全 文 ：47 卷　5 期
2007 年 10月 4 日
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
47(5):751～ 756
4 October 2007
基金项目:国家“ 863计划”(2002AA241091)
＊通讯作者。 Tel Fax:86-10-62894560;E-mail:gaohongwen@263.net
作者简介:张　薇(1979-),女(蒙),北京人 ,讲师 ,主要从事环境污染治理及环境与能源微生物研究。 E-mail:zhangw@ncepu.edu.cn
收稿日期:2007-01-16;接受日期:2007-02-05;修回日期:2007-06-22
西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性分析
张　薇1 ,2 , 3 ,胡跃高3 ,黄国和2 ,高洪文1＊
(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所　北京　100094)
(2华北电力大学能源与环境研究中心　北京　102206)　(3中国农业大学农学与生物技术学院　北京　100094)
摘　要:柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)是我国黄土高原区重要的饲用豆科灌木植物。为揭示土壤微生物与柠条
种植之间的关系 ,采用未培养技术提取样品宏基因组 DNA , 分别构建柠条根表 、根际和自然土 16S rDNA文库 , 分析
各文库微生物群落的变化。结果显示 ,随距离柠条根部渐远 , 微生物数量呈现递减趋势。聚类分析发现 , 变形杆菌
纲是根表土壤区系中的优势微生物种群(70.3%),尤其存在大量 α-Proteobacteria 类的能诱使植物形成根瘤的根瘤
菌和对植物有促生作用的γ-Proteobacteria 类微生物;而在根际和自然土中 , 酸杆菌属(Acidobacteria)和古菌(Archaea)
数量较多。柠条根际的多样性指数最高 ,而根表和自然土微生物类群具有较高的优势度 , 表现出从根表 、根际植物
相关微生物到自然土单一简单微生物类群的过渡。说明植物根系和土壤环境与微生物类群具有相互选择性。
关键词:16S rDNA;微生物多样性;柠条
中图分类号:Q939　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2007)05-0751-06
　　黄土高原是我国一个独特的地貌单元。由于自
然条件恶劣和人为活动过度 ,生态环境不断恶化 ,已
成为我国水土流失最严重的地区。植被恢复与重建
是进行水土保持 、防止土壤退化及加速生态恢复的
有效途径之一[ 1] 。柠条(Caragana korshinskii)是该地
重要的植被之一 ,由于基本分布于生态环境比较恶
劣地区 ,经过长期演变 ,大多数种都形成了明显的旱
生结构形态 ,具有较强的适应性和抗逆性 。其根部
定殖大量根瘤菌 ,可以固定游离态氮 ,因而有利改善
土壤氮素营养 、促进植被恢复和水土保持 。柠条还
是优良的饲料树种 、绿肥灌木 、薪炭和食用植物蛋白
资源 ,具有蜜源 、入药 、木质纤维等资源价值[ 2 , 3] 。因
其优良的生态—经济效益 ,已成为西部地区改善生
态环境的重要树种 ,显示了其特殊的作用[ 4] 。目前
柠条种植的研究主要集中于土壤水分 、养分变化的
关系 ,有关土壤微生物的多样性及其与柠条种植之
间的关系未见报道。
本研究采用未培养手段对黄土高原柠条种植区
土壤微生物群落进行研究 ,通过比较柠条根表 、根际
和自然土壤微生物多样性的变化揭示微生物与柠条
种植之间的关系 。为进一步研究植物与微生物的互
作以及合理利用微生物资源 、促进当地植被恢复 、生
态改良提供理论依据 。
1　材料和方法
1.1　样点描述和土样采集
土样采于山西省五寨县(39°00′22.9″N , 111°45′
39.7″E)柠条种植林 。该地属温带大陆性气候 ,年降
雨量 448mm ,平均温度 4.1℃～ 5.5℃,无霜期 100 ～
120d;土壤为黄土状淡栗褐土 ,无农作物种植;植被
以柠条人工林为主 ,面积约 3万 hm2 ,林分 30年以
上。所有土样在采前均除去地面植被和枯枝落叶 ,
铲除表面 1 ～ 2cm表土 。五点法收集自然土 、根际 、
根表样品[ 5] ,充分混匀后液氮速冻 , -70℃保存。样
点划分标准如下:a.柠条种植区外围土壤:离开林
区100 m外土壤 ,各取样点间隔 50m , “Z”型随机取
样;b.柠条根际土壤:取柠条根 ,抖掉大块土 ,用无
菌镊子小心刮下附在根系上的土壤 ,即为根际土;c.
