全 文 ：申 旧 种 李
1卯 l 年 5 月 B 辑 第 5期
蚕豆叶中具 D C IP 光还原活性的
D l
一
D Z
一
C yt
.
b 559 复合物的纯化和特性研究 *
王 俊 梁厚果 * *
(兰州大学生物系 , 兰州 73 叨以】
杜林方 唐晓松
(四州大学生物系 , 成都 6l 0() 64
摘 要
本文首次从蚕豆叶中纯化出含有 D , , D : 和 C yt .蝙 三种多肤的 P sl l 反应中心
复合物 . 该复合物在 D P C 存在下具有明显的光还原 D C I P 的活性 , 且在照光和暗
条件下均显示 S ign a l l ls . 该复合物还含有一定数量的锰 , 光照下 M n +2 一E P R 信号强
度下降约 40 % , 转入暗中M n Z十 一E P R 信号强度又得到恢复 . 这些结果表明 : 此复合
物具有从 P sl l 第二电子供体 Z 到稳定原初电子受体 Q飞的完整电子传递链的功能;
该复合物中还可能具有锰原子结合部位 ,光暗转换可引起所含锰原子价态的可逆变化 .
关键词 : P巫l反应中心复合物 ,腼尹+ 一u 砚谱 ,。以P 光还原 ,荧光发射光谱 ,纯间 n s
近年来 , 对高等植物光系统 n ( P sl l) 的结构与功能关系的研究取得很大进展 . 高等植物
的 D , 和 乓亚基在氨基酸序列的特殊区域与紫色光合细菌的 L 和 M 亚基具有很高的相似
性 l ’ , 刁一些作者还提出 D ,和 D Z蛋白可能共同构成 P sl l的反应中心 卜` 51 . N a n b a 和 s at ho 报道了从菠菜 (助奴理“ 口距
~
)中分离纯化出一种由 D , 和 q 加上 C yt . b 59 组成的多肤复合
物 ;let 此复合物具有光化学电荷分离功能 ,且能形成 P 680 的自旋极化三线态 门 . 别的实验室也
得到类似的结果 凶 . 但过去纯化得到的这种三肤复合物未检测出酿和锰 f“ “ ;sl 其光化学活性也
只 限于能形成随电荷重组而衰减的 P 680 十 p h e o Ph yt in 一 带电基 团对 , 而无 D C IP ( 2, 吞
D ic ih or 叩 h e p of idn 叩 h eoln )( 2, 石二氯酚靛酚 )光还原活性圈
.
本文首次从蚕豆叶中分离纯化出具有 D C IP 光还原活性的 D -I D犷C yt . b , 三肤复合物 ;并
进一步对此复合物的吸收光谱 、 荧光发射光谱以及多i , a l l l: 和 M扩长 E P R谱等特性进行了
研究 .
本文 19 9 0年 5月 2 日收到 , 19 90 年 or 月 6 日收到修改稿 .
* 国家自然科学基金资助项目 .
* * 通讯联系人 .
中 国 科 学 ( B 辑 ) 19 1年
材 料 和 方 法
1
. 材料
( 1 ) P sl l 颗粒的制备 用蚕豆( F扮故 .加撇 L . )成长叶作材料 , 按 K uw ab ar a 等 l9] 的方法
制备 P sl l 颗粒 .
