全 文 ：植 物
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报 t 98 9, 3 1 ( 6 ) : 牛3 2一 4 4。
口 n : C口 二扩f 之 t C口
用二相分配分离法对蚕豆叶
和丝瓜花粉管质膜的分离
王 育东 阎隆飞
(北京农业大学生物学院生物化学教研室 , 北京 10 。。 9 4)
摘 要
二相分配分离法是一种简单而有效的分离植物质膜的方法 。 用这种方法从蚕豆叶和丝瓜
花粉管内分离得到了纯度较高的质膜 。 标志酶测定结果表明 , 质膜对富含聚乙二醇的上相具
有较高的亲和力。 而线粒体膜 、 叶绿体膜 、 肉质网膜 、 液泡膜等则主要存在于界面和富含葡聚
塘的下相液 。 用硅钨酸染色法进行染色的结果表明 ,上相液内含有大量的被染色 的封闭囊泡 。
下相液内则含有大量不被染色的种类各异的囊泡 。 这种质膜染色法的结果与标志酶测定结果
相一致 , 同时说明这种方法也适 用于植物绿色叶片质的提取 。
关钮词 原生质膜 ;二相系统 ; 标志酶
T H E ISO L A T IO N O F P L A S M A M E M B R A N E F R O M V I C I A
矛该 B A L E A V E S A N D P O L L E N T U B E S O F L U 矛不谈
C Y L I那 D R I C A B Y T H E T W O 一 P O L Y M E R
P H A S E S Y S T E M
W a n g Y u一 o n g a n d Y a n L o n g 一 f o i ( L . F . Y e n )
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A b s t r a e t
A m e t h o d f o r t h e is o la t i o n o f p la s m a m e m b
r a n e e n r i e ll e d f r a e t io n f r o m p l a n t s o u r e e o i ,
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本文 于 l , 8 8 手 6 月收到 , 1 9 8 8 年 口 月收到修改搞。
王育东等 : 用二相分配分离法对蚕豆叶和丝瓜花粉管质膜的分离
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g r e e n t i s s u e s o f P la n t s
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K e y w o r d s p l
a sm a m e rn b r a n e ; T w o
一
p h a s e s y s t e m ; M
a r k e r e n z y m e
植物原生质膜在细胞的生命活动中起着极为重要的作用 。 过去主要依靠蔗糖密度梯
度离心法提取质膜1z[ 一 `4] 。 这个方法主要是依据分离物的密度和颗粒的大小来分离的 , 很
难将密度相同而性质不同的膜分开 。 所提取的质膜易受线粒体膜的污染 , 而且提取时间
长 , 获得样品量少 。 A lb e r t s s o n ( 19 , s , 1 9 7 1 )〔, , ` , 首先将二相分配分离法 ( A q u e o u s p o -
l y m e r t w 。 一 p h a s e : ys t e m ) 引人到质膜的分离中来 , 首先成功地用于动物原生质膜的
分离 ` 6] 。 近几年 , 这个 方法也被引人到植物质膜 、 线粒体 、 叶绿体 、 内质网等的分离中
来〔玩 ` 6· `二 “ 。 研究植物叶片质膜的性质对于了解光合产物的跨膜运送 , 膜的结构 和功能等
机理是十分重要的 。 由于分离过程中易受叶绿体膜等的污染 , 所以迄今有关叶片质膜的
