全 文 ：植物保护　2009 , 35(3):66-69 P lant Protection
收稿日期:　2008-10-16　　　修订日期:　2008-10-20基金项目:　国家自然科学基金(30671267);甘肃省中青年基金(3XZ051-A25-015)＊通讯作者 E-mail:xub l@gsau.edu.cn
南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究
杨克泽1 , 　徐秉良1＊ , 　梁巧兰1 , 　薛应钰1 , 　陈荣贤2 , 　梁志福2
(1.甘肃农业大学草业学院 , 草业生态系统教育部重点实验室 , 中-美草地畜牧业
可持续发展研究中心 , 兰州　730070;　2.甘肃武威金平果有限责任公司　733000 )
摘要　本文对南瓜叶枯病病原菌瓜链格孢(A lternaria cucumerina)进行了生物学特性研究 ,结果表明:温度 、pH 、光
照对其生长和产孢都有一定的影响。该病原菌菌丝生长 、产孢和萌发的适宜温度为 28 ℃, pH 为 7 时菌丝生长最
快 , pH 为 8 时最易产孢。 25 ℃下连续黑暗培养产孢最多。碳 、氮源对菌丝生长和产孢量有一定的影响 , 碳源中甘
露醇组菌丝生长最快 ,山梨醇处理产孢量最多。氮源中牛肉浸膏最适宜菌丝生长和产孢 ,硫酸铵最差。该菌致死温
度为 50 ℃。
关键词　南瓜叶枯病;　瓜链格孢;　生物学特性
中图分类号:　S 436.429　　文献标识码:　A　　DOI:　10.3969/ j.issn.0529-1542.2009.03.016
Studies on biological characteristics of the pathogen of the pumpkin leaf blight
Yang Keze1 , 　Xu Bingliang1 , 　Liang Qiaolan1 , 　Xue Yingyu1 , 　Chen Rongxian2 , 　Liang Zhifu2
(1.College of P rataculture , Gansu Agricultural Uni versity , Key Laboratory of
Grassland Ecosy stem , Ministry of Education , S ino-U .S .Center f or
Grazingland Ecosystem S ustainability , Lanzhou　730070 , China;
2.Wuwei J inpingguo Company Co.Ltd., Lanz hou　733000 , China)
Abstract　The biological cha racteristics of the pathogen of the pumpkin leaf blight we re studied.The results showed
that tempe rature , pH and light affected the mycelial gr ow th and spo rula tion of the fungus.The optimum g rowth
tempe rature wa s 28 ℃;the suitable pH w as 8;the best temperature fo r spo rulation w as 25 ℃ under dark condition.
Bo th carbon and nitro gen sources had an effect on mycelial g row th and sporulation.The g row th of mycelia was the
fastest w ith mannitol , and the number of sporulation was the large st with so rbito l.So did the nitrog en sources.Beef
ex tract wa s the most suitable fo r the g row th o f mycelia and spo rulation , w hile ammonium sulfate w as the poo rest.
The lethal temperature to Alternaria cucumerina was 50 ℃.
