固氮螺菌 Azospirillum brasilense
到玉米根围土壤后，细菌的组成结构却没有影响[11]。
可见，不同的外来微生物对土壤微生物的影响具有很
大差别。土壤中可培养的微生物只占总微生物极少的
部分，因此，上述研究还不能获得全面的信息。【本
研究切入点】随着分子生物学的发展，一些不能培养
的微生物信息也被挖掘出来。其中，末端标记限制性
片段长度多态性（terminal restriction fragment length
polymorphism，T-RFLP）分析技术精度高，能获得土
壤微生物系统的发育信息，是一种较为理想的土壤微
生态研究方法[12-13]。生防菌 Pseudomonas fluorescens
2P24 分离自麦田全蚀病自然衰退土壤，对小麦全蚀
病、棉花立枯病、番茄青枯病都具有显著防效[14-15]。
本研究拟利用传统培养法与改进的 T-RFLP 方法相结
合分析施用生防菌 2P24 后不同生育期甜瓜根围土壤
微生物的种群变化。【拟解决的关键问题】探讨生防
菌 2P24 释放到田间后，对甜瓜根围土壤微生态的影
响，为生防菌的安全使用和评价提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
生防菌株 Pseudomonas fluorescens 2P24 由中国
农业大学张力群博士惠赠。生防菌株 2P24 通过 gfp 荧
光蛋白标记后，采用 KB 液体培养基，28℃摇瓶培养
32 h，稀释至 5×106 cfu·mL-1使用。
1.2 试验地点及设计
试验设在上海市南汇区英雄村蔬菜大棚内，大棚
3 年连续种植甜瓜，每年种植两茬，枯萎病发生较重。
小区设 2 个处理，4 次重复随机排列，每个小区
内 8 株苗。甜瓜定植时灌根施入生防菌 2P24，处理区
每株用菌液 200 mL，对照区每株灌清水 200 mL。
1.3 土壤取样及土壤主要理化性质测定
取土方法：采用五点取土混合方法，取深 5－7
cm、甜瓜根 5 mm 以内的土壤，装入无菌密封袋带回
实验室，立即分析或 4℃冰箱保存。
取土时间：分为定植前、定植后、开花期、结果
期和收获期五个时期。
土壤理化性质测定[16]：土壤 PH 值、土壤水分、
土壤中总有机碳含量、微生物量碳和总氮量。
1.4 生防菌的回收
将土壤样品稀释不同的倍数，取 100 µL 土壤稀释
液涂至含氨苄 100 µg·mL-1的 KB 培养基平板上，30℃
培养直至长出单菌落，荧光显微镜（上海蔡康
DFM-20D）下观察、计数。差异显著性采用费雪氏
LSD 法检验，所用软件为 Office Excel。
1.5 土壤中可培养微生物种类及含量测定
根围土壤细菌、真菌和放线菌采用稀释平板法[17]
测定生物量消长变化，其中，细菌用牛肉膏蛋白胨培
养基、真菌用马丁氏培养基、放线菌用改良高氏一号
培养基。差异显著性采用费雪氏 LSD 法检验，所用软
件为 Office Excel。
1.6 T-RFLP 方法分析土壤细菌多样性
1.6.1 土壤总 DNA 提取 以 REDDY 法[18]为基础，并
优化洗涤液、裂解液和玻璃珠直径。
1.6.2 16S rDNA 的扩增 采用细菌的通用引物[19-21]，
27F-FAM（5′-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3′），
1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′），其
中 27F-FAM 的 5′端标记荧光素 6-FAM（由上海生工
合成）。在 PTC-200 热循环仪上扩增，扩增片段长度
约为 1.5 kb。
1.6.3 PCR 反应 体系 50 µL，包括 10×PCR 缓冲
液（25 mmol·L-1MgCl2）5 µL，引物（10 pmol·µL-1）
各 1 µL，dNTP（各 2.5 mmol·L-1）4 µL，模板 10 ng，
0.5 µL Taq 聚合酶。
1.6.4 PCR 反应条件 94℃预变性 3 min，94℃变性
1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30 个循环，
72℃下延伸 7 min。
1.6.5 PCR产物回收 PCR 产物在1%的琼脂糖凝胶
上电泳，用硅胶柱回收试剂盒（天根生物科技有限公
司）回收 1.5 kb 左右的凝胶带。
7 期 朱伟杰等：生防菌 Pseudomonas fluorescens 2P24 对甜瓜根围土壤微生物的影响 1391
1.6.6 内切酶选取 HhaⅠGCG’C；HaeⅢ GG’CC；
MspⅠC’CGG（TaKaRa 公司）。
1.6.7 酶切产物的片段分离 1 mL 变性剂 Hi-Di
