全 文 ：柱后衍生阳离子交换色谱法测定桦菌芝中氨基酸的含量
艾则孜·莫合买提1，沙丽娜1，巴哈尔古丽·黄尔汗2，杨光勇1
(1．新疆食品药品检验所，乌鲁木齐 830004;2．阿勒泰地区药品检验所，阿勒泰 836500)
摘要 目的:建立桦菌芝中氨基酸的含量测定方法。方法:采用阳离子交换色谱柱分离 17 种氨基酸，通过柱后衍生化检测分
析。色谱柱为磺酸基强酸性阳离子交换树脂 LCAK06 /Na型(4. 6 mm × 150 mm) ，采用线性梯度洗脱，其中 A泵(溶液泵)流速
为 0. 45 mL·min －1，M泵(茚三酮泵)流速为 0. 25 mL·min －1;检测波长为 440 nm(脯氨酸)和 570 nm (其余氨基酸) ;进样量
为 50 μL。结果:该方法中各氨基酸的线性关系良好;精密度 RSD范围 0. 28% ～ 1. 67%，重复性 RSD 范围 0. 50% ～ 2. 13%;
平均回收率为 98. 7%。结论:本研究建立的分析方法准确，灵敏度高，具有良好的重复性和回收率，可作为中药材中氨基酸的
定量分析和研究方法。
关键词:桦菌芝(木蹄) ;柱后衍生阳离子交换色谱法;氨基酸的含量测定
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2012)11 － 1972 － 04
Determination of amino acids in Pyropolyporus fomentarius by post －
column derivatization cation － exchange chromatography
AZIZ Mohammat1，SHA Li － na1，BAHARGULI Huang － er － han2，YANG Guang － yong1
(1． Xinjiang Institute for Food and Drug Control，Urumqi 830004，China;
2． Altai Institute for Drug Control，Altai 836500，China)
Abstract Objective:To establish a determination method for amino acids in Pyropolyporus fomentarius． Meth-
ods:A total of 17 amino acids were separated using cation － exchange column，and then analyzed by post － column
derivatization． The sulfonic acid cation exchange resin LCAK06 /Na type(4. 6 mm × 150 mm)column was em-
ployed using a linear gradient elution，where solution pump(A pump)was administrated at a flow rate of 0. 45 mL
·min －1，ninhydrin pump(M pump)flow rate at 0. 25 mL·min －1;detection wavelength was set at 440 nm(pro-
line)and 570 nm(the other amino acids) ;injection volume was 50 μL． Results:The method showed a good linear
relationship in amino acid determination;the precision RSD was in the range 0. 28% － 1. 67%，the repeatability
RSD was in the range of 0. 50% －2. 13%;the average recovery was 98. 7% ． Conclusion:The analytical method
established is accurate，sensitive，reproducible and feasible，which can be applied to the analysis of amino acids in
Chinese crude drug．
Key words:Pyropolyporus fomentarius(Fomes fomentarius) ;post － column derivatization cation exchange chroma-
tography;determine the amino acids
第一作者 Tel:13899906596;E － mail:Qabdas@ 163． com
桦菌芝为多孔菌科植物桦菌芝 Pyropolyporus
fomentarius (L． ex Fr．)Teng． 的菌体［1］，是一种多寄
生于桦及栎树干上的药用高等真菌，别名:木蹄、苦
木蹄。目前，化学研究表明，其含有桦菌芝醇、多糖、
氨基酸和皂苷、鞣质等化学成分［2 ～ 4］。具有广泛药
理作用，如抗肿瘤，免疫调节等。桦菌芝是中医、哈
萨克医等民族医药的常用药材，其所含的氨基酸具
有特殊的生物活性，在中药药性研究中占有特殊的
位置。因此，其氨基酸的研究是不可忽视的内容
之一。
目前，国内外氨基酸分析方法主要分为直接分
析法和衍生化间接分析法两类。其中，衍生化分析
法有柱前、柱上和柱后衍生化 3 种模式［5 ～ 9］。Sykam
氨基酸分析仪广泛用于植物、动物中氨基酸检测，主
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要采用柱后衍生模式，其基本结构与 HPLC 相似。
同时，该方法针对氨基酸分析进行了一系列细节的
优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及
柱温梯度控制等。氨基酸分析仪使用时，通常利用
Na +型(或 Li +型)磺酸基强酸性阳离子交换树脂。
由于氨基酸为两性电解质，在酸性条件下，能被树脂
表面的活性基团(－ SO3 －)吸附，通过不同 pH 系
列的洗脱液使氨基酸逐步洗脱下来，以氨基酸与活
性基团亲和力最弱洗脱，如即依次为酸性氨基酸、羟