柠条根表:将 b中得到的根带回 ,即为根表取样。
1.2　主要试剂和仪器
PCR反应用的各种试剂 、各种限制性内切酶 、T4
DNA连接酶 、载体 pMD18-T 、蛋白酶 K 、Tris 、EDTA 、
CTAB 、SDS 均购自大连 TaKaRa 公司;引物由上海
Shenergy Biocolor公司合成;DNA凝胶纯化试剂盒购
自Omega公司;其它生化试剂均为国产分析纯;PCR
扩增仪(Biometra ,Germany);电泳系统 Power Pac1000
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.2007.05.016
(Bio-Rad ,CA USA)。
1.3　样品总 DNA提取
土壤微生物总 DNA 提取方法根据文献[ 6] ,略
有改动。将5g土样溶于13.5mL DNA提取缓冲液中
(100mmol L Tris-HCl , 100mmol L sodium EDTA ,
100mmol L sodium phosphate , 1.5mol L NaCl , 1%
CTAB), 加入 100μL 蛋白酶 K(10mg mL), 37℃中
200r min 摇培 30min;加入 1.5mL 20%SDS , 65℃水
浴2h ,每隔 15 ～ 20min上下颠倒轻轻混匀;8000r min
离心 10min收集上清;在剩余土样中再加入 4.5mL
提取缓冲液和 0.5mL 20%SDS ,剧烈振荡 10s , 65℃
温浴 10min ,离心收集上清;加入等体积氯仿∶异戊
醇(24∶1),混匀后 8000r min离心 10 min;收集水相;
用 0.6 倍体积的异丙醇 -20℃沉淀 DNA 30min;
8000r min 、4℃离心30min;去上清 ,加1mL 70%乙醇 ,
轻混 ,8000r min离心 5min;去上清 ,无菌风吹干 ,加
50μL TE buffer溶解沉淀。总 DNA用 0.8%的琼脂糖
凝胶电泳检测 、DNA凝胶纯化试剂盒纯化 ,以备 PCR
扩增。
1.4　平板计数和细胞裂解效率
采用传统的形态划分标准 ,分别检测各样品中
可培养微生物的数量 。取 2 g 土样溶于 8 g灭菌水 ,
系列稀释后取 200μL涂布于 PDA 、LB和高氏 1号培
养基 ,分别置于 25℃、28℃和 28℃中培养 5 ～ 7d ,依
照文献[ 7]所述计测真菌 、细菌 、放线菌数量。同样方
法 ,计算裂解后土样的微生物数量 ,计算裂解效率。
1.5　16S rDNA文库构建
采用扩增细菌 16S rDNA 的保守引物 530F(5′-
GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)与 1494R(5′-GGYTACCTT
GTTACGACTT-3′)[ 8] ,以土壤宏基因组为模板扩增
16S rDNA 约 0.9kb。 PCR 扩增反应条件为:94℃
5min;94℃40s ,55℃40s ,72℃1min ,循环数 35;72℃
10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后 ,连
接 pMD18-T ,转化 E .coli DH5α,涂于添加 X-Gal 和
IPTG的氨苄抗性 LB 平板上。具体操作参考文献
[ 9] 。
挑取克隆子用M13引物验证片段大小 ,阳性克
隆双向测序(上海英骏生物技术有限公司)。
DNAMAN 软件合并序列 ,所得结果提交 GenBank ,
BLAST 软件对序列进行同源性比较 ,MEGA 3.1软件
进行遗传距离分析 。
1.6　土壤微生物多样性指数测度
借助群落生态学研究方法 ,以 Shanon-Weaner指
数H′[ 10] 计算群落多样性 ,以 Simpson指数 D[ 11] 计算
群落的优势度 ,以 Pielou指数 J[ 12] 计算群落均匀度:
H′=-∑Pi ·lnP i ,D =1 -∑Pi 2 , J =H′ lnS
以上式中 Pi为第 i种微生物占总个体数的比例 ,可
用 Pi=ni N求出 ,ni是第 i个属的菌株数 ,N为全部
属的菌株数之和 , S 为生理群数 。试验数据用
SPSS11.0 进行统计分析 。
2　结果和分析
2.1　微生物计数和细胞裂解率
平板培养法估测土壤中可培养微生物数量 。根
表区 、根际区 、自然土区每 g 样品中微生物总数分别
为 7.9×107 、3.5×106 和 2.0×106 cfu ,同时各样品中
均为细菌数量多于放线菌 ,放线菌多于真菌(表 1)。
微生物数量随距离柠条根部渐远而逐渐减少 ,根表
中最多 ,根际次之 ,自然土中最少 。
通过平板法检测 DNA提取前后可培养微生物
菌落数 ,估测出土样裂解效率约为 90%(表 2),保证
了基于未培养手段分析微生物群落结构的可靠性。
表 1　各土壤中可培养微生物数量(cfu g干土)
Table 1　Direct plate counts of individual samples of three soils(cfu g dry wt)
Site Fungi Bacteria Actinomyces Total
Rhizoplane (5.5±0.9)×104 a (6.1±0.4)×107 a (1.8±0.6)×107 a (7.9±0.9)×107 a
Rhizosphere (4.0±0.9)×104 a (1.2±0.3)×106 b (2.3±0.3)×106 b (3.5±0.1)×106 b
Bulk soil (6.5±0.7)×103 b (7.7±0.7)×105 b (1.2±0.2)×106 c (2.0±0.2)×106 c
　　Mean count ± standard deviation(n=5).Significant difference from the log numbers of preextraction and postextraction count at the 5% level.
