全 文 ：植 物 学 报 1 9 9 3 , 3 5 ( 4 ) : 2呜 ,一 2 , 4
滩 e t口 B o t叨 i e a s 谊n i e .
悬浮培养桐叶械细胞中 N P A
结合位点的特性与功能 *
张德颐 邢 惕 陈 瑞 王怀军 丁如贤
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2 0 0 03 2 )
摘 要
在桐叶械 ( A : 。 , 户s。 。 J o户l a , a , 。 , L . ) 悬浮培养细胞的膜组分上有 N p A ( N 一 z一 n a p h t b y l
P at h o l a m ic ` 。记 ) 专一结合位点 。 它与 N P A 有高亲和力 。 它们的平衡解离常数 ( K d 值 )
为 7 · 5 x l丁 , m ol / L 。 在 4℃ 保温 60 分钟 , N P A 的结合量达最高点 ,平衡状态至少可维持 2
小时 。 人工合成的生长素类物质: l 一 N A A ( 卜蔡乙酸 ) 、 2 一 N A A 、 2 , 4 一 D 以及生长素运输抑
制剂 2 , 3 , , 一 IT B A (三碘苯甲酸 ) 均能与 N P A 竞争同一结合位点 。 这些物质与此结合位点
的 K d 值范围为 1 0一 斗一 l r 喻 。 l /L 之间 。 实验表明 : N P A 结合位点可能在调节细胞内 IA A
水平上起作用 ,从而影响细胞的生长 。
关键词 N P A 结合位点 ;桐叶械 ;生长素
A M E M B R A N E
一B O U N D N P A 一B I N D I N G S I T E I N A C E R P S E .U
D O 尸L A T A N U S L . S U S P E N S IO N C U L T U R E C E L L S
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T h e s e bi n d i n g s i t e s e o u l d be i n v o l v e d i n t h e
r e g u l a -
t i o n o f i n t r a e e l l u l a r IA A Ie v e l
, t h e r e by a f f e e t i n g c e l l g r o w t h
.
K e y w
o r d s N p A
一
b i n d i n g s i t e ; A c e r P了e u d o P l a : a 作 u s L . ; A u x i n
收稿日期 : 1 9 9 1一 12 一 2 9 接受 日期 : 1 9 9 2一 0 3一 1 1
. 国家自然科学基金资助课题 。
植 物 学 报 3弓卷
IA A 在植物组织 、 细胞之间不断移动和运转 ,从而表现 出它的生物学效应 。 I A A 在
细胞中的含量 ,除了受 I A A 合成与降解系统影响外 , 更重要的是为 I A A 进人与流出系
统所左右。 M o r g a n 和 s o d i n g ( 1 95 8 ) ` , 3J 发现 N p A ( N 一 1一 n a p h t h y l p a t h a l a m i c a e id )
有抑制 IA A 运转的功能。 R ub er y 等 ( 197 4 )叫指出 , N P A 只是抑制 IA A 从细胞中的
流出 , 并不阻碍它的进人 , 从而经 N P A 处理的细胞使 IA A 累积量明显增多。 H er elt
( 1 98 3 )叨 证明经 N P A 处理的培养细胞 、 组织碎片及膜小泡 , 其 IA A 都有增加 。 L e m be
等 ( 19 7 1 )图首先发现 N PA 结合位点的存在 。 J ac ob s 等 ( 1 9 8 3 ) Bj[ 指 出 , N P A 结合位
点是在豌豆苗的茎基部细胞中 , 并与 IA A 起作用。 本文以悬浮培养的桐叶械细胞为材
料 ,研究 N P A 结合位点的生化特性 , IA A 流出细胞的载体和细胞中 IA A 含量的动态
变化 , 以及对细胞分裂的调节作用 ,并注意 I A A 流出载体与 N P A 专一结合的情况。
材 料 和 方 法
(一 ) 细胞培养
桐叶械 ( A ` e r P : e “ d o P l a ,。 。 “ , L . ) 细胞培养在 s t u a r t 和 s r r e e t ( 2 9 7一) t“ , 的培