( 2 ) P sl l 反应中心复合物的纯化 参考 N a bn a 和 Sat o h[ 6] 的方法 ,并作较大改进 . 将从
蚕豆叶中制备的 P S l 颗粒悬浮于含 350 In 」n o l压 氯化钠 、 20 r n们n o l儿 抗坏血酸钠和 or %
(W / V )甘油的 50 un o l / L M E S 【2
一
(-N m o r ph o lin o ) e th a n e s ul fo icn iac d] 【2 · (N 一 吗琳升乙基
磺酸 ] 一N a O H ( pH .6 0) 缓冲液中, 调整叶绿素浓度为 .0 s mg / iln , 加人 20 % ( w / v )的 T irt o n
-X 10, 使其最终浓度为 4% (W / V ) . 在 0一 4 o C避光条件下搅拌处理 ht 后 , 在 10( 日刃g 和
o4 C 下离心 l h . 上清液用含 O·0 5% (W / V ) T ir ton -x 10 和 10% 甘油的 50 m m o l / L M E S-
N a O H ( p H 6
·
0 )缓冲液稀释约 6 倍 , 吸附于预先用含有 50 un o l / L M E S
·
N aO H ( p H 6
·
0 )
、
.0 05 % T irt on -X 10 和 70 ~ ol / L N
a C I的缓冲液平衡好的 D E A E 一T O y o ep ar l 6505 离子交换
树脂层析柱上 ,再用上述相同的缓冲液洗至流出液无色为止 . 接着再用含 50 ~ ol / L M E S
-
Na 0 H ( P H 6
·
0 )
、
10% 甘油和 0· 05% T ir t o n -X 10 的 70一 2X() r n l n o l / L 梯度的氯化钠溶液
进行洗脱 ,可得到纯化的 P 51 1反应中心复合物 .
( 3 ) SD -s P AG E (十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳 ) 反应中心复合物多肤组分
的 S D -s P扣E 分析基本按 L ae n l n l i【网方法加以改进 · 即分离胶中加人 6 m of / L 尿素 ,并制成
10 一 20 % 的聚丙烯酞胺梯度凝胶 . 电泳胶板用考马斯亮蓝 -R 250 染色 .
2
. 方法
( l) 吸收光谱的测定
( 2 ) 荧光发射光谱
用岛津 U V . 24() 双光束分光光度计记录室温吸收光谱 .
纯化后的 D l’ D犷C yt . b , 复合物的室温 ( 29 8 K )和低温 (77 K )荧光
发射光谱用日立 850 型荧光分光光度计测试 . 光路宽度为 s mn , E x 为 436 mn
.
( 3) 光化学活性测定 加人D P C ( 1, -5 D IPhe yn ic ar b a z id e ) (二苯卡巴脉 )为人工电子供
体 ,用岛津 U V . 24() 型双光束分光光度计测定人工电子受体 D C IP 的光还原速率 . 反应温度
为 2 5o C ,反应介质含 50·n of / L 的 M E-S Na 0 H (PH 6
·
0 ) 50 un
o l / L C a C I : 和 130 un
o l / L
N a CI
, 光源为 250 W 聚光灯 ,样品浓度大约为 10 阳 hic /而 . 被还原的 D C IP 量按 A , 二 12 .9
(m m ol / L )
一 ’
cnI
一 ’计算 , 光还原速率的活性表示为微电子当量 · m g 一 ’ c hi · h 一 `·
(4 ) is gan l n
s 和 锰原子 的 E P R (电子顺 磁共 振波谱 ) J检 测 使用 B ur ke : 公 司
E ZR o D
一
SR C
一
10 l/ 2 型顺磁共振波谱仪测定纯化的 D I一 D f Cyt . 蝙 复合物的 Sign al n s 以及
M扩气E P R信号 , 记录一阶微商信号 . Sign a l l l s 的测试条件为:微波功率 21 m w ,调制频率 10
k H z
, 调制幅度 .0 5 m T , 温度 150 K . M价十 · EP R 的测试条件为 :微波功率 21 m w ,调制频率 10
k H Z
,调制幅度 2 m T, 温度 29 8 K . 光源条件同活性测定 .
( 5) 叶绿素浓度测定 根据 rA on ln l公式计算叶绿素含量 .
