全 文 ：第 31卷第 2期
2009年 4月
大 连 医 科 大 学 学 报
JournalofDalianMedicalUniversity
Vol.31No.2
Apr.2009
高速逆流色谱快速分离茯苓皮中的高纯度茯苓酸 A＊
王 艳 ,汤新强
(大连医科大学附属第一医院 药剂科 ,辽宁 大连 116011)
摘要:[目的]建立利用高速逆流色谱法高效、快速分离茯苓皮中茯苓酸 A的新方法。 [方法 ]茯苓皮的乙醇提取物经
大孔吸附树脂柱初分后 ,直接进行高速逆流色谱分离 ,所用两相溶剂体系为正己烷–乙酸乙酯–正丁醇–水(1∶1∶
1.2∶0.8, v/v),流速 1.5mL/min,转速 800 r/min, 检测波长 254 nm, 所得产物的纯度经 HPLC检测 , 结构经红外光谱
(IR), 紫外光谱(UV),质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)鉴定。 [结果 ]从 200 mg茯苓皮粗提物中可得到 76 mg纯度高
于 98%的茯苓酸 A,分离时间短于 5 h。 [结论 ]该方法简便 、快速 ,适合于茯苓皮中高纯度茯苓酸 A的分离制备。
关键词:HSCCC;茯苓皮;茯苓酸 A;HPLC
中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1671-7295(2009)02-0227-04
茯苓是中国著名的传统中药 ,为多菌科真菌茯
苓(Poriacocos)。茯苓皮为茯苓菌核的黑色外皮
Poriacocos(Schw.)Wolf.[ PavhymacocosFr.] ,首
载于《本草纲目》 ,味甘淡 ,性平 ,是一味常用的利水
消肿药 ,主要含多糖 ,三萜酸类 ,等有效成分 [ 1, 2] 。
历来主要把茯苓入药 ,而对茯苓皮的研究很少 ,通常
当废物弃去 ,造成很大的资源浪费。
高速逆流色谱(High– speedcounter– current
chromatography, HSCCC)是在 20世纪 80年代由
YoichiroIto教授首先研究和发展起来的一种无固相
载体的连续液 -液分配色谱技术 [ 3– 5] ,目前在天然
产物的分离制备中应用广泛。
本文利用高速逆流色谱对茯苓皮中的化学成分
进行分离 ,最终得到纯度高于 98%的茯苓酸 A。该
方法分离时间短 ,分离效率高 、产物纯度好 ,是制备
茯苓酸 A的有效方法 。目前 ,还未见关于使用 HSC-
CC分离制备茯苓酸 A的研究报道 。
1 试剂与仪器
1.1 药材与试剂
茯苓皮购于云南千草源药业有限公司 ,经大连
医科大学天然药物化学教研室刁云鹏博士鉴定为茯
苓菌核(Poriacocos)的外表皮(Poriacocos(Schw.)
Wolf.[ PavhymacocosFr.] )。正己烷 、乙酸乙酯和
甲醇均为分析纯试剂(天津科密欧化学试剂开发中
心),乙腈 、甲醇为色谱纯试剂(TEDIA, USA), 95%
医用酒精(盘锦天源药业有限公司),自制双蒸水 。
1.2 仪器设备
TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技
术有限公司)、进样圈 20 mL、8823B-紫外检测仪
(北京市新技术应用研究所)、TBP-50A恒压恒流
微量泵(上海同田生化技术有限公司)、HX1050恒
温循环器(北京博医康实验仪器有限公司)、N2000
色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程有限公
司);Agilent1200 HPLC系统包括 G1322A真空脱气
机 、G1311A四元泵 、G1329A自动进样器 、G1314B
可变波长紫外检测器 、Chemstation工作站(Agilent,
USA);U3010紫外 /可见分光光度计 (Hitachi, Ja-
pan);Perkin-Elmer577红外分光光度计 , KBr压
片;Bruker- 400型核磁共振仪 , TMS为内标;
API3200型质谱仪 (美国应用生物系统公司);D101