Key words　pumpkin leaf bligh t;　A lternaria cucumerina;　biological characteristics
　　据贾菊生 、李新辉等报道[ 1] ,近年来 ,新疆瓜类
作物感染叶斑类病害日趋复杂 ,危害程度也与日俱
增 ,每逢 7 、8 月间 ,瓜类作物因感染此类病害导致大
量叶片干焦 ,一些学者将此病命名为瓜类叶枯病。
经贾菊生等多年的病情观察和病原的研究鉴定 ,将
新疆瓜类作物上由链格孢菌侵染而形成的叶斑病分
为两个群组 ,一组是哈密瓜 、西瓜被链格孢霉侵染后
形成的黑斑病类型 ,其病原被认为是瓜链格孢[ Al-
ternaria cucumerina (E11.et Ev.)E11io t t] ;另一
组是黄瓜被侵染后形成的褐斑病类型 ,被认为是由
南瓜链格孢(A.cucurbitae Letendre et Roum)引
起 。
近年来 ,在甘肃省武威市南瓜产区发生了严重
的叶枯病 ,南瓜栽培中后期 ,叶片出现较大面积的焦
枯和死亡 ,成为影响南瓜生产的关键性问题。为此 ,
作者经过初步比较鉴定 ,认为是由于感染瓜链格孢
菌[ Alternaria cucumerina (E11.et Ev.)E11io tt]
而导致南瓜叶片出现了大面积的枯死。田间调查表
明 ,某些品种病叶率达 100%,给南瓜生产带来严重
损失。南瓜叶枯病主要危害叶片 ,发病初期病斑为
褐色小点 ,逐渐扩大呈深绿色圆形 ,直径 2 ～ 5 mm ,
边缘呈水渍状 ,稍微隆起 ,病健部界限分明 ,具有明
35 卷第 3 期 杨克泽等:南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究
显的轮纹 ,后期导致叶片焦枯 ,死亡 ,脱落。
2001年 ,张派勇对温室甜瓜叶枯病的发生进行
了简单报道 ,认为甜瓜因感染瓜链格孢而引起叶枯
病 ,并提出了有效的防治方法[ 2] 。而关于南瓜叶枯
病的研究 ,在国内尚未见详细报道 。为此 ,本文对南
瓜叶枯病生物学特性和营养条件等进行了研究 ,不
仅有利于进一步认识病原菌的本质 ,病害发生特点 ,
而且在其与土壤碳 、氮等养分转化关系研究方面有
重要意义 。
1　材料与方法
1.1　材料
南瓜叶枯病的标本采自甘肃省武威市金苹果公
司南瓜生产基地 。对所采集的新鲜病叶用常规组织
分离法分离 , 切取 5 mm 大小病健交界组织 , 用
0.1%升汞溶液消毒 30 ～ 50 s ,后用灭菌水换洗 4
次 ,置于 PDA培养基中 ,放在 28 ℃生化培养箱中培
养 48 h。将培养后的菌种采用稀释纯化法进行单孢
分离和纯化 ,并保存在 PDA 斜面培养基上备用[ 3] 。
1.2　方法
1.2.1　温度对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
1.2.1.1　温度对瓜链格孢菌丝生长的影响
取培养 7 d 的菌落 ,用打孔器沿菌落边缘打取
内径 0.4 cm 菌饼移入 PDA 平板中央 ,每皿 1块 ,分
别置于 5 、10 、15 、20 、25 、28 、30 、35 、40 ℃无光照保湿
培养 7 d ,用十字交叉法每 2 d 测量 1次菌落的直
径 ,取其平均值并计算菌丝平均生长速度。每个处
理 5个重复。
1.2.1.2　温度对瓜链格孢产孢量的影响
从培养 7 d的瓜链格孢 PDA 平板 ,在距离菌落
中心 1 cm 处取直径 0.4 cm 的 3个菌饼于 5 mL 无
菌水中 , 加 1 滴吐温-80 激烈振荡使孢子脱落 , 取
50 μL孢子悬浮液用载玻片平板计数法在光学显微
镜下随机检查 10个视野(40×10)的孢子数量并取
平均值[ 4] 。
1.2.2　pH 对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
用 0.1 mo1/L 的 NaOH 或 HCl将 PDA 培养
基调节 pH 为 5.0 、6.0 、7.0 、8.0 、9.0等 5 个梯度后
再灭菌 ,用内径为 0.4 cm 的无菌打孔器沿菌落边缘