本文所用试剂 : M E S购自华美生物工程公司 ;丙烯酞氨和甲叉双丙烯酞氨均为 lF u k a产
品 ;十二烷基硫酸钠为 eS rva 产品 ; D E A E一 T O Y O P EA R L 6 505 型离子交换树脂购自日本东
洋曹达公司 . 其它化学试剂均为国产分析纯试剂 . `
第 5期 王 俊等 :蚕豆叶中具 l x 〕p 光还原活性的Dl 一Dz- 印 . bs , 复合物的纯化和特性研究 48 1
二 、 实 验 结 果
1
.
P S ll 反应中心复合物的制备与多肚组分分析
按上述方法制备的 P 51 1颗粒经吸附上柱 , 用平衡缓冲液洗脱 ,流出液经 SD -s P A G E分析 ,
富含捕光色素蛋白 , 47 kD 和 43 k D 叶绿素结合蛋白 , 以及 3 k D , 24 功 和 18 kD 亲水性蛋白 , 来检测出 D ,和玖蛋白. 接着进行氯化钠线型梯度洗脱 , 只出现一个含叶绿素成分的峰
(图 l) , 在大约 or o一 140 ~ ol 压 氯化钠浓度时流出
. 收集此组分 , 用 SD S一P A G E 分析其多
肤组成 .
ǎ曰、一昌石à6`之1035卯
/
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事
70l;司ō一50
k一人闷曰曰月峙
一一一一一一 ~ 洲
10 20 30
分部管号
图 1 P lS 反应中心复合物的 D D正` cT 卿讲alr 650 s 柱层析洗脱图
0
.
5卜 4 15
了04Q住
邻咨歌
图 2 蚕豆叶中纯化的P sl 反应中心复合物多肤 图 3
组分的 SD S . PA G E 分析
仑一菊了一一咬万一- 丽一 一 万亩
波长 (mn )
纯化的D l一肠 Cyt .嘛复合物室温吸收光谱
与 P sl l 颗粒电泳结桌比较 , 经上述离子交换柱层析被氯化钠溶液洗脱的含叶绿素组分 ,
不含有 47 扔 和 43 扔 叶绿素结合蛋白 , 3 k D , 24 扔 和 18 切 水溶性蛋白 , 以及捕光色素
中 国 科 学 (B 辑 ) 19 1年
蛋白;而只含有 D l ( 30 山 ) , D Z (犯切 )和 C yt . b59 ( 9 切 )三种多肤组分 (图 2) . 分离胶中加人 6 m ol / L 尿素 , 可大大提高各多肤组分的电泳分辨率 .
2
·
D f D 、 C yt
.蝙复合物的吸收光谱从蚕豆叶 P sl l 颗粒分离得到的 D l一 D f C yt . b s , 复合物的室温吸收光谱 (图 3) 与从菠菜叶
中制备的 D I一 D f C yt . b , 三肤复合物的吸收光谱基本一致 : 在红光区 6 73 mn 处有一叶绿素 a的吸收峰 ;在叶绿素 b 的最大吸收位置完全看不到吸收峰 ; 540 ln 左右的小峰 ,表明有脱镁叶
绿素的存在 ; 46() 一 490 nm Sor et 区具有的吸收肩峰显示有较多类胡萝 卜素存在 ; 41 S lun 处的强烈吸收 , 可能归属于 C yt . b , 的血红素和 (或 )脱镁叶绿素困 .— 一 二 .3 D l一 D、 C yt ·偏复合物的光化学活性
图 4 P sl l颗粒和纯化的 D I一 -Dz C yt . bs , 复合物的光化
学活性
( (
a
) P S l l颗粒以 H 20 还原 C D I P ; ( b )纯化的 D ,一 D Z一 C y t . b s s g
复合物以 D P C 光还原 D C I P . 曲线旁数字表示以微电子当量 ·
哑 一 ’ 叶绿素 · h ’ 为单位的反应速率 )
基本被除去 , 因而提高了以单位叶绿 !