表 2　各土样裂解效率比较
Table 2　Comparison of lysis effi ciency between the three soils
Rhizoplane Rhizosphere Bulk soi l
Preextraction cfu g(dry wt) (7.9±0.9)×107 a (3.5±0.1)a×106 a (2.0±0.2)a×106 a
Postextraction cfu g(dry wt) (3.2±0.3)×105 b (3.5±0.5)×105 b (2.0±0.3)×105 b
Lysis efficiency % 99.6 89.9 90.1
　　The same as notes in Table 1 above.
752 ZHANG Wei et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)
表3　3样品中微生物类群遗传分类
Table 3　Phylogenetic affiliations of 16S rDNA gene clone libraries at three sites
Phylogenetic gorup
No.(%)of organisms identified
Rhizoplane Rhizosphere Bulk soil Total
Archaea 2(5.4) 6(14.0) 6(25.0) 14(13.5)
　Crenarchaeota 2(5.4) 6(14.0) 6(25.0) 14(13.5)
Bacteria 33(89.2) 31(72.1) 17(70.8) 81(77.8)
　Green nonsulfur bacteria 0 1(2.3) 1(4.2) 2(1.9)　Low-G+C Gram positive 1(2.7) 0 0 1(1.0)
　High-G+C Gram positive 2(5.4) 2(4.7) 3(12.5) 7(6.7)
　Cy tophaga-Flexibacter-Bacteroids 2(5.4) 1(2.3) 0 3(2.9)　Planctomyces 1(2.7) 2(4.7) 1(4.2) 4(3.8)
　Verrucomicrobium 1(2.7) 2(4.7) 1(4.2) 4(3.8)
　Proteobacteria 26(70.3) 9(20.9) 5(20.8) 40(38.5)
　α 6(16.2) 4(9.3) 2(8.3) 12(11.5)　β 2(5.4) 0 0 2(1.9)
　γ 18(48.6) 4(9.3) 3(12.5) 25(24.0)
　δ 0 1(2.3) 0 1(1.0)
　Acidobacteria 0 14(32.6) 6(25.0) 20(19.2)
Unclassified 2(5.4) 6(14.0) 1(4.2) 9(8.6)
Total clones sequenced 37 43 24 104(100)
2.2　16S rDNA文库构建和遗传分析
从根表 、根际和外围 3个 16S rDNA 文库中挑取
克隆子测序 , 所得结果经过比对和整理后提交
GenBank ,登录号为 AY942940 ～ AY943043。参照文
献[ 13]将所有克隆划分为10大生理类群 ,包括 1个
未知种群(表 3),并构建根表 、根际和自然土中微生
物聚类分析树状图(图 1 、2 、3)。结果表明 ,
Proteobacteria是各类土壤区系中的常见类群 ,占微生
物总量38.5%,此外 Acidobacteria和 Crenarchaeota类
微生物也数量较多 ,分别达到 19.2%和 13.5%。
Proteobacteria是根表土中一类重要的优势种群 ,
占总克隆子数 70.3%(图 1 ,表 3)。其中 , γ类克隆
子共 18个 ,占总 Proteobacteria类群的 69.2%,包括
图 1　根表土壤微生物遗传关系聚类分析树状图
Fig.1　Phylogenetic tree showing the relationship of 16S rDNA gene sequences amplified from rhizoplane of C.korshinskii to those of representatives
of bacteria ,whose sequence accession numbers are shown in parenthesis.The scale bar represents 0.05 substitut ions per base position.
Each bootstrap value is expressed as a percentage of 1000 replications.