分离工作很少报道 。 花粉管内原生质的极向流动很可能与质膜的结构有关 。 我们从蚕豆
叶 和丝瓜花粉管原生质体为材料 , 证明用二相分配分离法能分离得到较纯的蚕豆叶质膜
和丝瓜花粉管质膜 。
材 料 和 方 法
(一 ) 蚕豆叶和丝瓜花粉管原生质体的制备
取 50 9 新鲜的蚕豆 ( iV ` ia aj 乡。 ) 叶片 ,撕去下表皮 , 浸人 1 5 m l 含有 1多 纤维素酶 ,
0
·
5务 果胶酶 , 0 . 5 m o l / l e a e l Z 和 o . s m o l八山梨醇溶液中。于 3 7 oc 下保温 2一 3 小时 。 以低
速离心收集完整的原生质体 。 用 0 . 5 m 。 1 / 1山梨醇等渗液洗涤原生质体 3 次 , 每次均以低
速离心收集完整的原生贡体 。
上午采集丝瓜 ( L u f f a c y z i n j r i c 。 ) 花 , 将花粉扫人 Zo o m l 培养液内 (含 2 0多蔗糖 ,
。 . 01 多 硼酸 , 0 . 1多ca 1C 2 ) 。 置 25 ℃下培养 2一 3 小时 。 待花粉管伸长后 , 其长度相当于花
粉粒直径的 4一 , 倍时 , 用 40 0 目镍丝网滤出萌发的花粉 , 将其转移到含有 30 多 蔗糖 。 1关
纤维素酶 , 0 . 5多 果胶酶的溶液中 , 水解 2一 3 小时 。 原生质体则从花粉管尖端逸出 . 再用
4 0 目镍丝网滤去花粉管 , 以低速离心收集完整的原生质体 。 原生质体洗涤方式同上 。
(二 ) 二相分配分离系统的配制
以 0 . 2 , m o生八 蔗塘 、 1m o o l八 M g s O ; 、 s m m o l八 磷酸缓冲液 ( p H夕. 5 ) 配制含有`不
同浓度 (w / v ) 的葡聚岭T ” 0“ 和聚乙二醇 “ “ 0” (表 ` )的溶液 · 配制程序参照 lA be r st s -
。 n 〔` , ” 和 w i d e l l , `。 , ` , ’ 等的工作 。
(三 ) 原生质膜的分离
将完整的原生质体悬浮在 l o o m l 含有 0 . 2 , m。 l八 山梨醇 l m m 。 l八 E n T A 、 , m m o l / l
M gs o
, 、 1Om m o l/ rT is
一
H CI 闭 夕. 4 的缓冲被中。 将原生质体悬浮液吸入装有 8 号
针头的注射器内 , 用力挤压 , 使原生质体在经过针头时破裂 。 或者用新鲜叶找穿书捧缓冲
物 学 报 3 1二卷
液 中匀浆 。 匀浆液经 9, 0 0 0 X g 离心 2 0 分钟 , 去除沉淀 。 上清液经 3 0 , 0 0 0 X g 离心 l 小
时 。 收集沉淀并使之悬浮于 1 0 m l 上述缓冲液中 , 即为质膜粗提液 M (m i c r 。 s 。 m e f r a 。 it -
。 n ) o 在 s om l 离心管内加入二相溶液各 l o m l , 再加人 2 m l 质膜粗提液 。 用盖子盘紧离心
管 , 反复倒转 20 次 , 使样品与二相液充分混合 。 混合液以水平转头离心 10 仙 x g 4 分
钟 。 这时在两相液之间形成界面 。 小心吸出上相液 (不可触动界面 ) 注人另 一个离心管
内 。 这个组分为初步提纯的质膜 U , ( u p p e r , ) , 其界面及下相液即为 L l ( lo w e r , ) 。 分别用
重蒸馏水洗涤 3 次 , 每次均以 30 0 0 x g 离心 1 小时 , 收集沉淀 。 使之悬浮于 l m l 上述提
取液内 。 洗涤前 , 若向组分 U , 中加入新的下相液 10 m l , 充分混合后仍用水平转 头离心
1 0 0 0 X g 4 分钟 ,进行第二级分离 , 分层后上相液即为二次纯化的质膜 U Z (叩 p e r Z ) , 其下
相液即为组分 U ZL 。 各组分经洗涤后 ,使悬浮于 l m l 提取液内 , 置 一 30 ℃ 下保存川 。
( 四 ) 标志酶 (物 )的测定
1
.