素含量计算的活性水平 · 但是本文制 }备的 P lS l 反应 中心 三 肤复 合物 的 J
D C I P 光还原活性 , 低于除 D l , D : 和 {
C yt
.
b , 外还有 47 功 和 P sl l 反应中 }
心四肤复合物的 D C IP 光还原活性 ` ’刁 . }
4
·
D f D -Z C .yt 蝙复合物的荧光发 }
射光谱 }
在室温 ( 298 K )下 , 用 4 36 nm 光 区激发 D I一 D : C yt · b , 复合物 , 仅在 68 1 匕
nI 处出现 P sl l 特有的发射峰 (图 5 “ 50
N an ba 等旧 从菠菜叶中得到的三肤复合
物未检测有 D P C ~ D C IP 光还原活性 . 本
文制备的蚕豆叶 D 广D了C yt . 编复合物却成功
地检测出有 D P C ~ D C IP 光还原活性 (图 4
( b ) )
, 且有良好的可重复性 . 显然 , 上述纯化
的 P sl l 反应中心三肤复合物含有从 P 68 0 的
电子供体 Z 到稳定原初电子受体 Q A 之 间的
完整电子传递链成分与功能 . 经纯化的 D I一 D :
C yt
.
b , 复合物的 D C I P 光还原速率甚至 比
P sl l颗粒的 H ZO ~ D C IP 光还原速率更高
(图 4 ( a ) ) .据推测可能有两个原因 : 其一是 ,
在 P lS l 颗粒的 D C IP 光还原活性测定中没有
外加人工电子供体 D P ;C 其次是纯化后 的复
合物中作为辅助色素的叶绿素 a 和叶绿素 b
-nO产
Jō.0
( a ) )
, 看不到属于 P S I 的在 730 nm
7哭
气a )
7 5() 6 50
发射 光波长 ( n m )
70 7 50
( b )
处的发射峰 . 显然 ,本文制备的 P sl l 图 5 纯化的 lD 一 -zD C yt bs 腹合物的室温 a( 取低温b( )荧光发牡谱
反应中心三肤复合物排除了 P sl 成分的污染 . 在液氮低温 ( 7 K )下 ,发射峰移至 685 ln (图 5
( b ) )
.
P sl l 颗粒的低温荧光发射光谱 ,在 695 ln 处还可见到一肩峰
. 近年来 , 已有证据表明
第 5期 王 俊等 :蚕豆叶中具 D C IP 光还原活性的 lD 刃荞丫 . bs , 复合物的纯化和特性研究 48 3
68 5 lun 处的荧光发射 ,来源于 P 68+0 和 ph e o Phyt in 一 的电荷重组 “ ’习
.
.5 D l’ D 、 C yt
.
b , 的纯间 n s和 M血2十 . E P R谱
经纯化的蚕豆叶 D l’ D了C yt .嘛 复合物的低温 ( 150 K ) E P R谱 , 也如同 P sl l 颗粒一样 , 出
现 S ign a l l l s , 在连续光照下信号明显增强 (图6( a) ) . 但是 , D I. D f C yt . 嘛 复合物的信号不
如 P 51 1颗粒那样具有清晰的精细结构 (图 6( b ) ) . J o n a th a n 等制备的豌豆 P sl l 的 D I一-zD C yt .
b , 三肤复合物也只有在加入 SiM o( isl ic om ol yM a t e )或 F e C y ( F e币 c ay ih d e )条件下才能检测
出具有精细结构的 is gn a l 115 阅 . E P R谱 is即 a l l l , 的检测及其随光暗转换而改变的结果 ,表明
在纯化的 P sl l 反应中心三肤复合物中 ,存在有能被缓慢氧化的电子供体 D ,且参与了电子传递 .
室温 ( 298 K )下锰的 EP R信号成功地被检测出 (图 7) . 经纯化的 D l’ D : D yt . b , 复合物
也和 M nC I: 标准液一样 , 显示出典型的六条精细谱线 ;在连续光照下 , M价七 EP R 信号强度下
降约 40 % ;光转暗时 , M护+- E P R信号强度又逐渐恢复 .
33 7
.
