全 文 ：收稿日期!!#$%$%&
基金项目!广州市科技局科技攻关项目 !’())&%*+#广东省自
然科学基金!%,%,
-.//012345 675 2835 90.:4;2<0:5 0=5 >.;:?@80.5 -A<$23A85 B0CC<22335 D’($5
))&%*+EF5G;2.;H5-A<3:A3590.:4;2<0:50=5>.;:?40:?5/10I<:A35J%,%,E
作者简介!欧阳平!%K**$#男#医学博士#生物学博士后#副教授#电 话$!$*%*),*)F5L$C;柿叶黄酮对缺氧复氧以及晚期糖基化终产物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的
影响
欧阳平 %!贝伟剑 !!赖文岩 %!许顶立 %!彭文烈 !Q%第一军医大学南方医院心血管内科!广东 广州 +%+%+#!中
山大学生命科学学院生物化学系!广东 广州 +%!,+$摘要!目的 观察柿叶黄酮对缺氧复氧和晚期糖基化终产物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响% 方法 分别建立 %*&#!58 缺氧复氧和晚期糖基化终产物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡模型# 应用流式细胞术检测柿叶黄酮作用下上述乳鼠心肌细 胞的凋亡率% 结果 %*58 和 #!58 缺氧后复氧 *58 均可导致乳鼠心肌细胞的凋亡#其凋亡率分别为 *P+!P)*R和 %!P)+! %P**R#且凋亡率随着缺氧时间的延长而增高!!SP+% 在柿叶黄酮作用下#缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡率显著 降低% 晚期糖基化终产物亦可诱导心肌细胞显著凋亡!%%P#!P#K5# *P!+!P)&#!SP+# 柿叶黄酮对晚期糖基化终产 物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡有一定的抑制作用!&P)!P),5$ %%P#!P#K#%SP+%结论 柿叶黄酮对缺氧复氧和晚期糖
基化终产物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡均有一定的抑制作用%
关键词!黄酮类 T 拮抗剂和抑制剂’细胞凋亡 T 药物作用’细胞低氧’糖基化终产物#高级 T 激动剂
中图分类号!UK,!55555555文献标识码!V55555555文章编号!%$!+&&!!#,$*&$# ! #$%&’ !!#$% & ’()&*! +&, ’!()!% & ($’)*+&’) ,-,. &* +($#(+-.(# ,/&#/$! (0&0$&%.% .*! -1#!- 2/ 3/0&4.($+!&4/5!*($.&* (*- (-)(*#!- 5’/#($.&* !*- 0+&-1#$% WXYVG>5Z<:?%F5(L[5\3<$]<;:!F5^V[Q\3:$7;:%FQ_XQ‘<:?$H<%FQZLG>Q\3:$H<3!
%‘3/;12C3:2Q0=QB;14<0H0?7F QG;:=;:?Qa0O/<2;HF Q9<1O2Qb.;:?@80.Q+%+%+F QB8<:;c Q!‘3$
/;12C3:2Q0=Q(<0A83C.;:?@80.Q+%!,+FQB8<:;
67%$+(#$8 97:!#$.)! d0Q<:I3O2?;23Q283Q3==3A2OQ0=Q=H;I0:3Q3e21;A234Q=10CQ283QH3;I3OQ0=Q&’($)*+($ ,-./ 0:Q283Q;/0/20O<OQ0=Q1;2Q<brA;14<;AQC70A723OQ<:4.A34Q67Q87/0e<;$130e7?3:;2<0:Q;:4Q;4I;:A34Q?H7A;2<0:Q3:4Q/104.A2OQ’0 /1+(PQ;!$3&-% d83QA;14<;AQC7$
0A723OQf313Q/0e<;$130e7?3:;2<0:Q;:4Q;4I;:A34Q?H7A;2<0:Q3:4Q/104.A2OQJV>LOEQ13O/3A2H3;I3OQ0=Q&/($)*+($ .-./ 0:Q283QA3HHQ;/0/20OV/0/20OP)*RQ$%!P)+R!%P**RFQ%SP+EFQ;:4Q=H;I0:3Q213;2C3:2Q0=Q283QA3HHOQO?:<=<A;:2H7QH0f3134Q283Q;/0/202<AQ1;23OPQVLOQ;H0:3Q;H$