M g
, + , K + 一 A T P 酶 在 l m l 含有 3 m m o l八 A T p , s o m m o l八 K c x , sm m o l / 1
M g C 1
2 , 50 m m o l八 介 15一 H C I pH 6 . 5 溶液中加人 3 0一 弓O群1约含 1 0 0一 2 0 0 拜g 膜蛋 白的样
品 ,置 37 ℃ 水浴中反应 45 分钟 。 加人 2 m l l0 务 三氯乙酸 中止反应「8] 。 无机磷的测定
参照 L e be l ( 1 9 7 5) 9[] 的方法 , 测定出反应液在 78 o n m 处的光吸收值 。 计算每毫克蛋白
引起光吸收值的变化作为相对活性 (△ O D 7 8 0 /m g 蛋白 · 45 分钟 ) 。
2
. 细胞色素 c 氧化酶 测定参照 H o d ge s 的方法 ( 1 9沁 ) 〔7」。 在 。 . s m l 还原的细胞 色
素 C 溶液 (在 s om m o l / l 磷酸缓冲液 , p H 7 . , , 2 0 拜m o l / ] 细胞色素 e , 0 . 0弓务 T r i t o n x
1 0 0 中加人 5一 10 粒连二亚硫酸钠 ,使溶液呈浅橙色 。 现 1犯现用。 )内加入 10 一 3 0川 含
膜蛋白约 50 一 1 0 产g 的样品。 测定 5 5 0n m 波长下 4 分钟内光吸收值的变化 。 计算每
分钟每毫克蛋白质引起的光吸收值的变化作为相对活性 (△ 0 D 5 5 0 /m g 蛋白 ·分 ) 。
3
. 还原型辅酶 I 细胞色素 c 还原酶 和还原型辅酶 H 细胞色素 c 还原酶 在 o . s m l 反
应液 ( s o m m o l / l 磷酸缓冲液 , p H 7 . 5 , 2 0 产m o l八 细胞色素 C , l m m o l八 K C N , 8 0 ,
, ` m o l / 1 N A D p H 或 N A D H )【, , 内加人 10一 3 0拜 l含膜蛋 白约为 5 0一 1 0 0 0 9 的样品 。 测
定 斗分钟内 5 5 0n m 波长下光吸收值的增加 。 计算每毫克蛋白每分钟引起的光吸收值的
变化作为相对活性 (△ o D亏, 0 /m g 蛋白 ·分 ) 。
.4 叶绿素 向 知川膜样品内加人 3 m l含有 8 0`务 的丙酮水溶液 , 充分混合后过滤 . 滤
液在 65 2n m 下测定光吸收值 。 按照公式 : 叶绿素 ( g / l) ~ O D 6 5 2 / 3斗. 5 计算叶绿素含
量 ,并计算每毫克蛋白样品内含叶绿素的毫克值作为相对含量 ( m g · 叶绿素 /m g · 蛋白 ) 。
,
. 膜蛋白含量的测定 参照改良的 L o w yr 方法 ( 1 95 1 )山」。
(五 ) 电镜切片制法
植物膜样品悬液 (约 2 0 雌 蛋白 /m l) 与 65 ℃ 的 1 . , 多 的琼脂按 ! : 1 ( v / v ) 混合 。
待琼脂凝固后 , 将其切成 l m m , 小块 。 用 2% 戊二醛固定 , 洗涤后用 1多 0 00 . 固定 、 脱
水 、干燥 、包埋等参照朱丽霞等 ( 1 98 3 ) 〔2 ,的方法 。
(六 ) 电镜切片上的质膜特殊染色法
用厚度为 0 . 2 m m 聚氯乙烯塑料薄膜剪成水滴状 。 圆端直径 4 m m 。 在圆端中央打直
径为 1 . s m m 圆孔 。 用镊子夹住小环的尖端 , 将小环平放在切片机水面上 , 使 圆端小孔.套住
切片。 轻轻提起小环 ,使小环 圆孔内形成水膜 , 切片则悬浮在水膜上 。将小环放在 ! 多 ( w /
` 期 王育东等 :用二相分配分离法对蚕豆叶和丝瓜花粉管质膜的分离
v) 高碘酸溶液表面浸 1 , 分钟 , 再将其轻轻提起 , 转移到蒸馏水表面浸洗 5 分钟 。 共
浸洗 , 次。 将小环放在 1呢 (W /V )硅钨酸溶液表面 , 于 37 ℃ 下浸 10 分钟 。 再将小环转
移到蒸馏水表面洗涤 ,洗涤方法同上 。 在染色过程中应十分谨慎 , 勿使水膜破裂而造成切
片丢失。 将小环的悬浮有切片的水膜平放在铜网上 , 切片则被转移到铜网上 。 干燥后于
J E O L I OO e x 电子显微镜下观察。 参照 W id e l l 等 ( 19 8 3 ) L, , ,和 R o l a n d 〔, , , ( 19 7 8 ) 的方法
进行。
实 验 结 果
要获得纯度较高的质膜 , 首先要选择适宜的二相系统 。 本文所采用的二相液的缓冲
液和离子组成是 目前广泛采用的。 这里主要进行聚合物浓度的选择 。 在分离蚕豆叶质膜
中 , 配制 了一系列不同浓度的聚合物系统 (表 l ) 。 葡聚糖 T 5 0 和聚乙二醇 6 0 0 0 的浓度
变化在 6 , 0 % 和 7 . 0 % 之间 。 据报道 L19 分离绿色组织质膜的主要污染物是线粒体膜和叶
表 1