基氨基酸和中性氨基酸、芳香族氨基酸及碱性氨基
酸等。Na +型树脂一般用于蛋白质水解液中的氨基
酸分析;Li +型树脂一般用于生理体液中的氨基酸分
析。本试验采用阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后
衍生法，对桦菌芝中氨基酸进行测定。
1 仪器、试剂与样品
德国赛卡姆公司氨基酸分析仪(S5200 全自动进
样器、S4300 氨基酸反应模块、S2100 梯度泵) ，上海
Mettler Toledo 台式酸度计(Delta 320) ，WG2003SBC
台式电热干燥箱(中外合资重庆四大实验仪器有限公
司) ;上海 Mettler Toledo电子天平(Mettler AG135)。
对照品天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸
(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、
缬氨酸(Val)、胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、异亮氨
酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸
(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、
脯氨酸(Pro)等混合氨基酸对照品，德国赛卡姆公司
提供，批号 1806109 － 6006001;甲醇为色谱纯，水为
超纯水，其余试剂均为分析纯;缓冲液 A、缓冲液 B、
再生液、样品稀释液、茚三酮固体均购自德国赛卡姆
公司;桦菌芝药材 (批号:20091009，20091016，
20101103)阿勒泰地区药品检验所提供;由新疆食品
药品检验所苏莱曼老师鉴定为多孔菌科植物桦菌芝
Pyropolyporus fomentarius (L． ex Fr．)Teng．的菌体。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:磺酸基强酸性阳离子交换
树脂 LCAK 06 /Na，(4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ;流动
相:缓冲液 A(称取柠檬酸三钠 11. 9 g、柠檬酸 6 g、
苯酚 1 g，加适量水溶解，再加甲醇 65 mL 和浓盐酸
6 mL用水稀释至 1 L，此液 pH 应调节到 3. 43 并通
过 0. 45 μm滤膜过滤)、缓冲液 B(称取柠檬酸三钠
11. 9 g、氢氧化钠 2. 8 g 、苯酚 1 g、硼酸 5. 0 g，加适
量水溶解，稀释至 1 L，此液 pH 应调至 10. 85 并通
过0. 45 μm滤膜过滤)、再生液(称取氢氧化钠
20. 0 g、EDTA 0. 2 g，用水稀至 1 L 并通过 0. 45 μm
滤膜过滤)、样品稀释液(称取柠檬酸三钠 11. 9 g、
25%硫二甘醇 20 mL、浓盐酸 14 mL 用水稀至 1 L
并通过 0. 45 μm滤膜过滤)、茚三酮试剂(称取茚
三酮 20 g、苯酚 2 g，用 400 mL 钾钠缓冲液和 600
mL甲醇溶解)。检测波长 440 nm(脯氨酸)和 570
nm(其余氨基酸) ;进样量:50 μL。流速:A 泵(溶
液泵)0. 45 mL·min － 1，M 泵(茚三酮泵)0. 25 mL
·min － 1梯度洗脱(0 ～ 8. 00 min，100% A;8. 00 ～
15. 00 min，85%A;15. 00 ～22. 00 min，80%A;22. 00 ～
27. 00 min，75% A;27. 00 ～ 34. 00 min，0% A;34. 00 ～
49. 00 min，0% A;49. 00 ～ 49. 10 min，0% A;49. 10 ～
51. 10 min，0%A;51. 10 ～51. 20 min，100%A;51. 20 ～
65. 00 min，100%A)。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 混合对照品溶液 精密量取混合氨基酸对
照品适量，加稀释液制成浓度为 250 nmol·L －1(其
余 16 种氨基酸)和 100 nmol·L －1(胱氨酸)的混合
对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液 称取样品粉末约 0. 2 g，置于
水解管中，加 6 mol·L －1盐酸 10 mL，通氮气封口，
置 110 ℃烘箱内水解 24 h，取出放冷至室温，打开水
解管，4000 r·min －1离心 10 min，取出上清液 2. 0
mL置蒸发皿中，挥干残渣加 2. 0 mL水，如此反复操
作 2 ～ 3 次，挥尽 HCl气体，然后加水定容至 10 mL，
0. 45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2. 3 系统适用性试验 分别精密吸取上述混合
对照品溶液和供试品溶液各 50 μL，按“2. 1”项
下色谱条件进行测定。结果:选择 2 个检测波长
440 nm(脯氨酸)和 570 nm(其余氨基酸) ，混合
对照品和样品中的氨基酸得到了很好的分离。
见图 1。
2. 4 线性关系考察 取氨基酸混合对照品溶液
配 制 成 浓 度 分 别 为 20，40，80，120，200，
400 nmol·mL － 1的系列溶液。按上述色谱条件
注入氨基酸分析仪，测定峰面积，以峰面积 Y 对
氨基酸浓度 X(nmol·L － 1)进行线性回归，得回
归方程见表 1。
2. 5 精密度试验 精密量取 200 nmol·mL －1的混
合对照品溶液 50 μL，按上述色谱条件连续进样 5
次，测定峰面积，计算得各组分色谱峰保留时间波动
小于 0. 5 min，峰面积的 RSD为 0. 28% ～1. 67%，结
果表明，仪器的精密度良好。
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图 1 混合对照品(A)、桦菌芝样品(批号:20091009) (B)色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of amino acids mixed standard(A) ，and Pyropolyporus fomentarius sample(Lot No．:20091009) (B)