大孔树脂(天津农药厂), SENCO5 L旋转蒸发仪
(上海申生科技有限公司), DZF-6021真空干燥箱
(上海一恒科技有限公司), 98-1-B电热套(上海
申生科技有限公司)。
2 方法与结果
2.1 两相溶剂系统的制备
本研究采用正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水
(1∶1∶1.2∶0.8, v/v)的溶剂系统。将正己烷 、乙酸
＊ 收稿日期:2008-11-26;修回日期:2009-01-18
作者简介:王艳(1968-), 山东龙口人 ,副主任药师 , 硕士。
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乙酯 、甲醇 、蒸馏水按体积比(1∶1∶1.2∶0.8)倒入分
液漏斗内混合 ,充分振摇 ,静置分层 ,使用前分取上
下相 ,上相作为固定相 ,下相作为流动相 ,分别超声
脱气 30 min,冷却至室温 ,备用。
2.2 样品溶液的制备
取干燥的茯苓皮 0.5kg,粉碎后用 70%乙醇回流
提取 2次 , 4 h/次。合并提取液 ,减压回收提取物得
浸膏 800mL,浓缩温度为 60℃。将浸膏进行 D101大
孔树脂柱(80cm×6 cm)层析 ,依次用水 , 60%、70%、
80%、95%乙醇各 2000 mL梯度洗脱 ,接收各浓度的
乙醇洗脱液 ,并对其进行 HPLC分析 ,结果显示 70%
流份适于用高速逆流色谱法进行分离纯化 ,将该流份
减压浓缩 、真空干燥 ,得淡黄色粉末 4.2 g,称取该粉
末 200 mg,用 20 mL上相溶解 ,摇匀。
2.3 HPLC分析和 HSCCC分离产物质谱鉴定条件
HPLC色谱条件:色谱柱:EclipsePlusC18(150
mm×4.6 mm, 5μm)(Agilent, USA),柱温:25℃;
检测波长:242nm,流速:0.8 mL/min,进样量:10μL,
流动相采用甲醇(A)-水(B),梯度洗脱 [ 0 ～ 30min,
70% ～ 75%A;30 ～ 40 min, 75% ～ 79%A;40 ～ 55
min, 79% ～ 90%A;56 ～ 65 min, 90%A] 。在该条件
下 ,对茯苓皮大孔树脂柱 70%乙醇洗脱流份进行分
析(图 1),峰 1为待分离成分。
图 1 茯苓皮大孔树脂柱 70%乙醇洗脱流份 HPLC色谱图
峰 1为待分离化合物
质谱(MS)条件:离子源为 ESI源 ,源电压 5.0
Kv;加热毛细管温度 275℃;氮气(N2)流速 30 mL/
min,辅助气流 5mL/min,负离子扫描方式检测。
2.4 HSCCC样品分离
将固定相以 9.99 mL/min流速泵入 HSCCC分
离管中 ,当出口端有固定相流出时 ,打开检测器与温
控装置 ,分别设定为 254 nm与 30℃,开启主机 ,转
速为 800r/min,并以 1.5 mL/min的流速泵人流动
相。当不相混溶的两相溶剂系统在分离柱中建立了
动态平衡 ,即流动相从分离柱尾端流出时 ,通过进样
阀口将制备好的茯苓皮 70%乙醇洗脱流份样品注
入 HSCCC分离管中 , 开始采集数据 , 记录色谱图
(图 2),并根据色谱图吸收峰接收流份 Ⅰ 。
图 2 茯苓皮大孔树脂柱 70%乙醇洗脱流份 HSCCC分离色谱图
流份Ⅰ为目标化合物
第 2期 王 艳 ,等:高速逆流色谱快速分离茯苓皮中的高纯度茯苓酸 A 229
2.5 HSCCC分离流份的纯度检测
在 2.3项下所述色谱条件下 ,分离所得的流份
Ⅰ的 HPLC色谱图(图 3),由图可知 ,流份 Ⅰ为单一
成分 。
图 3 流份 Ⅰ的 HPLC色图谱
2.6 所得化合物的结构鉴定
流份Ⅰ :红外光谱 IRνKBrmaxcm-1:1703 , 1640;紫
外光谱 UVλEtOHmax nm:242;电喷雾质谱 ESI-MSm/
z:498 [ M-H] -(电喷雾离子源 ,源电压 -5.0 Kv;
负离子扫描方式检测 , 见图 4)。核磁共振谱 1 H
NMR(Pyridine– d5):δ0.98, 0.99(2×3H, s, H3