f a b l e l 飞` h e s e P a r a t i o n 、、 圭
不同浓度 的二相系统对蚕豆叶 原生质膜的分离 *
P l a s m
a
m
七
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r a n e :
、
* v i c i a 了a / a l e a v e s i n d i f f e r e n t r w o 一 P h a s e s *
二相组成
C o m 组分
P a r t s
M g
’ + , K + 一 A T P 酶
M g
’ 丫 , K + 一 A T P a s e
细胞 色素 C 氧化酶
C v t e
o x i d a s e
日一十绿素
C h l o r o P h y l l
蛋白质
P r o t e i n
黑
D e x d r a n / P E G 相 对活性
R A
’ )
分离率
P%
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相对活性
R A
分离率
P%
相对食量
K C
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分离率
P%
总量
T o t a l
分离率
P%
几万万 - …一石石一 {不万;万-巨万}不丽;…下可{一画一2 · 2 0 6 … 、 6 ` 艺 } ” “ U { ) , ’ 吕 1 。 ’ O 斗 , } 。 ” ’ ” 1 ` ’ ”兰
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. n , l一 5 1 ) R ^ : R。 1a t i 、 e a c t i、 i t , : z ) P% : p a r t i ti o n% : 3 ) R C : R e ! a r i v e c o n t a n t。
绿休膜。 所以选择 . M g Z+ , K 十 一 A T P 酶 , 细胞色素 c 氧化酶和叶绿素作为标志酶或标志
物 , 以追踪各种膜的分离情况 。 随着聚合物浓度的变化 , 上述 3 种标志酶 (或标志物 )表现
出规律性的变化。 M g计 , K 十一 A T P 酶在 6 . 1 / 6 . 1 系统里 (两种聚合物的浓度各为 6 . 1多 ) 的
上相中分离率最高 ,达 4 0关以上 。其它各系统中的分离率均低于此值 。 细胞色素 c 氧化酶
在 6 . 4 / .6 呼系统里分离率最高 。 在 6 . 1 / 6 . 1 系统里则有所下降 。 在 6 . 1 / 6 . 1系统里 ,叶绿素
的分离率达 30 拓。 以上是用二相系统进行一级分离的情况 , 由此确定选用 6 . 1 / 6 . 1这个
系统进行二级分离。
植 物 学 报 31 卷
用 6 .1 /6 .1 系统对蚕豆叶质膜进行二级分离 , 可从微粒组分 M 中分离出 4 个组分 。 它
们是从一级分离中得到的上相组分 U 、 和下相组分 L , , 用 u : 进行二级分离得到的上相组
分 U Z 和下相组分 U ZL 。 5 种标志酶 (或标志物 )测定结果参看表 2 。
表 2 用 6 . 1/ 6 , 1 二相系统对蚕豆叶原生质膜的二级分离 *
T a b l e 2 T h 。 , e p a r o t i o n o f p l a
、
1。 ` m e m b r a n e o f F i c i a 沂a 乙。 l o a v e s i n a n a q u e o u s
p o {、 m o t、 、 。 一 p飞1。 · 。 、 ` 。 m ( 6 . 1% D e x t r a n 6
.
1% P E G ) 扣一. 一 . . . ~ . . . . . ~ . . . . .半 n 二 2一 3。M g ,十 , K 十 一 A T P 酶在 U Z 里的相对活性最高 , 其次是 L : 。 在 u 、 和 U ZL 中都较低 , 表现为双重分布 。 在 U , 里的分离率达 40 外以上 , 而在 U Z 里则提高到 60 呱 。 说明该酶对上相液有较高的亲和力 。 其它 斗种标志酶 (或标志物 )主要分布在下相 U ZL 和 L , 里面 。 且在 U Z L 中的分离率一般都高于初级分离下相 L , 中的分离率 。 而在上相的分离率却有明
显的下降 。 细胞色素 C 氧化酶在 U , 里为 40 多 以上 , 在 U Z 里则下降到 17 关 。 还原型辅
酶 I 细胞色素 C 还原酶的分离率由 37 呱,下降到 2 并。 . 还原型辅酶 H 细胞色素 C 还原酶
由 4 8并下降到 17多乙说明这 斗种非质膜标志酶 (或标志物 ) 对上相的亲和力较低而对下
相有较大的亲和力。 蛋白质的分离情况与 M g Z十 , K + 一 A T P 酶很相似 。 它主要分布在 L .