养液中 ,不加激动素和尿素 。 2 50 m l 的三角瓶中先放人 60 m l 新鲜培养液 ,然后加人 10ml
已经培养了 21 天的 、处于稳定状态的培养材料 , 置于连续光照 ( 50 0 l x) 下 , 25 ℃ 摇床
上 , 1 2 0转 /分 。
(二 ) 生长参数
用 H e n s h a w 等 ( 1 9 6 6 ) 〔` ,的方法测定。
(三 ) 细胞膜组分的制备
N P A 结合位点的提取主要根据 M a an 等 ( 1 9 8 5 )姗的方法 。全部过程在 4℃ 中进行 。
细胞经纱布过滤 , 用冰冷的蒸馏水冲洗 2 次。 在研抹中匀浆 6一 8 分钟 ,匀浆时加人 2 倍
体积的缓冲液 ( 5 0 m m o l / L M E s 一 T r i s p H 4 . 0 , 1 0 m m o l / L M g C 12 , 0 . 5 m o l / L 蔗糖 ) 。
匀浆液离心 4 0 0 09 15 分钟 ,取上清液 ,再离心 5 0 0 0 09 60 分钟。 沉淀即膜组分 ,重新悬
浮在缓冲液中 ,每毫升缓冲液中含 1一 3 9 鲜重的沉淀物 。
( 四 ) 结合力的测定
将 4 x l o一 `。 m o l / L ’ H 一 N P A (比强为 1 5 m Ci /m m o l ) 及不 同量的非标记的 N P A
(从 。到 10 一 4m ol / L ) 加人到膜制备液中 ,最终体积为 .2 5m l 。 混和后在 4℃ 保温 60 分
钟 ,并轻轻振荡 。 然后离心 75 0 0 x g 45 分钟。 测上清液中的放射性强度作为游离的
NP A 量。 沉淀物经洗涤及再离心后 , 沉淀里加人乙醇 , 在室尽中保温过夜 。 沉淀再用
Zm l 酒精洗 3 次 , 沉淀移人小玻璃瓶中测放射性强度。 以只加 ’ H 一 N P A , 不加非标记
N P A 的测得结果作为总结合 。 除加 ’ H 一 N P A 外 ,又加人 1 0一 ` m ol / L 非标记 N P A 的
结果 , 作为非专一结合。 由总结合减非专一结合的差 , 为专一性结合。
(五 ) 结合与解离实验
为了了解 N P A 与其结合位点相互结合的动态变化 , 将膜制备 液 加 人 到 4 x l 。一 10
m ol / L
’
H
一
N P A 及 士 10 一` m ol / L 非标记 N P A 的溶液中 ,总体积都是 2 . , m l 在混和后
开始计时并不断从中取出样品 ,在 80 分钟时间里共取样 10 次 。 样品立即通过玻璃丝滤
膜 , 膜上沉淀物再用 2 . 5m l M E s 一 T ir s 缓冲液冲洗 ,全过程 20 秒 内完成。 保温 80 分钟后 ,
张德颐等 : 悬浮培养桐叶械细胞中 N PA 结合位点的特性与功能
将非标记的 N P A 加人到前期未加非标记 N P A 的试管中 , 使最终浓度达到 1 0一 ` m ol / L ,
然后不断从中取出样 品 , 以探索前期已经结合的 ’ H 一 N P A 从膜组分上解离下来的速度 。
全部在玻璃 丝滤膜上的样品连滤膜一起放人小玻璃瓶中 ,各加闪烁液 ,计放射性强度 。
(六 ) 竞争性试验
膜制备液加人 4 x l 。一 `。 m ol / L ’ H 一 N P A 外 , 又加人非标记的竞争剂。 同上述进程测
定游离的和结合的 N P A 。 K d 值的侧定是根据竞争剂加人的浓度。 当竞 争 剂 加 人后 ,
N P A 专一结合的值下降 50 多 时 ,作为其 K do
(七 ) IA A 测定
将 50 0 m l 培养物 ,经过纱布过滤 。 将细胞在液氮中冷冻 , 然后经冷冻千燥 , 存放于
一 2 0℃。 按照 B l a k e s l e y 的方法 “ 习测定 I A A 含量 。
实 验 结 果
(一 ) 结合的动力学
1
. 州 对 N PA 结合的影响 调整缓冲液中 T ir s 的量 ,使结合反应在不同的 p H 下
进行 。 图 l 表明 , 专一结合的最适 p H 是 4 ,非专一结合在 p H 4一 7 范围内无明显改变 。
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非专一结合
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图 1 p H 对 N P A 专一结合与非专一结合的影响 图 2 N P A 结合活力的迅速逆转
F i g
.