Formamide 与 50 µL GeneScan-500 LIZ Size Standard
混合，取 9.5 µL 与 1 µL 酶切产物混合后，在 PE9700
型 PCR 仪上 95℃变性 5 min，置冰上 5 min。然后在
ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 上 POP-4 胶（美国
应用生物系统公司 ABI），60℃、15 kV 电泳 28 min。
电泳数据经Genescan 软件处理后得到检测片段大小，
即 T-RFLP 数据。
1.7 原始数据处理及数据分析
采用 http://www.ibest.uidaho.edu/tools/T-RFLP_stats/
index.php 网站上 AutomaticProgR.pl 、 Filteringand
Binning.r 软件变量域值法进行真伪峰区分、片段并类
及片段百分含量计算[12]。利用 Microbial Community
Analysis Ⅲ（ http://mica.ibest.uidaho.edu/ ）网站上
VirtualDigest（ISPaR）在线软件，选择 HhaⅠGCG’C；
HaeⅢ GG’CC；MspⅠC’CGG 三种限制性内切酶、PCR
引物序列、复性错配率等，获得此三种限制性内切酶
的酶切库。
1.8 T-RFLP 数据鉴定细菌种属
利用 http://trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp 网
站上的在线软件Phylogenetic Assignment Tool 进行分
析，确定细菌菌属。本试验误差允许范围[18]为：片段
长度 100 bp 内允许 0.5 bp 偏差，300 bp 和 500 bp 内
分别允许 1 bp 和 1.5 bp 偏差。
2 结果
2.1 试验区土壤理化性质测定
试验区土壤性质测定表明，土壤类型为壤土，pH
4.73—6.00，含水量 16.65%—23.20%，土壤中总有机
碳、微生物量碳和总氮量维持一个相对稳定的状态，
含量分别为 18.5—21.2 g·kg-1，685.32—833.45 mg·kg-1，
0.19—0.25 g·kg-1。
土壤胶体颗粒半径较小，具有较大比表面和表面
能，有良好的凝聚性和分散性，土壤为酸性环境，其
中以适应酸性环境的微生物为主。土壤具有良好酸碱
缓冲能力，这为植物生长和土壤微生物的活动创造比
较稳定的生活环境。
土壤中总有机碳含量、微生物量碳、总氮量等较
丰富，可以推测，土壤微生物的生物量和多样性都在
较高水平，土壤微生物生态系统应当具有较强的缓冲
能力。因此对于具有高度丰富的土壤微生物生物量和
多样性，生防菌释放到田间土壤后，可能受土壤的反
馈影响较大。
2.2 生防菌 2P24 的回收
在甜瓜定植期内，在土壤中施入生防菌 2P24，第
二日经过平板回收，含量为 13.5×105cfu·g -1干土，开
花期，生防菌 2P24 含量下降至 7.0×104 cfu·g -1干土，
到结果期和收获期时，生防菌 2P24 含量分别为 1.2×
104 cfu·g -1干土和 3.8×103 cfu·g-1干土。可见，施入到
甜瓜土壤后的生防菌 2P24，在甜瓜的整个生育期内呈
逐渐下降趋势，但在收获期仍具有一定的含量（表 1）。
2.3 生防菌 2P24 对土壤中可培养细菌、真菌和放线
菌生物量的影响
土壤中可培养细菌生物量在春季甜瓜生育期内有
明显的变化（表 2），从定植后到结果期持续增长，
分别提高了 53.7%、170.3%、263.0%，到收获期时可
培养细菌生物量略有下降，为结果期的 67.9%。
生防菌 2P24 释放到土壤后，对土壤中可培养细
菌有一定的抑制作用，定植后抑制作用最高，并随着
时间推移，这种影响逐渐减弱。
生防菌对土壤可培养真菌在定殖后抑制作用最显
著，为对照的 85.7%，而收获期为促进作用，含量提
高了 17.4%。
2P24 对土壤可培养放线菌却具有促进作用，定植
后含量提高了 1.9 倍，开花期到结果期逐渐减弱，收
获期表现微弱的抑制作用。
2.4 甜瓜根围土壤细菌多样性的变化
2.4.1 对照区甜瓜生育期内土壤细菌多样性 采用

表 1 甜瓜土壤中生防菌 2P24 的消长变化
Table 1 The quantitative change of culturable biocontrol 2P24 in inoculated melon soil
定植后
After colonization
开花期
Blooming period
结果期
Fruiting period
收获期
Harvest period
土壤中可培养生防菌 2P24 含量