1．天冬氨酸(Asp) 2．苏氨酸(Thr) 3． 丝氨酸(Ser) 4． 谷氨酸(Glu) 5． 甘氨酸(Gly) 6． 丙氨酸(Ala) 7． 缬氨酸(Val) 8． 胱氨酸
(Cys) 9．蛋氨酸(Met) 10．异亮氨酸(Ile) 11．亮氨酸(Leu) 12．酪氨酸(Tyr) 13．苯丙氨酸(Phe) 14．组氨酸(His)15．赖氨酸(Lys)
16．精氨酸(Arg) 17．脯氨酸(Pro)
表 1 17 种氨基酸的线性方程
Tab 1 Regression equations of 17 kinds of amino acids
序号
(No．)
氨基酸
(amino acids)
线性回归方程
(regression equation)
r
1 ASP Y =1303. 1X －1872. 3 0. 9983
2 THR Y =18. 5X +96. 9 0. 9980
3 SER Y =1436. 5X －2067. 9 0. 9986
4 GLU Y =1305. 5X －1846. 1 0. 9994
5 GLY Y =1212. 7X －1703. 9 0. 9969
6 ALA Y =1270. 3X －1802. 1 0. 9980
7 CYS Y =862. 5 X －1152. 7 0. 9969
8 VAL Y =1449. 8X －2046. 7 0. 9911
9 MET Y =1246. 3X －1754. 9 0. 9995
10 ILE Y =1352. 4X －1906. 8 0. 9988
11 LEU Y =1291. 1X －1820. 8 0. 9976
12 TYR Y =1191. 2X －1676. 4 0. 9982
13 PHE Y =1228. 1X －1733. 4 0. 9978
14 HIS Y =1298X －1829. 9 0. 9991
15 LYS Y =1790. 3X －2682. 2 0. 9986
16 ARG Y =1222. 3X －1449. 9 0. 9979
17 PRO Y =582. 9X －802. 2 0. 9985
2. 6 重复性试验 取同一批样品按“2. 2. 2”项下
方法平行制备 5 份供试品溶液，按上述色谱条件测
定含量。结果 RSD为 0. 50% ～2. 13%，表明本方法
重复性好。
2. 7 加样回收率试验 称取已测得含量的供试
品(50 mg)6 份，分别精密加入混合对照品溶液
80 nmol·mL － 1，按“2. 2. 2”项下制备供试溶液，
按上述色谱条件测定，计算回收率。结果平均回
收率(n = 6)为 98. 7%，RSD 为 1. 8%，回收试验
符合要求。
2. 8 样品测定 取 3 批桦菌芝样品，按“2. 2. 2”项
下制备供试品溶液，每批平均制样 3 份，按上述色谱
条件，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液
各 50 μL进样测定，以外标法计算含量。测定结果:
批号为 20091009，20091016，20101103 的 3 批样品
测得的总氨基酸含量分别为:18. 93%，19. 07%，
19. 46%。见表 2。
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表 2 桦菌芝中氨基酸的测定结果(%，n =3)
Tab 2 Determination results of amino acids in
Pyropolyporus fomentarius
氨基酸
(amino acids)
批号(Lot No．)
20091009
批号(Lot No．)
20091016
批号(Lot No．)
20091103
ASP 1. 246 1. 352 1. 369
THR 0. 696 0. 706 0. 651
SER 0. 709 0. 526 0. 777
GLU 2. 491 2. 625 2. 755
GLY 0. 751 0. 954 0. 743
ALA 0. 766 0. 771 0. 825
CYS 0. 135 0. 125 0. 136
VAL 0. 781 0. 684 0. 612
MET 0. 132 0. 167 0. 126
ILE 0. 533 0. 331 0. 383
LEU 0. 774 0. 782 0. 856
TYR 0. 401 0. 307 0. 327
PHE 0. 552 0. 462 0. 487
HIS 6. 941 7. 149 7. 562
LYS 0. 625 0. 634 0. 567
ARG 0. 747 0. 781 0. 632
PRO 0. 659 0. 714 0. 650
3 讨论
3. 1 氨基酸分析在医药、食品和动植物代谢产品检
测等方面应用非常广泛，国外早已开展了氨基酸高
效液相色谱检测方法的研究工作，国内也进行了这
方面的探索。本实验采用柱后衍生化，同时测定了
17 个氨基酸，在 50 min 内分离良好，定量结果比较
可靠。
3. 2 考察了不同水解时间(110 ℃水解 24 h，110
℃水解 12 h，105 ℃水解 24 h) ，结果 110 ℃水解 24
h 较完全，样品一定要水解充分，严格控制衍生时
间，保证衍生时间足够;另外温度不可过低，否则将
造成衍生不完全。
3. 3 试验中所用的桦菌芝来自不同年份同一采收
季节，我们分别测定了氨基酸的含量，其中有 3 种必
需氨基酸含量大于 1%，天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、
尤其以组氨酸含量最高，因此桦菌芝具有较高的药
用价值。
3. 4 本研究建立的分析方法操作简便、易行、准确、
可靠，灵敏度高，重复性好，适用于桦菌芝中氨基酸
的分析和研究，为其他中药材中氨基酸的分析和研
究提供了可资借鉴的方法。
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(本文于 2011 年 12 月 29 日收到)
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