1 E f f e e t o f p H o 习 s p e e i f i e a n d 刀 0 0 F i g . 2 R a p i d r e v e r s i b i l i t y o f N P A
一
s p e e i f i` b i n d i n g o f N P A b i n d i n g a c t i v i t y
2
. 结合和解离 结合位点 ( B S ) 与 N P A 之间的结合反应是可逆的 。 即
k十 玉
B s + N P A 只井二 = = 乏 Bs 一 N P A一产生效应
k + 1 是动力学结合常数 ; k 一 l 是动力学解离常数 。
图 2 证明了此可逆反应的存在 。
桐叶械悬浮培养细胞中提取的膜组分与 ’ H 一 N P A 一起保温 。 在 80 分钟的保温时间
里连续取样 10 次 , 图 2 结果显示 , 在保温最初的 60 分钟内 , 专一结合的 ’ H 一 N P A 量不
断增加。 60 分钟后解离和结合达到平衡 ,专一结合的 ’ H一 N P A 量稳定在一个高水平上 。
习。分钟时将保温的反应系统分别放 在两 个 试管中 。 一管继续保温的作为对照 , 另一管
加人非标记的 N P A , 使 N P A 最终浓度达到 1 0一 ` m ol / L 。 未加非标记 N P A 的对照管
植 物 学 报 玉5 卷
于 1 20 及 1 60 分钟再取样两次 , ’ H一 N P A 专一结合量一直维持在高水平上 , 显示平衡状
态 至少可维持约 2 小时 。 加人非标记 N P A 的管
中 ,在加人后的 80 分钟 内取样 9 次 。 由于非标记
N P A 量远远大于 ` H 一 N P A 量 , 故在加入非标记
N P A 后仅几分钟 , 结合位点上 ’ H 一 N PA 专一结
合量就迅速降低到对照的 l / 3 。 到 1 60 分钟时已
测不出专一结合 ’ H 一 N P A 。 另外 ,非专一结合在加
人 大量非标记的 N P A 后迅速解离 , 立即就测不
到非专一结合的 `H 一 N P A 的量 , 这与 T r i l l m i c h
等的结果口 0J是一致的 。
3
. 结合力 按 照 s e a t e h a r d ( 1 9 4 9 ) 「1 5] 方法
测定了结合位点与 N P A 结合的特性 (图 3) 。 曲
线左侧是迅速跌落的部分 , 呈现出低的容量和高
的结合力 , 这是专一结合部分 ;而曲线右侧是非专
一结合 , 其容量大 , 但结合力低 。 计算出专一
结合的 K d 值 7 . 6 士 2 . 5 x 1 0一 , m o l / L ( n 一 1 1) o
4
. 竞争性试验 l 一 N A A , 2 一 N A A , 2 , 4一 D都
能与 N P A 竟争同一结合位点 , 其 K d 值在 10 一 ,一
10 一` m ol / L 之间 。 I A A 也能与 N P A 竞争同一
八飞一x叼匕、`
B丈n m o l)
图 3 N P A 结合的 S c a t c h a r d 图
B
. 结合配基 F . 游离配基
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3 S e a t e h a r d p lo t o f N P A b i n d i o g
B
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图 4 对 N P A 结合位点的竞争
C o m P o t i t i o n f o r N P A b i n d i n g s i t e s
张德颐等 : 悬浮培养桐叶械细胞中 N PA 结合位点的特性与功能
结合位点 。 只是 认 A 的结合力较低 , K d值大于
构类似物并不参与竞争 , 生长素运输抑制剂
IT B A (三碘苯 甲酸 )也有竞争活力 , K d值约
10
一 `
m ol / L
。 色氨酸是 认 A 的结
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ǎ一习尹bl父节Edé`éù动曾ù吧二几丈Z担狡如概V山名1 0 一 6 m o l / L (图 4 ) 。
(三 ) N P A 结合位点 的 t 与 细 胞 中
IA A 含量的相互关系以及它们对细胞 分 裂
素的影响
在细胞培养过程中 , N P A 结合位点的
数量 ( p m o l 1 0一 8 细胞 ) 是在不断变化的 , 从
图 5可见 , N P A 结合位点有两个峰 , 第一个
峰在培养后的第 l 天到第 5 天之间 , 另一峰
在培养后 14 天出现 , 而在第 9 天有一个低谷 。
在培养期间 IA A 含量的高峰出现在第 8一 9
天 , 正巧在 N P A 结合位点落人低谷之时 。这
与公认的 N P A 可以抑制 I A A 外流 ,增加细
胞 中 I A A 积累的见解相一致 。 可能细胞 中
I A A 水平与 N P A 结合位点之间有着内在的
联系 。 图 5 中还可 看到 ,细胞数的增长呈 S 形
曲线 , 在第 5一巧 天之间是细胞的指数生长
期 ,而在细胞快速增长时 , 正是 I A A 含量的
高峰 。
5 10 一 15 一 20摘养夭效 D娜 。 f e u ! u` .