The culturable biocontrol 2P24 in the soil (cfu·g -1 干土)
(13.5±0.3)×105a (7.0±0.5)×104ab (1.2±0.2)×104b (3.8±0.1)×103c
同行中不同英文字母采用费雪氏 LSD 法检验表示差异达显著水平（P＜0.05）。表 2 同
Values followed by different letters in the row are significant at P＜0.05 according to Fisher’s least significant difference test. The same as table 2
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表 2 生防菌 2P24 对甜瓜土壤中可培养的细菌、真菌、放线菌的影响
Table 2 The quantitative change of bacteria, fungi, actinomycetes in melon soil inoculated with biocontrol 2P24
定植前
Before colonization
定植后
After colonization
开花期
Blooming period
结果期
Fruiting period
收获期
Harvest period
土壤中可培养微生物含量
The culturable microorganism
CK 2P24 CK 2P24 CK 2P24 CK 2P24 CK
细菌 Bacteria (×106 cfu·g -1 干土) 54±1d 63±2d 83±4c 114±4c 146±2b 184±1a 196±4a 124±3b 133±1b
真菌 Fungi (×104 cfu·g -1 干土) 34±8c 48±3b 56±5b 80±6a 83±3a 68±4a 76±2a 54±4b 46±3c
放线菌Actinomycetes (×104 cfu·g -1干土) 35±3b 72±4a 25±3c 45±1b 46±2b 49±1b 44±3b 29±1c 34±1b

T-RFLP 方法检测到 110 个以上的峰，经过对背景峰
的处理，并从中选取相对百分含量在 0.5%以上的优势
片段，CK 为 34 个（图 1）。
甜瓜生育期内对照的整体细菌多样性变化并不明
显，Shannon-Wiener 多样性指数分别为 3.31、3.62、
3.63、3.51、3.53。其中相对含量最高的 TRF240 占整
个土壤细菌相对总量的 24%左右，该菌群在整个生育
期内主体呈下降趋势，收获期时相对含量略有提高。
TRF36 相对含量逐渐提高，收获期时提高显著，TRF60
相对含量在整个生育期表现为持续提高，TRF79 相对
含量在收获期时明显提高、TRF213 相对含量逐渐下
降，TRF513 相对含量在定植后有所提高，而之后又
随之降低。
2.4.2 2P24 处理甜瓜生育期内土壤细菌多样
性 2P24 处理的甜瓜根围土壤细菌多样性变化较显
著，其中 0.5%以上的优势片段为 41 个，生育期内的
微生物 Shannon-Wiener 多样性指数分别为 3.56、3.96、
4.27 和 4.08，逐渐提高。其中 TRF240 相对含量仍然
最高，TRF220、TRF224、TRF296、TRF341、TRF363、
TRF365 相对含量变化较为显著（图 2）。
甜瓜苗定植后，生防菌对 TRF61、TRF226、
TRF228 菌群有明显的抑制作用，而对 TRF341、
TRF365 有明显的促进作用。甜瓜开花期时，2P24 对
TRF61 有明显的抑制作用，而对 TRF149、TRF256、
TRF299、TRF365 有明显的促进作用。甜瓜结果期时，
2P24 对 TRF61、TRF226、TRF348 有明显的抑制作用，
而对 TRF220、TRF224、TRF296、TRF363、TRF365
有明显的促进作用。甜瓜收获期时， 2P24 对 TRF61、
TRF348 、TRF370 有明显的抑制作用，而对 TRF299、
TRF363 有明显的促进作用。
2.4.3 2P24 处理的代表性甜瓜根围土壤主要细菌种
属分析 根据信息库，TRF61 菌群主要含有一些适应
盐和酸性土壤性质的微生物，如嗜盐嗜碱芽孢杆菌
haloalkaliphilic bacillus、盐水球菌属 Salinicoccus、
乳酸乳球菌 Lactococcus lactis，以及一些功能菌，如
中华根瘤菌属 Sinorhizobium，和土壤中常见的菌，
如土壤杆菌属 Agrobacterium、芽孢杆菌属 Bacillus、囊