打取菌饼移入 PDA 平板中央 ,每皿 1个 ,每个处理
5个重复 。在室温下培养 ,按 1.2.1 中的方法测量
菌丝生长和产孢量。
1.2.3　光照对菌丝生长和产孢量的影响[ 5]
将已接种的 PDA 培养基分为 5组 ,在 25 ℃条
件下培养 24 h 后作如下处理:25 ℃持续光照培养
96 h(光照培养箱);25 ℃持续黑暗培养 96 h;25 ℃
黑暗 12 h与光照 12 h 交替培养 96 h;紫外线照射
2 h后于 25 ℃连续黑暗培养 96 h;紫外线照射 2 h
后于 25 ℃持续光照培养 96 h。每处理重复 5 次。
按 1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量。
1.2.4　不同碳源对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的
影响[ 6]
　　试验所用的基本培养基为查彼(Czapek)培养基:
1 L 蒸馏水中含 1 g KH2PO4 、0.5 g MgSO4 ·7H2O 、
0.01 g FeSO4 · 7H2O 、30 g 蔗糖 、0.5 g KCl 、2 g
NaNO3 。制平板时 1 L 培养液中加入 17 g 琼脂 。分
别以相同质量的葡萄糖 、麦芽糖 、淀粉 、乳糖 、甘露醇
和山梨醇代替基本培养基中的蔗糖 ,配成不同碳源的
培养基 ,并以不加碳素的培养基为对照。沿菌落边缘
取直径为 0.4 cm 菌饼接入平板中央 ,室温培养 ,每个
处理重复 4次。7 d后观察菌落形态和孢子形成情
况 ,并按 1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量 。
1.2.5　不同氮源对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的
影响
　　分别以相同质量氮的甘氨酸 、硫酸铵 、硝酸铵 、
氯化铵 、DL-蛋氨酸 、牛肉浸膏和尿素替代基本培养
基中的 N aNO 3 ,配成不同氮源的培养基 ,并以不加
氮素 、补加 2 g 0.1mo l/L NaCl的培养基为对照。
同 1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量。
1.2.6　瓜链格孢菌致死温度测定[ 7]
移取直径为 0.4 cm 的菌饼到无菌试管中 ,加入
2 mL 的无菌水 ,置于 40 、45 、50 、55 、60 、65 、70 ℃的
恒温水浴中加热 10 min ,取出后立即在冰水中冷却
至室温 。将处理后的菌饼接种到 PDA 平板上 ,7 d
后观察其生长情况 ,每个处理 5个重复。
1.2.7　温度对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
孢子萌发采用悬滴法[ 3] ,在发病的南瓜叶片上 ,
用南瓜叶片煎汁液经灭菌制成孢子悬浮液 ,采用凹
玻片悬滴法放在保湿培养皿内 ,分别置于 5 、15 、20 、
25 、28 、30 、35 、40 ℃的恒温箱中 ,每个温度设 2次重
复 ,24 h后镜检 ,测定不同温度下分生孢子的萌发
率 。
1.2.8　不同营养液对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
设置 10%南瓜叶片煎汁 、10%蔗糖液 、10%葡
萄糖液 、蒸馏水 4 个处理 ,以无菌水做对照 ,配制成
不同营养的孢子悬浮液 ,用悬滴法做孢子萌发试验 ,
每个处理 2次重复 ,置于 28 ℃的恒温箱中 , 24 h 后
镜检孢子萌发率 。
·67·
植物保护 2009
2　结果与分析
2.1　温度对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
在 25 ～ 30 ℃的温度范围内菌丝生长较好 ,其中
28 ℃生长最快 , 与其他温度差异显著 。产孢量以
28 ℃最多 ,平均每个视野 103.5 个 ,瓜链格孢菌在
5 ℃以下和 40 ℃以上几乎不生长也不产孢(表 1)。
