全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2013，28 (1) :56 － 60 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2012 － 05 － 28 修回日期:2012 － 09 － 24 网络出版时间:2013 － 01 － 14 20∶ 14
* 基金项目:国家自然基金项目 (31060324) ;“西部之光”人才培养项目; “十二五”农村领域国家科技计划
(2011BAD17B03)。
作者简介:姜华 (1976 －) ，女，吉林梅河口人，副教授，主要从事牧草种质资源与遗传育种方面的研究。
E-mail:jianghua15@ 163. com
＊＊通信作者 Corresponding authors:毕玉芬 (1960 －) ，女，内蒙古通辽人，教授，主要从事草业科学的教学和科研
工作。E-mail:biyufenynnd@ sina. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20130114. 2014. 201301. 56_036. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2013. 01. 010
紫花苜蓿根瘤菌及其共生系统耐酸性的研究*
姜 华1，赵雅丽2，何承刚3，毕玉芬1＊＊，王新海1
(1． 云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201;
2． 甘肃省天祝县草原工作站，甘肃 天祝 733200;3． 云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)
摘要:土壤酸碱度是影响根瘤菌形成及固氮的一个主要因素，在南方酸性土壤地区，苜蓿生长的主要限制因
素是固氮作用降低，筛选耐酸苜蓿根瘤菌用于接种具有十分重要的生产意义。本研究以 9 份根瘤菌株为研究
对象，在不同的 pH条件下培养研究其菌落直径，同时在不同的 pH条件下分别与紫花苜蓿品种接种研究其结
瘤数，结果表明:YNCY006 菌株耐酸性最强而 YNCY007 菌株耐酸性最差，酸性土壤条件下 GT13R 紫花苜蓿
分别与 YNCY006 或 YNCY008 接种是最佳结瘤的共生系统。
关键词:紫花苜蓿;苜蓿根瘤菌;耐酸性;共生系统
中图分类号:S 542. 06 文献标志码:A 文章编号:1004 － 390X (2013)01 － 0056 － 05
Study on Acid Tolerance in Rhizobium meliloti and Its Symbiosis System
JIANG Hua1，ZHAO Ya-li2，HE Cheng-gang3，BI Yu-fen1，WANG Xin-hai1
(1． College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;
2． Tianzhu County Grassland Work Station in Gansu Province，Tianzhu 733200，China;
3． College of Tobacco Science，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract:Soil pH is a main factor affecting the nodule formation and nitrogen fixation． Less nitrogen
fixation limited the growth of alfalfa of acid soils in the South of China． It is particularly important that
we select and anti-acid nodule and inoculate it． Colony diameters of nine strains and nodule number of
alfalfa inoculated by theirs were studied in different acidic conditions． The result showed that YN-
CY006 strain was the strongest for acid resistant，but YNCY007 strain was the weakest． For nodula-
tion，GT13R alfalfa inoculation by YNCY006 or YNCY008 strain was the best symbiosis system in the