球粘菌属 Angiococcus、微小杆菌属 Exiguobacterium。
生防菌在各生育期对这一菌群均有抑制作用。
TRF208 菌群片段有相当复杂的菌群种类，含有
较多的功能菌如脂环酸芽孢杆菌属 Alicyclobacillus、
色盐杆菌属 Chromohalobacter、鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas、脱氯单胞菌属 Dechloromonas、亚硝化
单胞菌属 Nitrosospira、中度产丙酸菌 Propionigenium
modestum、史氏芽孢杆菌 Bacillus smithii、固氮斯氏
假单胞菌 Pseudomonas stutzeri，同时有一些重要的病
原菌，如西瓜细菌性果斑病菌 Acidovorax avenae、伯
克霍尔德氏菌属 Burkholderia、雷尔氏菌属 Ralstonia
等。该菌群可能在维持土壤中各元素循环中起非常重
要的作用，在生防菌释放后，整个生育期显示出明显
的抑制作用，降低了该菌群的含量。
TRF213 菌群主要含有盐单胞菌属 Halomonas、短
芽孢杆菌属 Brevibacillus、类芽孢杆菌属 Paenibacillus、
食碱菌属 Alcanivorax、梭形杆菌属 Fusobacterium、色
盐 杆 菌 属 Chromohalobacter 、 窄 食 单 胞 菌 属
Stenotrophomonas、黄单胞菌属 Xanthomonas、假单胞
菌属 Pseudomonas、伯克霍尔德氏菌属 Burkholderia、
粘放线菌Actinomyces viscosus、不动杆菌属Acinetobacter
等。生防菌对这一菌群有抑制作用。
TRF226 菌群中具有调节土壤性质的有脂环酸芽孢
杆菌属 Alicyclobacillus、甲基孢囊菌属 Methylocystis，可
能为病原菌的假单胞菌属 Pseudomonas 和作用未知的
短芽孢杆菌属 Brevibacillus、乳杆菌属 Lactobacillus、
梭状芽孢杆菌属 Clostridium、绿芽菌属 Blastochloris、
隐杆藻属 Aphanothece 等。生防菌对这一菌群也有一
定的抑制作用。
TRF341 菌群主要含有一些功能菌，如印度拜耶林
克氏菌 Beijerinckia indica、甲烷氧化细菌 Methylosinus
7 期 朱伟杰等：生防菌 Pseudomonas fluorescens 2P24 对甜瓜根围土壤微生物的影响 1393


图 1 对照区中甜瓜各生育期根围土壤细菌多样性变化
Fig. 1 The bacterial diversity of CK melon rhizosphere soil in growing period



图 2 2P24 处理区中甜瓜各生育期根围土壤细菌多样性变化
Fig. 2 The bacterial diversity of 2P24 inoculated melon rhizosphere soil in growing period

trichosporium、光合细菌球形红细菌 Rhodobacter
sphaeroides。生防菌对这一菌群有一定的促进作用。
TRF365 菌群主要有分枝杆菌属 Mycobacterium、
噬甲基菌属 Metyhlophaga、链霉菌属 Streptomyces、
无色菌属 Achromobacter，其中链霉菌属可产生多种抗
生素类物质。生防菌对这一菌群有较好的促进作用。
1394 中 国 农 业 科 学 43 卷
TRF513 菌 群 主 要 为 功 能 菌 如 根 瘤 菌 属
Rhizobium、红假单胞菌属 Rhodopseudomonas、副球
菌属 Paracoccus、红细菌属 Rhodobacter、甲基杆菌属
Methylobacterium 以及具有生防功能的链霉菌属
Streptomyces、甲基孢囊菌属 Methylocystis。生防菌对
这一菌群有促进作用。
3 讨论
3.1 2P24 对土壤微生物的生物量影响
Rogers 等 [22]的研究结果表明固氮灰色念珠藻
Nostoc muscorum 引入导致土壤细菌、真菌、放线菌
数量分别提高了 500、16、48 倍。而本研究发现，生
防菌 2P24 对土壤中三种主要微生物生物量的影响在
定植后开始，其中放线菌下降了 34.7%，细菌和真菌
都有所提高。而后，各生育期生防菌对土壤中微生物
中细菌的生物量一直具有促进作用，对真菌和放线菌
影响不大。到收获期，基本恢复到对照水平。可见，
生防菌 2P24 在施入初期对土壤微生物冲击较大，后
期逐渐恢复，这可能是由于试验田土壤长期施入有机
肥，土壤中碳氮含量丰富，微生物生物量也较高，使