O0Q<:4.A34Q;/0/20OJ&P)!P),Q$%%P#!P#KFQ%SP+EPQ=&*#’1%.&* 9H;I0:3Q3e21;A234Q=10CQ283QH3;I3OQ0=Q&/($)*+($ .-./ A;:Q<:8<6<2Q283Q;/0/20O0=Q/0 /1+( A.H2.134Q:30:;2;HQ1;2QA;14<;AQC70A723OQ<:4.A34Q67Q87/0e<;$130e7?3:;2<0:Q;:4Q;4I;:A34Q?H7A;2<0:Q3:4Q/104.A2OP
>!/ ?&+-%8 =H;I0:3OT;:2;?0:;?:0:目前#研究证明细胞凋亡是心肌缺血 $再灌注损 伤发病机制中的一个重要环节(%)% 晚期糖基化终产物 !;4I;:A34Q?H7A;2<0:Q3:4Q/104.A2OFQV>LO是一组在蛋 白质的氨基和糖的醛基之间非酶性糖基化反应终产 物的总称 (!)% V>L 可影响机体内许多蛋白质的结构 和生化性能#并参与糖尿病&冠状动脉粥样硬化&衰老 等疾病的发生发展过程(#)% 本课题组的既往研究证实 V>LO 可以诱导乳鼠心肌细胞凋亡 ())#目前正致力于 从天然药物中寻找干预和调节心肌凋亡的药物先导 物研究% 在我国#柿叶J&/($)*+($2-./E资源非常丰富#其 主要有效成分之一是黄酮类(+)% 本研究通过建立缺血$ 再灌注损伤的心肌细胞模型#观察了了柿叶黄酮对
缺氧复氧以及 V>LO 诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影
响%
%QQ材料与方法
%P%QQ材料
%h#Q4 龄新生 -‘ 乳鼠由第一军医大学实验动物
中心提供#雌雄不拘% 高糖和低糖 ‘bLb 培养基购
自 ><6A0 公司’胎牛血清!9(-和胰酶购自 a7AH0:3Q
QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ第一军医大学学报J’Q9<1O2Qb表 !柿叶黄酮对缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋
亡的影响 #!$%!!!& !#$% &’’()*+ ,’ ’-.,/( (0*1)*(2 ’1,3 *4( -(.(+
,’ !#$%&’#$ ()( ,/ *4( 5,5*,+6+ ,’ 1* )126)
37,)7*(+ 6/28)(2 #7 475,06’1(,079(/*6,/
(!$%!#$%!!&’&
)(*+,+-./012003.140.567089:;<=>(*+,+-.) ?:319:@.89:;<.
...A9:;<
B<:<1:1C?.9610.(D&
!%.4) EF.4G
...H:319:@ %,+-!+,I% !F,I-!!,%%
...J@6K:30.(-+.!8L7@& ..I,F!!+,--> ....M,MN!+,%M>
表 FO.柿叶黄酮对晚期糖基化终产物作用 FI.4 后
所诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响 (!$%!!!& !#$: &’’()*+ ,’ ’-.,/( ,/ *4( 5,5*,+6+ ,’ 1*
)126) 37,)7*(+ ’*(1 6/28)*6/9 ’,1 :; 4 <6*4
2./)(2 9-7)*6,/ (/2 51,28)*+ (!$%P.*+,!!&-& BAQ5R.BSK63?0S.8@T?61C:3.03S.<9:S;?15=.>(*+,+-=.)(*+,+- ...A9:;< B<:<1:1C?.9610.(D& ...H:319:@ %,F-!+,IM> ...BAQ5.(.-+.!8L7@& !!,+E!+,EU.>) ...J@6K:30V.BAQ5.(-+.!8L7@& M,I+!+,IN) 公司一次性细胞培养瓶购自 H:93C38.公司葡萄糖# 人血清白蛋白#WQXQY#碘化丙啶$X9:XZ%&胶原酶及 [\B酶均为美国 YC876 公司产品’
柿叶黄酮 (]@6K:30.]9:7.@06K05.:].’./012/ 3,4.&
样品由中山大学生命科学学院生物化学系提供!系以
植物柿叶为原料!经有机溶剂提取#大孔树脂吸附分