acid soil．
Key words:alfalfa;Rhizobium meliloti L．;acid tolerance;symbiosis system
苜蓿根瘤菌 (Rhizobium meliloti L．)是革兰
氏阴性杆菌，对寄主有专一性，只能跟苜蓿属
和草木樨属共生［1］。土壤酸碱度是影响根瘤菌
形成及固氮的一个主要因素，通常以中性和中
性偏碱性环境为宜［2］。而在南方酸性土壤地区，
苜蓿生长的主要限制因素是固氮作用降低，为
此，筛选耐酸苜蓿根瘤菌用于接种显得尤为重
要。在酸性土壤上生长的紫花苜蓿根瘤中仅分
离到一些中等耐酸的根瘤菌，如，CASTRO-
SOWINSKI等［3］在乌拉圭酸性土上分离到的能使
紫花苜蓿结瘤的根瘤菌仅能在 pH 5. 5 的培养基
上生长。SEGUNDO等［4］在阿根廷和乌拉圭酸性
土上分离到的苜蓿根瘤菌仅能使宿主植物在 pH
5. 6 下高效固氮，西班牙的苜蓿根瘤菌 LPu83 能
使宿主在 pH 5. 6 的土壤中结瘤［5］。而 PAPA 等
在中部阿根廷和乌拉圭酸性土上分离到的苜蓿
根瘤菌在 pH 5. 0 下使宿主植物固氮，但固氮效
率较低［6］。张磊及其研究小组近 3 年筛选到 30
余株具有一定耐酸性的苜蓿根瘤菌，其中包括
在 pH 4. 5 培养基能够存活数周、pH 4. 6 的酸性
土壤田间试验中仍具有较好结瘤固氮活性的苜
蓿中华根瘤菌［7 ～ 9］，可见，随着紫花苜蓿在酸性
土壤上种植面积的扩大，筛选更耐酸的能使紫
花苜蓿结瘤的苜蓿根瘤菌仍然十分必要。本研
究对收集到的紫花苜蓿根瘤菌菌株进行耐酸性
评价，找出与耐酸性苜蓿最佳匹配的根瘤菌菌
株，为获得能够使紫花苜蓿在酸性土壤中高效
结瘤的耐酸根瘤菌提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验共收集苜蓿根瘤菌菌株 9 份，其中 3 份
来源于云南农业大学后山草业科学试验基地不同
紫花苜蓿品种，1 份来源于小哨，4 份来源于晋
宁，1 份是美国商品根瘤菌菌剂。其编号及共生
紫花苜蓿的品种名称见表 1。
表 1 9 份供试苜蓿根瘤菌菌株
Tab. 1 Nine strains of R． meliloti L．
菌株编号 strain No． 宿主名称 host name 来源 source
YNCY001 射手 2 号 Archer II 农大后山基地 Nongdaexperimental base
YNCY002 多叶王 Multiking 小哨 Xiaoshao
YNCY003 商品根瘤菌菌剂 5 号 Rhizobium 5 美国 America
YNCY004 三得利 Sandili 农大后山基地 Nongda experimental base
YNCY005 超级 13R Supereme 13R 农大后山基地 Nongda experimental base
YNCY006 逸散苜蓿 1 Yisan 1 晋宁县 Jinning County
YNCY007 逸散苜蓿 2 Yisan 2 晋宁县 Jinning County
YNCY008 逸散苜蓿 3 Yisan 3 晋宁县 Jinning County
YNCY009 逸散苜蓿 4 Yisan 4 晋宁县 Jinning County
1. 2 试验设计
将供试的 9 份苜蓿根瘤菌菌株分别在 pH
4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5，7. 0 的 YMA 培养基
上进行为期两周的 27℃恒温光照培养，观测不同
pH下根瘤菌的菌落直径。
同时将根瘤菌菌株 YNCY001，YNCY002，
YNCY004，YNCY006， YNCY008 分 别 与 丰 叶
721，GT13R，阿尔冈金，盛世，丰宝和德钦紫花
苜蓿接种，进行温室盆栽试验。分别用 1%的浓
硫酸和硫黄粉将土壤的 pH 值依次调节为 4. 0，
5. 0，6. 0，7. 0 装入小花盆，播种接种了各参试
根瘤菌的各苜蓿材料，每个处理 6 个重复。播种
日期为 2004 年 5 月 20 日，小苗出土后，每隔 3 d
浇 1 次水，苗期为 30 d，待苗健壮后，分别测定
各紫花苜蓿的有效根瘤数。
1. 3 数据分析
用 SPSS 11. 0 软件进行 Duncan 氏复极差检
验，差异显著水平为 P ＜ 0. 05。变化幅度 = (pH
7. 0 菌落直径 － pH 4. 5 菌落直径) /pH 7. 0 菌落
直径 × 100%
2 结果与分析
2. 1 不同供试根瘤菌的耐酸性分析
不同 pH值的 YMA固体培养条件下，供试根
瘤菌菌株菌落直径测定结果见表 2。随着 pH的升
高，各供试根瘤菌菌株菌落直径逐渐增大，其中
YNCY007 菌株的增大幅度最大为 100%，YN-