– 26, 27), 1.02 (3H, s, H3– 19), 1.09(3H, s,
H3– 18), 1.48(3H, s, H3– 30), 1.74 (3H, s, H3
– 29), 1.89 (1H, m, H– 1), 2.85 (1H, dd, J
=11, 6Hz, H– 17), 2.94(1H, dt, J=8, 3Hz,
H– 20), 4.50 (1, dd, J=8 , 6 Hz, H– 16),
4.78, 4.83 (2 ×1H, brs, H– 28), 4.84 (1H, s,
H– 31), 5.29(1H, brs, H– 7), 5.34 (1H, brs,
H– 11)。13 CNMR(ppm, pyridine-d5 , TMS):δ
36.4(C– 1), 30.1 (C– 2), 176.5 (C– 3)149.1
(C– 4), 50.8(C– 5), 28.6 (C– 6), 118.1(C
– 7), 141.9 (C– 8), 137.6 (C– 9), 38.8(C–
10), 120.4 (C– 11), 36.7 (C– 12), 44.6 (C–
13), 49.0 (C– 14), 31.0 (C– 15), 27.1 (C–
16), 50.3 (C– 17), 17.0 (C– 18), 22.1 (C–
19), 48.1 (C– 20), 178.3 (C– 21), 31.7 (C–
22), 32.7 (C– 23), 155.8 (C– 24), 34.1 (C–
25), 22.0 (C– 26), 21.8 (C– 27), 112.1 (C–
28), 22.3 (C– 29), 24.1(C– 30),
图 4 流份Ⅰ的质谱图
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107.0(C– 31)。以上数据与文献对照[ 6] , 确定为
茯苓酸 A,化学名:16α–羟基– 3, 4–裂环羊毛甾烷
– 4(28), 7, 9 (11), 24(31)–三烯– 3, 21–双酸。
3 讨 论
HSCCC利用螺旋管分离柱在做行星式运动时
所形成的不对称离心力场 ,使不相混溶的两相溶剂
不断的混合 ,溶质在两相系统中分配 、传递 ,在短时
间内实现高效 、快速的分离 。由于不使用固态支持
介质 ,避免了固定相载体与实验样品发生化学反应
变性或产生不可逆吸附 ,样品的回收率高 ,具有其他
制备色谱技术无可比拟的优点 ,因此被广泛应用于
天然产物的分离制备当中[ 7-9] 。在用 HSCCC对茯
苓皮中的三萜类化学成分制备时 ,需要根据待分离
化学成分的极性选择一个合适的提取条件 ,需要采
取一定的前处理方法 ,得到较为干净的提取物 ,便于
进一步分离纯化 。乙醇是一种用于中药成分提取分
离的绿色提取溶剂 ,价格便宜 、适用范围广 、可重复
使用等优点 ,与大孔树脂柱结合而被广泛应用于天
然药物的分离制备当中 [ 10] 。本研究中首先 70%乙
醇对极性较小的三萜类化合物进行提取 ,而后采用
大孔吸附树脂柱梯度洗脱色谱技术对各化学成分进
行初分 ,得到易于进行 HSCCC分离制备的 70%乙
醇洗脱流份 ,进而采用 HSCCC进行分离制备 。
在色谱技术分离纯化过程中 ,选择适宜的溶剂
系统是成功的关键。在 HSCCC分离过程中 ,选择溶
剂系统就意味着选择固定相和流动相 。溶剂系统的
选择有多种方式 ,可以使用分析型 HSCCC进行预
试 ,可以测定待分离成分在溶剂系统上下相间的分
配系数 ,如果所分离的成分已有 HSCCC分离纯化的
报道 ,可以借鉴和改善已有的方法。在进行分配系
数测定的同时 ,也要注意溶剂系统中固定相的保留
率和样品在溶剂系统中的稳定性 ,进而选择一个最
佳的溶剂系统。
在对茯苓皮中的化学成分分离过程中 ,因为茯
苓酸 A的最大吸收波长为 242 nm,受检测仪器限制
以 254 nm作为检测波长时 , HSCCC色谱图中的吸
收峰较矮 ,但不会因此而影响分离结果 。
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