离#H^F超临界萃取等方法提取获得! 其黄酮类含量
超过 UM_O( 实验前将柿叶黄酮以含 +,-DJ‘Y的 X‘Y
溶解后重新配制!而后用含 !+DJ‘Y 的 abQb 培养
液稀释至所需的终浓度(
!,FOO实验方法
!,F,!OO新生大鼠心肌细胞的培养 参考文献)%*’ 取乳
鼠心脏!采用酶消化法!并应用差速分离的方法去除
平滑肌细胞+成纤维细胞等非心肌细胞!使心肌细胞
比率达到 U-D以上( 于含 !+DJ‘Y的 abQb中培养
心肌细胞 NFO4后进行实验(
!,F,FOOBAQ 修饰的人血清白蛋白!BAQ’WYB的制备
BAQ’WBY 由第一军医大学肾病研究所提供!其体外
制备参照 W:;)N*的方法(
!,F,EOO心肌细胞缺氧复氧损伤的形成 首先用高纯氮
气(\F&通入低糖 abQbOE+O7C3( 取生长 NFO4 的单层
心肌细胞!换用 \F 饱和的低糖 abQbP并放入 ENO
含 -DOH^F&U-D\F的孵箱中!在此缺氧条件下分别培
养 !%O和 EFO4 后换用高糖 abQb 培养液( 将心肌细
胞分为两组! 其中 ! 组加入终浓度为 -+O!8L7@ 的柿
叶黄酮! 另 ! 组作为对照! 将两组细胞同时放入 ENO
&-DOH^F的孵箱中继续培养 %O4! 造成缺氧复氧损
伤( 每组实验重复 -次(
!,F,IOO柿叶黄酮对 BAQ5诱导的心肌细胞凋亡的影响
实验分为对照组&-+O!8L7@OBAQ5 组&-+O!8L7@ 柿叶
黄酮与 -+O!8L7@OBAQ5 共同处理组!各组心肌细胞在
含相应试剂的 !+DJ‘YOabQb 培养液中继续培养
FIO4(
!,F,-OO流式细胞仪对细胞凋亡百分率的检测 在时间
终点收集上述各组细胞! 采用胰酶消化法进行消化!
a’463cd5 液洗 F 遍!IO&!O+++O9L7C3O离心 -O7C3 以收
获细胞 X‘Y 洗两次!IO&!O+++O9L7C3 离心 -O7C3!弃
上清!用含 FDJ‘Y 的 X‘Y 制备单细胞悬液!使细胞
数为 !#!+%LO7@吸取 !O7@ 细胞至 !-O7@ 离心管中!加
EO7@冰无水乙醇IO固定细胞 FIO4( X‘Y洗两次!加
入 !7@ 的 XZ 染色液! 而后加入 -+O78OL7@ 的 [\650O
B!IO孵育 EO4流式细胞仪 Q@C10(美国 H:;@109 公司&
进行分析( 以 Y;/’A!的细胞百分率为凋亡百分率(
!,F,%OO统计学处理 应用 YXYY!!,+ 软件包! 采用 :30O
26TOB\^eB检验!组间两两比较采用 A6705’W:20@@
检验和非配对 5检验进行统计分析(
FOO结果
F,!OO柿叶黄酮对缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡
的影响
心肌细胞缺氧复氧后出现凋亡峰( 对照组心肌
细胞的凋亡率随着缺氧时间的延长而显著增高(柿叶
黄酮组心肌细胞的凋亡率显著低于对照组 ,表 !!
6*+,+-%(
F,FOO柿叶黄酮对 BAQ5 诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的
影响
心肌细胞在 BAQ5 作用 FIO4 后出现凋亡峰 (
BAQ5 组的心肌细胞在 BAQ5 作用后 FIO4 后细胞的
凋亡率较对照组显著增高 ,6*+,+-%( 柿叶黄酮
VBAQ5 组心肌细胞的凋亡率则显著低于 BAQ5 组
,6*+,+-!表 F%(
EOO讨论
心肌细胞凋亡是多种心血管疾病发生与演变的
细胞学基础)!*( 有研究显示!过度牵张!压力容量超负
荷&缺血缺氧&钙超载&氧化应激&血管紧张素 ZZ 等均
可以引起心肌细胞发生凋亡)M*( !UUI年!A:11@C0/)U*首
先在兔心脏上验证了缺血 ’ 在灌注损伤可导致心肌
细胞凋亡!提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特
征之一(病理学认为细胞凋亡机制与心肌短暂缺血后
再灌注损伤密切相关( 离体心脏的缺血再灌注模型
中!自由基诱使心肌细胞凋亡!抗氧化剂治疗可与之
第 N 期 欧阳平P等,柿叶黄酮对缺氧复氧以及晚期糖基化终产物诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响 %M!- -
对抗! 目前认为心肌缺血 ! 再灌注损伤引起细胞凋
亡的机制与 #$#%&’#()*基因的调控相关$+%!