CY002 菌株的增大幅度最小为 22. 22%，说明不
同 pH对根瘤菌菌落生长影响较大。
YNCY006菌落的直径在 pH 4. 5，5. 0，5. 5，
6. 0，6. 5的培养条件下都显著高于其他菌株。在
pH 4. 5的培养条件下，YNCY008 和 YNCY002 菌落
直径显著高于 YNCY004，YNCY001，YNCY003，
YNCY005 和 YNCY009 (P ＜ 0. 05) ;YNCY004，
75第 1 期 姜 华，等:紫花苜蓿根瘤菌及其共生系统耐酸性的研究
YNCY001和 YNCY003菌落直径显著高于 YNCY005
和 YNCY009 (P ＜ 0. 05) ，YNCY005 菌落直径显著
高于 YNCY009 (P ＜ 0. 05) ;YNCY007 菌株在该培
养条件下不能生长。而在 pH 7. 0 的培养条件下，
YNCY006，YNCY001和 YNCY008 菌落的直径显著
高于 YNCY003，YNCY002，YNCY005，YNCY007
和 YNCY009 (P ＜ 0. 05) ;YNCY009 菌落直径显著
低于其他菌株 (P ＜ 0. 05)。除了 pH 7. 0 的培养条
件下，各 pH培养条件下根瘤菌菌落直径的大小基
本上都表现为 YNCY006 ＞ YNCY008 ＞ YNCY002 ＞
YNCY004 ＞ YNCY001 ＞ YNCY003 ＞ YNCY005 ＞
YNCY007 ＞YNCY009。
表 2 不同酸性条件下各菌株的菌落直径
Tab. 2 Diameters of strains colony in different pH values
菌株编号 strain No．
不同 pH条件下菌落直径 /mm colony diametersin different pH values
4. 5 5. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0
变化幅度 /%
variation range
YNCY001 2. 8 dC 3. 3 cdBC 3. 8 cBC 4. 2 bcB 4. 5 bB 5. 2 aA 46. 15
YNCY002 3. 5 bB 3. 8 abB 4. 0 abB 4. 3 aB 4. 4 aB 4. 5 aB 22. 22
YNCY003 2. 5 cC 2. 8 cC 3. 3 bcC 3. 8 bB 4. 5 aB 4. 8 aAB 47. 92
YNCY004 3. 0 cC 3. 2 cBC 3. 8 bBC 4. 0 bB 4. 3 abB 4. 7 aAB 36. 17
YNCY005 1. 8 dD 2. 0 dC 2. 7 cC 3. 1 bcC 3. 5 bC 4. 3 aB 58. 14
YNCY006 4. 2 cA 4. 6 bcA 4. 9 bA 5. 2 abA 5. 5 aA 5. 8 aA 27. 59
YNCY007 0. 0 eF 1. 4 dD 2. 2 cCD 2. 5 cCD 3. 4 bC 4. 2 aB 100. 00
YNCY008 3. 6 cB 3. 9 bcB 4. 2 bB 4. 5 abB 4. 8 aB 5. 1 aA 29. 41
YNCY009 0. 5 cE 0. 8 cE 1. 5 bD 2. 0 abD 2. 2 aD 2. 5 aC 80. 00
注:同行中不同小写字母表示差异显著水平为 P ＜ 0. 05;同列中不同大写字母表示差异显著水平为 P ＜ 0. 05。
Note:Different small letters show significant difference (P ＜ 0. 05)in the same line;different capitals show significant differ-
ence (P ＜ 0. 05)in the same column．
2. 2 酸性条件下不同紫花苜蓿品种最佳匹配根瘤
菌的分析
接种不同根瘤菌的紫花苜蓿品种，种植在不
同 pH的花盆里出苗后生长 30 d时根瘤菌的数量，
结果见表 3。随着 pH的升高，接种同一根瘤菌的
同一紫花苜蓿品种的结瘤数都表现为逐渐升高。
不同 pH生长条件下，同一紫花苜蓿品种结瘤数
的多少与接种不同的根瘤菌菌株相关基本表现为
YNCY008 ＞ YNCY006 ＞ YNCY002 ＞ YNCY001 ＞
YNCY004 ＞ YNCY003。不同 pH 生长条件下，接
种同一根瘤菌菌株的结瘤数多少与紫花苜蓿品种
也相关，基本都表现为 GT13R ＞ 丰宝 ＞ 盛世 ＞
阿尔冈金 ＞ 丰叶 721 ＞ 德钦紫花苜蓿。说明根
瘤菌菌株和紫花苜蓿品种是影响紫花苜蓿结瘤数
的两个主要因素。
在 pH 4. 0 的种植条件下，与 YNCY001 根瘤