土壤微生态系统对生防菌缓冲能力加强。同时，生防
菌 2P24 在土壤中的含量逐渐减少，其对土壤微生态
系统的影响也会逐渐降低。Roesti 等[8]通过引入丛枝
菌根真菌（AMF）和 PGPR 假单胞菌，发现它们对小
麦根际土壤细菌群落也有显著影响。可见，不同微生
物引入土壤，对土壤微生态的影响差异较大。
本研究结果也表明，在对照区，不同生育期的微
生物含量也有较大的变化，可能是环境温度、湿度以
及植物生育期对土壤微生物产生一定影响。在玉米的
根部引入绿针假单胞菌 Pseudomonas chlororaphis 和
恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida 的研究也发现[23]，
土壤中可培养的细菌和整个微生物区系都发生较大的
变化，并且植物的生育期与微生物的变化密切相关。
3.2 2P24 处理对土壤细菌优势种群的影响
生防菌 2P24 能够产生嗜铁素，2，4-二乙酰基间
苯三酚、2,4-DAPG、氰氢酸 HCN、蛋白酶等抑菌物
质，是非常具有商业潜力的生防菌株[14-15]。T-RFLP
方法的研究结果表明，生防菌 2P24 在甜瓜根围土壤
的释放对微生物多样性造成一定的影响，Shannon-
Wiener 多样性指数在生育期内有所提高。可能由于在
生防菌 2P24 影响下，对土壤中微生物生态系统，特
别是细菌生态系统发生了改变，从而打破了土壤微生
态的初始平衡。
主要含有土壤芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、类芽孢
杆菌属、动性杆菌属等的 TRF240 菌群，是土壤中的
优势菌群，2P24 处理对其影响不大。2P24 对另一优
势菌群 TRF213 影响也较小，该菌群中功能菌，如盐
单胞菌属、类芽孢杆菌属、食碱菌属、色盐杆菌属、
中度产丙酸菌、粘放线菌等，为稳定土壤功能起重要
作用。这表明生防菌 2P24 对土壤中占优势的细菌影
响不大，同时，TRF240 和 TRF213 菌群对土壤微生
物生态环境的稳定也起到了重要作用。
生育期内，生防菌 2P24 对 TRF61、TRF348、TRF
365、TRF513 等菌群影响相对明显。对有些菌群有明
显的抑制作用，有些菌群有明显的促生作用。虽然这
些菌群不是最优势的，但仍然占较大的比例，所以，
生防菌 2P24 的作用对整个土壤微生物的细菌群具有
一定的影响。同时，由于 T-RFLP 方法的局限性，虽
然能观察到某个片段所代表的菌群变化，但对菌群中
的各具体微生物变化不能直接确认。
研究中也发现，植物的生育期对土壤微生物系统
的影响也较大，如 TRF36、TRF213、TRF513 等，这
些较优势的细菌菌群，在生育初期、生育中期和生育
后期都有较大的变化。Lerner 等[24]用 DGGE 方法分析
了不同生育期玉米根围土壤微生物群落结构及引入巴
西固氮螺菌 Azospirillum brasilense 的影响，也发现
A. brasilense 对土壤微生物群落结构的影响不明显，
而植物生育期却是影响土壤微生物群落结构的主要因
素。
3.3 T-RFLP 方法研究土壤微生物动态变化
末端标记限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析
技术精度高，其数据的在线分析数据库系统也较完善，
是目前较为适用的土壤微生态分析方法，但其研究结
果受多种因素影响[8,25]。其中土壤微生物的核酸提取
与扩增选用的通用引物影响较大[26-28]。本研究优化了
土壤微生物总 DNA 提取的方法，获得了较高纯度和
含量的 DNA，同时所选用的通用引物扩增后，也获得
比较丰富的 TRF 片段。与 DGGE 等方法相比，该方
法获得的信息量具有明显的优势，但在土样采集、核酸
提取、PCR 体系以及后续 TRF 数据处理上都要求较高。
传统培养法和 T-RFLP 分析技术相结合，研究生
防菌对甜瓜根围土壤微生态的影响，为生防菌的安全
使用和评价提供了新内容和技术。
4 结论
将传统培养法与 T-RFLP 分析技术相结合，是分
7 期 朱伟杰等：生防菌 Pseudomonas fluorescens 2P24 对甜瓜根围土壤微生物的影响 1395
析土壤微生物的种群变化较为理想的方法。生防菌
2P24 在施入初期对土壤中主要微生物的生物量影响
较大，后期逐渐恢复，土壤微生物多样性有所提高。
在甜瓜根围土壤中检测到 41 个主要细菌菌群，生防菌
2P24 对最优势的菌群无影响，对其它菌群有抑制作用
或促进作用，但对甜瓜根围土壤微生物的生态系统总
体上影响不显著。

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