里 。 在上相的分离率由 2 % 上升到 34 务。 结果说明 , 在 6 . 1 / 6 , i 系统里 , 蚕豆叶质膜对
上相液有较大亲和力 , 而线粒体膜 , 叶绿体膜 , 内质网膜和液泡膜对下相液有较大的亲和
力 。 蛋 白质在上相液内分离率的增加可以认为是由质膜引起的 , 因为上述所有标志酶 (或
王育东等 :用二相分配分离法对蚕豆叶和丝瓜花粉管质膜的分离
标志物 )中只有 M g, + , K + 一 A T P 酶在上相内的分离率是增加的 。 用该二相系统若进行更
多级分离 , 可得到纯度更高的蚕豆叶质膜 。
用二相分配分离法分离丝瓜花粉管质膜的结果与分离蚕豆叶质膜的结果是一 致 的 .
在所选择的 4 个二相聚合物浓度组合中 (表 3 ) , 随着聚合物浓度的变化 , 各种标志酶也
表现出规律性的变化 。 在 4 种聚合物浓度条件下 , M g +2 , K 十一 A T P 酶的分离率均在 如多
以上 , 其中最高的达 80 外 以上 。 细胞色素 c 氧化酶的分离率基本上在 30 外 以下 。 选择
表中低浓度的系统更有利于质膜的分离 。
表 3 不 同浓度的二相 系统对 丝瓜花粉管原生质膜的分离 *
T a b l e 3 T h e s e P a r a t i o n
o f P i a s m
d
m
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m b
r a n e o 士 P o l l e n t u b e s o f
L u j j a c y l i , d
r万, c a i n d i f f e r e n t tw o 一 p h a s e s *
细胞色素 c 氧化酶
二相组成
C
(〕
m P
( J s
i t i o n
o t P h a s e s
D以 d r a n / P E G
M g
Z+ ,
M g
Z+ ,
K +
一
A T P 酶
K +
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A T P a s e C y t C o x i d a s e
组分
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分离率
P a r ti t i o n
%
相对活性
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分离率
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酶的相对活性始终在上相里较高 , 特别是在 U Z 中 。 在上相中的分离率由 75 务 增加到
92 多。 其它 3 种标志酶主要分布在下相液内 。 它们在上相液内 , 尤其是在第二级分离的上
相液内( U Z )相对活性最低。 细胞色素 c 氧化酶的分离率 由 29 多下降到 16 外 。还原型辅酶
1 细胞色素 c 还原酶的分离率由 17 关 下降到 12 外。 还原型辅酶 I 细胞色素 c 还原酶的
分离率由 5多上升到 29 多。但它在 U , 中的相对活性最低 , 仅占各组分总和的 3 . 5外。 这说
明丝瓜花粉管质膜对该系统的上相有较大的亲和力 , 各种非质膜对下相有较大的亲和力。
蛋白质的分离情况表现为双重分布 。 即在 U , 和 L : 中的相对含量较高 。 U Z 中蛋白质分离
率的提高可认为是由于质膜引起的 。 L L 中蛋白质相对含量的增高是由于大量非质膜进人
下相引起的 。 综上所述 , 说明 二相分配分离法也适宜于分离花粉管质膜 。
用铅和铀的负染法对蚕豆叶的组分 U : 进行染色 ,在 电子显微镜下观察可看到大量的
椭圆形囊泡以及少量的不成囊泡的碎片 (图 1 ) 。
硅钨酸染色法 ( S T A ) 是对质膜的特殊染色法 , 并已成功地应用到植物材料质膜鉴
定中 。 对蚕豆叶片进行组织染色 , 在电子显微镜下观察发现 ,它主要对质膜染色 (图 2人 ) .
对其它细胞结构基本不染色 。 对蚕豆叶富含质膜的组分 u , 和富含非质膜组分 L孟理秘…
S T A 染色发现 , 在组分 u : 中含有大量的被染色的封闭囊泡 (图 2 , B 、 c ) 。 大戮麟涟绪罗


4 40植 物 学 报 3 1卷
染色法同样适用于植物的绿色组织质膜染色 。
许多研究者在分离植物材料的质膜时多采用匀浆法 。 我们的实验表明 , 用叶片直接
匀浆与用原生质体分离质膜的方法相比 , 各种标志酶在二相系统中的分布情况是极为相
似的。 所不同的是 , 利用原生质体分离得到的质膜的纯度略高些 , 所得到样品的相对量也
略大些 。
参 考 文 献
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