菌接种，GT13R和丰宝的根瘤菌数量显著高于其
他紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ，盛世紫花苜蓿的根
瘤菌数量显著高于德钦紫花苜蓿品种 (P ＜
0. 05) ;与 YNCY002 根瘤菌接种，GT13R 和丰宝
的根瘤菌数量显著高于其他紫花苜蓿品种 (P ＜
0. 05) ，盛世紫花苜蓿的根瘤菌数量显著高于阿
尔冈金、丰叶 721 和德钦紫花苜蓿品种 (P ＜
0. 05) ，阿尔冈金和丰叶 721 的根瘤菌数量显著高
于德钦紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ;与 YNCY003
根瘤菌接种，GT13R和丰宝的根瘤菌数量显著高
于其他紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ;与 YNCY004
根瘤菌接种，GT13R和丰宝的根瘤菌数量显著高
于其他紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ，盛世、阿尔冈
金和丰叶 721 紫花苜蓿的根瘤菌数量显著高于德
钦紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ;与 YNCY006 根瘤
菌接种，除阿尔冈金与丰叶 721 外，其他紫花苜
蓿品种的根瘤数量差异都显著 (P ＜ 0. 05) ;与
YNCY008 根瘤菌接种，不同紫花苜蓿品种根瘤数
变化趋势与接种 YNCY004 根瘤菌一样。在 pH
7. 0 的种植条件下，与 YNCY001 根瘤菌接种，
GT13R和丰宝的根瘤菌数量显著高于其他紫花苜
蓿品种 (P ＜ 0. 05) ，盛世、阿尔冈金和丰叶 721
紫花苜蓿的根瘤菌数量显著高于德钦紫花苜蓿品
种 (P ＜ 0. 05) ;与 YNCY002 根瘤菌接种，除
85 云南农业大学学报 第 28 卷
GT13R与丰宝、阿尔冈金与丰叶 721 外，其他紫
花苜蓿品种的根瘤数量差异都显著 (P ＜ 0. 05) ;
与 YNCY003 根瘤菌接种，除阿尔冈金与丰叶 721
外，其他紫花苜蓿品种的根瘤数量差异都显著
(P ＜ 0. 05) ;与 YNCY004 根瘤菌接种，GT13R，
丰宝和盛世的根瘤菌数量显著高于阿尔冈金、丰
叶 721 和德钦紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ;与 YN-
CY006 根瘤菌接种，GT13R 和丰宝的根瘤菌数量
显著高于其他紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ，盛世
紫花苜蓿的根瘤菌数量显著高于阿尔冈金和德钦
紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ，阿尔冈金的根瘤菌数
量显著高于德钦紫花苜蓿品种 (P ＜ 0. 05) ;与
YNCY008 根瘤菌接种，不同紫花苜蓿品种根瘤数
变化趋势与接种 YNCY001 根瘤菌一样。说明无论
是在 pH 4. 0 的酸性土壤种植条件下，还是在 pH
7. 0 的中性土壤种植条件下，YNCY006 和 YN-
CY008 与所有的供试紫花苜蓿品种的结瘤数都显
著高于其他菌株的结瘤数 (P ＜ 0. 05)。GT13R或
丰宝紫花苜蓿分别与 YNCY006 或 YNCY008 接种
是最佳结瘤的共生系统。
表 3 不同酸性条件下紫花苜蓿接种不同根瘤菌的结瘤数 (个 /株)
Tab. 3 Nodule number of alfalfa inoculated by nodule strains in different acidic conditions
pH
根瘤菌
rhizobium
苜蓿品种 variety
德钦
Deqin
丰叶 721
Fenghye 721
GT13R
阿尔冈金
Algonguin
盛世
shengshi
丰宝
fengbao
4. 0
5. 0
6. 0
7. 0
YNCY001 1. 7 cAB 3. 0 bcB 8. 0 aBC 3. 0 bcB 4. 0 bCD 7. 0 aBC
YNCY002 1. 7 dAB 3. 3 cB 9. 0 aB 3. 3 cB 5. 0 bBC 8. 0 aB
YNCY003 0. 7 bB 2. 0 bC 7. 0 aC 2. 0 bC 2. 0 bE 6. 0 aC
YNCY004 1. 0 cB 3. 0 bB 8. 0 aBC 3. 0 bB 3. 0 bDE 7. 0 aBC
YNCY006 2. 3 eA 5. 0 dA 12. 0 aA 5. 0 dA 6. 0 cA 11. 0 bA