5 3 39乃 34 1. 5 34 3) 3 45 乃 3 47乃
m T
图 6 纯化的D -I D z, Cyt . 蚝, 复合物 ( a) 和 P sl 颗粒
(b )的低温 ( l刃 K )EP R谱
( L— 照光 , D— 暗光 )
2 9 8 3 1 8 3 3 8 3 5 8 3 7 8 3 9 8
m T
图 7 纯化的D I一-Dz C yt .嘛复合物在暗( D )和照光
( L )条件下的室温 (拼 K )M n Z十一EP R谱
三 、 讨 论
目前已有较多证据表明 ,和光合细菌相似的高等植物 P sl l 反应中心是与 D ,和 D : 蛋白相
联系的「’习. D , 和 D : 蛋白中也有如同光合细菌中 L 和 M 亚基所含的保守氨基酸序列的存在 ,
暗示了高等植物 P sl l 反应中心复合物中也存在有电子传递组分 F e , Q A , Q B , P 680 和脱镁叶
绿素的结合部位 ’` “ · C yt · b , 亚基总是与 D , 和 D Z蛋自共同被纯化出来 ,显示了它们之间结合
的紧密程度 . 在本文实验条件下 ,高电势和低电势两类 C yt . b , 以大致相等的量出现 (具体数
据未给出 ) . 关于 C yt . b , 的作用 , 有人设想 C yt . 蝙在水分解系的组装过程中从 P 680 向
M n +2 传递氧化当量「伙也有人认为 C yt . b , 可在环式电子传递中心 中淬灭多余的激发能 , 因
而起保护作用 l ’ 81 .
与 51, a l l l , 相关的电子供体 D , 据认为可通过还原较高S 态及氧化处于 S 。态的不稳定
中 国 科 学 ( B 辑 ) 1卯1 年
锰而与放氧复合物相互作用「15 . 序列分析和氖化酪氨酸掺人新合成的蛋白质实验 , 表明 iS , a l
1 5的精细结构来源于酪氨酸的质子藕合 , 从而进一步确定了 D 可能是酪氨酸残基 I均 .
近年来 ,更多资料表明锰参与了光合放氧过程 [ ’习. 利用质子驰豫测定技术 , 已得知叶绿体
内含有 M n ( 11 ) , M n ( 111 )和 M n ( I V )等多种氧化态的锰原子 . 用 EP R 技术测定 Z + 的还原
时 , 发现锰原子的氧化态变化与放氧系统的氧化动力学密切相关 lw . 在本实验中 ,只有 M n( 川
才显示出 E P R 信号 . 当对样品进行连续光照时 , M价七E P R 信号强度下降约 40 % , 而且在暗
中可 以逆转 . 这说明 D I一D f C yt . b , 复合物所含的 M护+ 参与了光合作用 ;照光时 , 约有 40 %
的 M n ( 11 )被氧化成 M n ( 111 ) 或 M n ( IV )等较高氧化态 ; 光 转暗时 , 又 回复为 M n ( 11 ) ,
M价+ 一 E P R 信号强度复原 .
特别值得提出的是 , N a n b a 和 sa ot h 从菠菜叶中分离出的三肤复合物未检测出有 D P C
~ D C IP 光还原活性 ,并推测其原因是在制备过程中醒被丢失了压 sl . G o un iar s等在基本按 N a n b a
方法制备的三肤复合物中加人人工分子 D P Q (D e vcl p las t o q u l n o en )或天然 P Q一9 ( lP as ot q切nL o -en
9 ) 时 , 可 测得 D P C ~ D C I P 光还 原 活 性 , 且 能被 D CM U【3一 ( 3, 冷 idc hi o r o P he 叮 l } l ,
1
一山m e th yl ur ea] 抑制闭 . 本文从蚕豆叶片纯化得到的含锰 D l 一D 2’ C yt . b , 三肤复合物具有
D P C ~ D C I P光还原活性的原因 , 可能是由于制备方法的改进 , 使得与 D : 和 D : 蛋白相结合
的醒得以保持· 因而显示了该三肤复合物具有从次级电子供体 z 到稳定原初电子受体 Q、 的
P sl l 电子传递成分与光还原 D C IP 的功能 .