图 , 培养过程中 N P A 结合位点 、 细胞内 I A人
含量 、 细胞数的变化情况
0 … 0 I A A 浓度 △一△ N P A 结合位点
. 一 . 细胞数
F i g
.
5 T h e n u m b e r o f N p A b i n d i n g s i t e .
a n d t h o i n t r a e e l l往 l a r I A A e o n e e n t r at i o n
i n b a t c h e s o f c u l t u r e c y e l e
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` i t . s . 一 . C . 11 n u m b e r
讨 论
(一 ) 最适 p H
本试验 表明在桐叶械细胞中有 N P A 结合位点 ,它的最适 p H 为 4 . 0。 这与 M a n
等 ( 1 9 8 5) 〔10J 从烟草悬浮培养细胞中测得的 N P A 结合位点的最适 p H 是相似的 。 uS s o m a n
和 G a r d n er ( 1 9 8 0) 〔川 从玉米芽鞘中得到可溶性的 N P A 结合位点 ,它的最适 p H 也是
4
.
0。 但是他们认为当此结合位点在膜组分上时的最适 p H 为 5 . 0。 非专一结合在 p H 4
以上时都无明显影响 。 T ir t on 1 0 也不影响结合 。
(二 ) K d 值
我们测得的 N P A 结合位点的 K d 值与 M a an 等 ( 19 8 5 ) lt0J 从烟草培养细胞测得的
很相似 。 但比从玉米芽鞘中测得的 K d fg, 17 一 l9J 降低了 10 一 1 0 倍 。 至于 I A A 与 N P A
结合位点的 K d 值 , 我们的结果和以往的报道 〔10, ’ 71都是一致的 ( K d > 10一咭m o l /L )。 然
而不能把 N P A 结合位点看作是 I A A 流出细胞的载体 , 因为它们之间的亲和力太低。较
好解释是由 D eP t a 和 tR l b er y ( 1 98 4 ) E” 提出的 “ 三点 ” 说 , 认为 I A A 流出细胞的载体
有 3个位点组成 。 “ 三点 ” 说认为 N P A 结合位点虽然与 I A A 运出细胞有密切的关系 ,但
究竟不是同一个位点 。 所以在我们的竞争试验中 , 虽然 I A A 不能强有力地替代 N P A ,
但仍有部分竟争能力 , 这是由于 N P人 结合位点是处在这个载体的复合体上 。
2 , 4 植 物 学 报 35 卷
IA A 的合成和降解 ,可逆地与载体的结合和解离 ,可能在调节植物体内 认 A 的含量
及把 I A A 运转到存储库中等都起着重要的作用 。 但是 , 在细胞水平 , 膜运转系统 (特别是
I A A 流出载体 )对 IA A 的极性运输和在细胞中的积累 ,起着调节作用 。 当前 ,在测定 I A A
与载体的结合能力还存在许多困难的情况下 , 测量 N P A 结合位点的量可以作为一个指
标用来了解 I A A 含量的升降及其分配情况 。 如果载体是在膜上 , 并且不断地在破坏 , 而
又有新合成的载体参人到膜上来 , 那么此周转过程将决定着载体在细胞膜上的量 , 也决
定着 I A A 的流出。 遗憾的是 , 至今还很少知道这方面的情况及 IA A 出人细胞的细节。
本文的研究结果表明 , 当 N P A 结合位点减少时 ,细胞中 I A A 的量增加 , 反之亦然 (图 5 ) 。
本文也表明 , I A A 含量高峰正巧在细胞的指数生长期 。 N PA 结合位点的 增 减 可 能对
IA A 含量有影响 , 而 认 A 含量又控制着细胞分裂。 此结果表明 , 细胞内可能有一个复
杂的调节机构 , 而 I A A 流出载体的合成 ,活化与失活在其中起作用 。
参 考 文 献
[ 1 〕
[ 2 〕
[ 3 〕
[ 4 〕
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