YNCY008 2. 7 cA 5. 3 bA 11. 0 aA 5. 3 bA 6. 0 bA 10. 0 aA
YNCY001 2. 0 eCD 6. 0 dB 12. 7 aABC 6. 3 dB 8. 3 cC 10. 7 bCD
YNCY002 2. 3 dBC 6. 0 cB 12. 0 aBCD 6. 7 cB 9. 0 bBC 11. 7 aBC
YNCY003 1. 0 eE 3. 0 dC 10. 0 aD 4. 3 cB 6. 3 bD 9. 0 aE
YNCY004 1. 3 cDE 4. 0 bC 10. 3 aCD 4. 7 bB 6. 3 bD 9. 7 aDE
YNCY006 3. 0 dAB 8. 0 cA 15. 0 aA 10. 7 bA 10. 0 bcA 14. 0 aA
YNCY008 3. 3 cA 9. 3 bA 14. 0 aAB 10. 0 bA 9. 7 bB 13. 0 aAB
YNCY001 2. 7 cC 8. 7 bB 16. 0 aB 8. 7 bB 10. 7 bB 15. 0 aB
YNCY002 3. 0 cBC 7. 3 dB 16. 3 aB 7. 3 dBC 10. 7 cB 15. 3 bB
YNCY003 1. 7 dD 4. 3 cC 14. 0 aD 4. 3 cD 8. 7 bC 13. 0 aD
YNCY004 1. 7 dD 4. 0 cC 15. 0 aC 5. 3 cCD 9. 7 bBC 14. 0 aC
YNCY006 4. 0 eA 11. 7 dA 18. 0 aA 11. 7 dA 12. 7 cA 17. 0 bA
YNCY008 3. 7 cAB 12. 0 bA 18. 0 aA 11. 7 bA 12. 7 bA 16. 7 aA
YNCY001 3. 7 cAB 9. 7 bB 15. 3 aC 9. 7 bBC 11. 3 bBC 14. 3 aBC
YNCY002 4. 0 dAB 8. 3 cBC 16. 3 aBC 8. 3 cCD 12. 3 bAB 15. 7 aAB
YNCY003 2. 7 eB 6. 0 dC 14. 3 aC 6. 0 dD 9. 3 cD 13. 3 bBC
YNCY004 3. 3 bAB 6. 3 bC 13. 7 aC 6. 3 bD 10. 3 aCD 12. 7 aC
YNCY006 4. 3 dAB 12. 3 bcA 19. 0 aA 12. 0 cAB 13. 3 bA 18. 3 aA
YNCY008 4. 7 cA 12. 7 bA 18. 3 aAB 12. 3 bA 13. 7 bA 17. 3 aA
注:同行中不同小写字母表示差异显著水平为 P ＜ 0. 05;同列中同一 pH水平下不同大写字母表示差异显著水平为
P ＜ 0. 05。
Note:Different small letters show significant difference (P ＜ 0. 05)in the same line;the datum of same pH with the different
capitals show significant difference (P ＜ 0. 05)in the same column．
95第 1 期 姜 华，等:紫花苜蓿根瘤菌及其共生系统耐酸性的研究
3 讨论
我国南方分布着面积广大的酸性土壤，不利
于紫花苜蓿的种植，加上耐酸苜蓿根瘤菌资源缺
乏，紫花苜蓿在南方实现产业化任务艰巨。因此，
筛选耐酸性苜蓿根瘤菌，探讨其在酸性土壤上共
生结瘤效果具有重要意义。本研究对不同生境下
与不同紫花苜蓿材料共生的 9 个苜蓿根瘤菌菌株
的耐酸性进行了筛选，结果表明除了 YNCY007 菌
株外，各菌株在 pH 4. 5 的培养条件下都能生长，
且随着 pH 值的增加，各菌株的生长速度都逐渐
变快，说明苜蓿根瘤菌还是较适应 pH 值中性环
境生长。说明根瘤菌所处的生态环境对其耐酸性
能有重要影响，这与刘卢生［10］的研究结论一致。
将其中 6 个菌株在不同 pH 值下分别与 6 个紫花
苜蓿品种接种发现，在 pH 4. 0 的生长条件下各紫
花苜蓿都能结瘤，菌株 YNCY006 与 GT13R 是最
佳结瘤共生系统。各紫花苜蓿的结瘤数随着 pH
值的增加而呈增加趋势，说明根瘤菌虽然在酸性
土壤条件下能够定殖，但 pH 值接近中性仍是生
长的最佳环境。pH 对苜蓿根瘤菌结瘤的影响与苜
蓿根瘤菌的来源和宿主紫花苜蓿材料具有一定的
关系，在一定程度上受到菌株来源以及菌株与宿
主植物之间相互作用的影响，这与杨江科［11］等人
在大豆根瘤菌耐酸性的研究结论一致。
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06 云南农业大学学报 第 28 卷