表 1　温度对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响1)
温度/ ℃ 菌丝生长速率/ cm· d-1 孢子量/个·视野-1
5 0.089 f 0.0 f
10 0.344 e 2.7 f
15 0.353 e 9.0 e
20 0.550 d 31.8 d
25 0.829 b 51.2 b
28 0.883 a 103.5 a
30 0.781 c 43.2 c
35 0.336 e 9.0 e
40 0.033 f 0.0 f
　1)同列不同小写字母表示 0.05水平下差异显著性。
2.2　pH和光照对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
该病原菌能适应较宽的 pH 范围 ,在 pH 为 5 ～
9时 ,菌丝直径和产孢量较好 ,其中 pH 为 7时菌丝
生长最快 , pH 为 8 时产孢量最多;pH8与 pH9 之
间 ,菌丝生长速率和产孢量差异都不显著;pH 为 8
时菌丝生长次之 ,而 pH 为 5时菌丝生长速率最慢
产孢量最少 ,说明该菌在中性条件下生长快 ,但在偏
碱性条件下容易产孢;pH5 、pH6 和 pH7 之间产孢
量无明显差异 ,产孢量都较少(表 2)。
该菌在 25 ℃条件培养 24 h 后进行不同光照处
理后菌丝生长和产孢量有一定差异 。12 h光暗交替
培养 96 h的菌丝生长速率最大 ,与其他 4种条件形
成显著差异;紫外线照射 2 h 后持续黑暗菌丝生长
速率最小。产孢量以持续黑暗培养 96 h最多 ,紫外
照射 2 h后持续黑暗 96 h 次之 ,持续光照培养 96 h
产孢量最少(表 2)。
表 2　不同 pH和光照条件下瓜链格孢菌丝生长速率及产孢量(25 ℃)1)
pH 生长速率/ cm· d-1 孢子量/个·视野-1 光照条件 生长速率/ cm· d-1 孢子量/个·视野-1
5 0.91 c 26.4 b 持续光照 1.01 b 18.5 c
6 0.97 b 27.8 b 持续黑暗 1.00 b 41.2 a
7 1.11 a 21.4 b 12 h光暗交替 1.06 a 28.7 b
8 0.99 b 53.9 a 紫外照射 2 h持续光照 0.95 c 21.3 d
9 0.97 b 53.6 a 紫外照射 2 h持续黑暗 0.94 c 37.0 a
　1)同列不同小写字母表示 0.05水平下差异显著性。
2.3　碳源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
与其他生物一样 ,碳和氮也是南瓜叶枯病病原
菌生长繁殖的必需元素之一。该病原菌在山梨醇 、
甘露醇 、淀粉 、乳糖 、葡萄糖 、麦芽糖培养基上都能生
长 ,并且都与缺碳对照差异显著。最适碳源为山梨
醇 ,甘露醇产孢量最少但菌丝生长速率最大 ,该菌在
葡萄糖和蔗糖培养基上生长速率和产孢量比较接
近 ,在麦芽糖培养基上生长最慢。缺碳时菌丝几乎
不生长产孢量为 0 ,说明碳源是病原菌生长的必需
元素(表 3)。
表 3　碳 、氮源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响1)
碳源 生长速率/ cm· d-1 孢子量/个·视野-1 氮源 生长速率/ cm· d-1 孢子量/个·视野-1
甘露醇 0.80 a 3.6 e 牛肉浸膏 0.86 a 90.1 a
山梨醇 0.78 a 52.1 a 蛋氨酸 0.65 b 16.7 e
乳糖 0.77 ab 17.3 c 甘氨酸 0.56 c 24.1 d
淀粉 0.74 b 11.1 d 缺氮 0.51 d 5.6 f
葡萄糖 0.69 c 30.5 b 硝酸钠 0.49 d 36.4 c
蔗糖 0.64 d 26.3 b 硝酸铵 0.42 e 24.6 d
麦芽糖 0.57 e 18.8 c 尿素 0.41 e 43.7 b
缺碳 0.00 f 0.0 f 硫酸铵 0.38 f 15.0 e
　1)同列不同小写字母表示 0.05水平下差异显著性。