,-.’ 是在高血糖条件下还原糖和蛋白质发生
非酶糖基化反应后形成的一系列具有高度活性的产
物 $+/%! ,-.’ 的主要作用是改变蛋白质的结构及功 能导致多种细胞&如单核巨噬细胞#0 淋巴细胞#内 皮细胞#系膜细胞等’代谢的紊乱引起许多生物活性 物质&包括内皮素#细胞因子如肿瘤坏死因子 1!#白 介素 1+! 和白介素 12 等# 细胞生长因子和组织成分 胶原蛋白#弹性蛋白’的作用失去平衡进而导致血液 高凝状态#动脉顺应性降低舒张功能减弱$*%! 新近的
研究显示,-.’ 可促使培养的人脐静脉内皮细胞和
肾小球系膜细胞发生凋亡$+++3%! 柿叶中的黄酮成分主要以甙类形式存在!柿叶具 有包括扩张血管#降脂降压#抗氧化#止血等多种功 效!柿叶中的主要药效成分有 4类即黄酮类有机酸 类和香豆素类$+4%!
目前通过干预细胞凋亡途径以减轻缺血再灌注
损伤和 ,-.’ 导致心肌细胞凋亡能否成为有效的治
疗方法已受到广泛的关注!我们的初步研究结果显示
柿叶黄酮对不同时间段的缺氧复氧诱导的乳鼠心肌
细胞凋亡均有明显的抑制作用同时对 ,-.’ 增加的
心肌心肌细胞凋亡有明显的抑制作用! 5&6$+7%等新近 报道了柿叶黄酮具有明显地清除自由基的效应 ! 89:6$+)%等报告了来源于柿叶中的 ) 种黄酮成分能够
明显抑制人中性粒细胞中过氧化物的产生和蛋白质
的酪氨酰磷酸化表明柿叶黄酮具有强大的抗氧化作
用通过该作用抑制了缺氧复氧和 ;-.’诱导的乳鼠
心肌细胞的凋亡!
综上所述柿叶黄酮对缺氧复氧和 ,-.’ 诱导的
乳鼠心肌细胞凋亡均有明显的抑制作用可能作为一
种具有潜在治疗心血管疾病能力的药物先导物!
参考文献!
$+% <:66:==>?@A>;(B(=B’C’>C6>=9:>D&EFCBG&’DHI&E>’J’=:K$L%A>5:&E=M>3//3NO
PQR>7P/1QA
$3% S&’(:E>?N>TH6U>@5VA>;W:1E:I&=:F>D9&6W:’>C6>D:II’>&6F>=C’’H:’>FH:> =B>&FG&6D:F>WIJD&=CB6>:6F>(EBFHD=’$L%A>;ED9>-:EB6B=BI>-:EC&=ECN>3//+N>
*3X>3**17*A
$*% ,N>5BYK&66>?,N>ZC:WI:E>@N>! #$A>;-.’>&6F>=9:CE>C6=:E&D1 =CB6>[C=9>;-.1E:D:(=BE’>C6>G&’DHI&E>FC’:&’:>&6F>FC&:=:’>KHIIC=H’>\A> 09:>;-.>DB6D:(=$L%A>8&EFCBG&’D>@:’N>+]]^NO*_‘*aR>)P212//A
$7% 曾 平N>许顶立N>李 针N>等A>晚期糖基化终产物对心肌细胞细胞周 期和凋亡的影响$L%A>第一军医大学学报N>3//*R>3*b+aR>c1++A
Z:6W>dN>eH>fgN>gC>ZN>! #$A>.YY:D=’>BY>&FG&6D:F>WIJD&=CB6>:6F1(EBF1 HD=’>B6>D:II>DJDI:>FC’=ECH=CB6>&6F>&(B(=B’C’>C6>6:B6&=&I> E&=>D&EFC&D> KJBDJ=:’$L%A>L>TCE’=>?CI>?:F>h6CGifC>jC>LH6>jC>f&>eH:>eH:><&BN>
3//*R>3*b+aR>c1++A
$)% 冉先德A>中华药海$?%A>哈尔滨出版社N>+cc*A>+37cA
$2% 许顶立N>袁 勇N>刘伊丽N>等A>血管紧张素 \\ 和血小板源生长因子 对血管平滑肌细胞和心肌细胞细胞周期素及 (3_ 蛋白的不同影 响$L%A>中华医学杂志N>+cccN>_cbcaR>7*12A
eH>fgN>jH&6>jN>g\h>jgN>! #$A>>fCYY:E:6=>:$(E:’’CB6>BY>DJDIC6’>&6F>
DJDIC6> F:(:6F:6=> UC6&’:> C69CC=BE> d3_> C6> G&’DHI&E> ’KBB=9> KH’DI:>
D:II’>&6F>D&EFC&D>KJBDJ=:’>D&H’:F>J>&6WCB=:6’C6>\\>&6F>df-T>’=CK1