四川大学分析测试中心陈继铺先生协助进行 E P R 测试 ,在此表示感谢 .
参 考 文 献
W i伍 a ms , J
.
C
.
e t a l
. , 尸阳 ` . 刀U tl . A c ad . 及1. U S月 . , 即 ( 198 3 ) , 6 50 5一 6 509 .
oY
u v a n , D
.
C
.
e t a l
. ,
Q 左, 37 ( 19 8 4 ) , 9 4 9一 9 5 7 .
eD ise
n h o fe
r ,
J
.
e t a l
. ,
J
. 材匕1. 刀勿了. , l男 ( 19 84 ) , 3 8 5一 39 8 .
D e i se n h o fe r
,
J
.
e t a l
. , 刀d t叼吧 , 318 ( 19 8 5 ) , 6 1 8一 6 2 4 .
B a r b e
r , J
.
e t a l
. , 尸万万S eL t r . , 220 ( 19 8 7 ) , 67一 7 3 .
N a n b a
,
0
.
& S a ot h
,
K
. , 户阳` . 刃d .tl A “ 心 . & 1 . U S月. , 84 ( 19 8 7 ) , 109 一 1 12 .
o k am
u ar
,
M
·
Y
·
e t a l
· , 尸用 · 7 ht 劲 r . 。叨罗. 助口勿叮 ”功 (E d . iB脚n s , J . ) , v o l . l , D o川 re ch t : 咐h o乐 一9 5 7 ,
3 79 一 38 1 .
D a in e il u s
,
R
.
V
.
e t a l
. ,
F石刀5 及 t . , 2 13 ( 1987 ) , 2 4 1一 24 .
uK aw b
a ar
,
T
·
& M u
r a
ta
,
N
· , 尸如刀 t 0 1 丹邵勿1. , 23 ( 1 9 8 2 ) , 5 3 3一 5 3 9 ·
L a e n u n li
,
U
.
K
. , 八公细理 , 名片( 19 70 ) , 6 8 0一 6 8 5 .
户口 o n , D . 1. , 尸如刀 t 月娜 10 1. , 24 ( 1 94 9 ) , l一 15 ·
aY am
g u e h i
,
N
·
e t a l
· , 尸勿刀 r Q 左川娜勿乙 , 匆 ( 1 9 8 8 ) , 12 3一 12 9 ·
s ieb
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,
M
·
e t a l
· , 尸左功 t 尸h, ` 10 1. , 盯 ( 19 8 8 ) , 3 0 3一 3 0 6 ·
J o n a ht a n
,
H
.
A
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, , 厂石万S eL t r . , 乃 5 ( 1 9 89 ) , 53一 5 8 ·
腼 d花a s s o n , L一 E . & 城 n n护dr , T . , 月川砚. 枷 . 尸如祖t p hys 如1. 尸枷 t 凡or l . 刀勿了. , 洲 19 5 5 ) , 37 9一 4 1 1·
T re b s t
,
T
.
& D ar b e r
,
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. , 尸内口勿母” ht . 彻一 l 0( 19 86 ) , 3 8 1一 3 9 2 ·
M a t ot o
,
A
.
K
.
e t a l
. ,
Q 左, 肠 ( 19 8 9 ) , 24 1一24 6 .
T h o帅 s o n , L · K · & B ru d v ig , G . W . , ioB c hen 公妙 , 27 ( 19 8 8 ) , 6 6 5 3一 6 6 5 8·
B a be o e k
,
G
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T
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. , 尸百刀S 众 t t . , 6 1( 19 7 6 ) , 2 86一 2 8 9 .
G o u
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. , 功酥 , 2叨( 19 8 8 ) , 14 3一 14 7.
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