2.4　氮源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
7个供试氮源均能明显促进病原菌的生长 ,
在不同氮源的 C zapek 培养基平板上 ,病原菌的培
养性状差异较大 。在牛肉浸膏培养基上菌丝生
长最快且产孢量最多 ,与其他氮源差异显著 。硫
酸铵上的菌丝生长最慢 ,生长较差 ,产孢量也较
少 。硝酸钠和甘氨酸的菌丝生长速率比较接近 ,
尿素和硝酸铵的菌丝生长速率几乎一样 。缺氮
时菌丝生长较快但只是稀疏的气生菌丝 ,且几乎
不产孢(表 3)。
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35 卷第 3 期 杨克泽等:南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究
2.5　致死温度
7 d后 ,经过 40 ℃和45 ℃恒温水浴处理10 min
后 ,菌丝块在 PDA 平板培养基上分别形成平均直径
为 0.64 cm 和0.46 cm 的菌落 ,而经 50 ℃恒温处理
10 min 后 、在 PDA 培养基上未形成菌落 ,由此可
知 ,该病原菌的致死温度为 50 ℃,10 m in。
2.6　温度对孢子萌发的影响
采用凹玻片悬滴法对瓜链格孢分生孢子萌发测
定表明 ,在 10 ～ 35 ℃温度范围内该分生孢子都能萌
发 ,25 ～ 30 ℃范围内萌发较好 ,28 ℃孢子萌发率最
高 ,说明该孢子的最适温度为 28 ℃,在 5 ℃以下 、
40 ℃以上不能萌发(图 1)。
图 1　温度对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
2.7　不同营养液对分生孢子萌发的影响
由图 2看出:分生孢子以在 10%的南瓜叶片煎
汁中萌发率最高 ,10%葡萄糖液和 10%蔗糖液对孢
子的萌发具有一定促进作用 ,在蒸馏水中萌发率很
低 ,在无菌水中几乎不能萌发 ,说明分生孢子的萌发
需要一定的营养条件 。
图 2　不同营养液对瓜链格孢孢子萌发的影响
3　结论与讨论
在甘肃武威地区 ,南瓜叶枯病病原菌瓜链格孢
生长和萌发的最适宜温度范围为 25 ～ 30 ℃, 28 ℃
最适宜产孢 ,5 ℃基本不产孢 。pH 对该菌生长有一
定影响 ,pH6 ～ 8 时生长旺盛 , pH 小于 5 或大于 9
抑制其生长 ,最适 pH 为 8 。病原菌连续黑暗培养
96 h 产孢量最多;黑暗 12 h 与光照 12 h 交替培养
96 h 的菌丝生长最快;紫外照射 2 h 后对菌丝生长
具有抑制作用 ,对产孢量的影响不显著;该病原菌能
够利用多种碳 、氮源生长并产孢;氮源中牛肉浸膏具
有明显促进作用 ,牛肉浸膏产孢量最多 ,缺氮组最
少 ,具有明显差异;碳源中山梨醇产孢量最多 ,甘露
醇和缺碳最少 ,存在显著差异;研究还表明该病原菌
的致死温度为 50 ℃左右 ,分生孢子的萌发需要一定
的营养条件 ,在南瓜叶片煎汁中萌发率最高。
本文对南瓜叶枯病病原瓜链格孢生物学特性
研究结果与邹凤莲等对番红花链格孢菌生物学特
性研究结果[ 6] 基本一致。瓜链格孢菌生长和产孢
最适宜温度为28 ℃,而番红花链格孢菌为 25 ℃,
但对碳 、氮源利用有些不同。从瓜链格孢菌丝生长
与温度的关系来看 ,该菌最适温度较高且适温范围
较宽 ,15 ～ 30 ℃范围内能够生长 。对 pH 的适应
范围和对碳 、氮源的需求也较宽 ,这表明该菌对环
境的适应性较强 。因此 ,在进一步研究南瓜病害的
流行规律与流行分区时应予以重视 。当培养基碳 、
氮源变化时瓜链格孢的菌丝形态和色泽发生了明
显变化 ,这一特点有可能用于研制和开发适宜的鉴
别性培养基 ,进行病原菌的快速鉴定。本文仅对甘
肃武威地区南瓜叶枯病病原菌的生物学特性进行
了初步研究 ,自然界不同地理来源的同一种真菌不
同个体间生物学特性方面存在较大差异[ 8] ,因此 ,
今后有必要对不同地理来源瓜链格孢菌株间的生
物学特性进行比较研究 。
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