HI&=CB6$L%A>k&=I>?:F>L>89C6N>+cccN>_cbcaR>7*12A$_% 5BH>TTN >89:E=B[>-?N >S&J>LN >! #$A >\6=:E&D=CB6>:=[::6>:=&>31> KCDEBWIBHIC6> &6F> &FG&6D:F> WIJD&=CB6> :6F> (EBFHD=’> C6> =9:> F:G:IB(K:6=>BY>FC&IJ’C’>E:I&=:F1&KJIBCFB’C’$L%A >SCF6:J>\6=N >+cc_N >
)+b)aR>+)+7>1cA
$^% l&E&’=:>,N>>dHIUUC>SN>S&II&mBUC>?N>! #$A>,(B(=B’C’>C6>9HK&6>&DH=:>
KJBD&EFC&I>C6Y&ED=CB6$L%A>8CEDHI&=CB6N>+cc_N>c)b3aR>*3/1*A$c% -B==IC:>@,N>SfNSIB6:E>@,N>! #$A>@:(:EYH’CB6>C6mHEJ>C61 FHD:’>&(B(=B’C’>C6>E&C=>D&EFCBKJBDJ=:’$L%A>L>8IC6>\6G:’=N>+cc7N>c7
b7aR+23+1^A
$+/% V:II’1U6:D9=>SLN >.N >V:II’1U6:D9=>?8N >! #$A >k:[> CBK&EU:E’>BY>?&CII&EF>E:&D=CB6>F&K&W:>=B>(EB=:C6$L%A>k:(9EBI>fC&I>
0E&6’(I&6=N>+cc2N>++blH((I:>+aR>)7+1_A
$++% ?C6>8N>S&6W>.N>jH>l5N>! #$A>,FG&6D:F>WIJD&=CB6>:6F>(EBFHD=’>C61
FHD:>&(B(=B’C’>&6F>(EBDB&WHI&6=>&D=CGC=J>C6>9HK&6>DHI=HE:F>HKCIC1
D&I>G:C6>:6FB=9:IC&I>D:II$L%A>fC&:=:’>@:’>8IC6>dE&D=N>+cccN>72b*aR> +c_13/3A$+3% j&K&WC’9C>lN>\6&W&UC>jN>nU&KB=BO0NO! #$AO,FG&6D:FOWIJD&=CB6O:6FO (EBFHD=1C6FHD:FO&(B(=B’C’OBYOG&’DHI&EO:6FB=9:IC&IOWEB[=9OY&D=BEO&6FO KB6BDJ=:O D9:KB&==E&D=&6=O (EB=:C61+O C6O 9HK&6(DHI=HE:FOK:’&6WC&IO D:II’$L%AOLO$+*% 徐珞珊 A中国药材学$?% A O北京 R O中国医药科技出版社 N O+]]2AO
++*2)A
$+7% 5&6OLN OS&6WOlN O89BH:O@N O! #$A O TE::O E&FCD&IO ’D&G:6WC6WO :YY:D=O BYO
%&’()*+’( ,#,&NOg&KC6&EC&Om&(B6CD&O&6FOh6F&EC&O(C66&=CYCF&$L%AOTC1 =B=:E&(C&NO3//3NO_*b_1^aRO_+/13A$+)% 89:6O-NOgHO5NOV&6WO8NO! #$AO.YY:D=OBYOYCG:O=EC=:E(:6BCFODBK(BH6F’O C’BI&=:FOYEBKOI:&G:’OBYO%&’()*+’( ,#,& B6O’=CKHIH’1C6FHD:FO’H(:EB$1
CF:O W:6:E&=CB6O &6FO =JEB’JIO (9B’(9BEJI&=CB6O C6O 9HK&6O (BIJKBE
(9B6HDI:&EOI:HUBDJ=:’$L%AO8IC6O89CKO,D=&NO3//3NO*3/b+13aRO++12A
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO第一军医大学学报bLOTCE’=O?CIO?:FOh6CGaOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO第 3* 卷2^3( (