753张　薇等:西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性分析. 微生物学报(2007)47(5)
促进植株健康生长的 Enterobacter 和 Pseudomonas属
等植物有益促生菌 ,如 Pseudomonas属微生物 ,占到
克隆子总数 30%;Proteobacteria 中 α类占总数的
23.1%和总克隆子数的 16.2%,其中包含促进植株
形成根瘤的 Rhizobium sp.和 Sinorhizobium sp.等属 。
此外还发现 5.4%的古菌类微生物 。有趣的是 ,此
文库中有少量低 GC 含量的革兰氏阳性菌和 β-
Proteobacteria , 没有 Acidobacteria 和 Green nonsulfur
bacteria类微生物 ,这与根际区和自然土文库中情况
正好相反 。
图 2　根际土壤微生物遗传关系聚类分析树状图
Fig.2　Phylogenetic tree showing the relationship of 16S rDNA gene sequences amplified from rhizophere
of C.korshinski i to those of representatives of bacteria.The same as that in Fig.1.
　　从图 2可以看出 ,根际土壤中微生物种类丰富 ,
类群较多 。 Acidobacteria 为主要类群(32.6%)。在
Proteobacteria中 ,具有一定数量的 α类和 γ类细菌
(9.3%)。 此 外 还 有 少 量 Planctomyces 、
Verrucomicrobium、高 (G +C)革 兰氏 阳性菌 和
Archaea ,可见根际环境具有较高的微生物多样性。
自然土中微生物类群较少(图 3),Archaea(25.0%)、
Acidobacteria(25.0%)类微生物具有很高的优势度。
754 ZHANG Wei et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)
高GC含量的革兰氏阳性菌也有一定数量。
2.3　微生物物种多样性分析
对柠条种植区土壤微生物生理群的多样性变化
分析结果表明 ,根际区土壤中微生物种类最多 ,其多
样性指数明显高于自然土 ,均匀度最高而优势度最
小 ,根表和自然土微生物类群优势度都较高(表 4),
说明微生物群落的变化与环境条件密切相关 。
表 4　各土壤微生物多样性指数比较
Table 4　Changes in microbe physiological group
diversity indicesmand community richness
sites N S H′ J D
Rhizoplane 37 10 2.0313 0.7318 0.8631
Rhizosphere 43 12 2.1670 0.9245 0.7484
Bulk soil 24 9 1.6851 0.8721 0.8506
图 3　自然土壤微生物遗传关系聚类分析树状图
Fig.3　Phylogenetic t ree showing the relationship of 16S rDNA gene sequences amplified from bulk soil
of C.korshinski i to those of representatives of bacteria.The same as that in Fig.1.
3　讨论
在微生物类群上 ,按距离柠条植株由近至远的
顺序 ,α-Proteobacteria 、γ-Proteobacteria 和低(G+C)革
兰氏阳性菌的数量逐渐减少 ,而高(G+C)革兰氏阳
性菌和Archaea 逐渐增多 。根表 、根际 、自然土 3个
区系中的优势种群各不相同 ,分别为 Proteobacteria 、
Acidobacteria 和 Archaea 。在根表发现大量的固氮
菌 ,如 Rhizobium 属和Sinorhizobium 属 ,柠条是否具
有特殊的根瘤菌类群还有待进一步研究。此外 , γ-
Proteobacteria亚纲的 Pseudomonas和Enterobacter属中
有人们熟知的多种植物有益促生菌(PGPR)和内生
菌[ 14] ,对植物生长有良好促进作用 ,也主要分布在
根表。许多研究表明 ,这类微生物产生的次生代谢
物或植物激素 ,可以有效防治病虫害 ,促进植物正常
生长[ 15] 。值得的注意的是 ,在根际和自然土中发现
有较多的 Acidobacteria 分布。目前对该类微生物研
究较少 ,发现其主要分布在洞穴 、海底沉积物 、活性
淤泥等场所[ 15] 。这类不可培养的微生物自然界中
还存在很多 ,其特定的生态功能有待于进一步研究。
多样性指数是反映群落结构特征的重要指
标[ 16] 。对柠条种植区土壤微生物生理群的多样性
变化分析结果表明 ,多样性指数和均匀度均为根际
最高 。说明经过多年生长 ,柠条根际土壤中形成了
丰富的微生物类群 ,各类群在柠条根际区土壤中形
成了稳定的生态分布 ,结构复杂 ,功能稳定 ,均匀度
和多样性指数最高 ,群落优势度不明显;相比较而
言 ,外围土壤中的微生物多样性指数最低 ,这与黄土
755张　薇等:西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性分析. 微生物学报(2007)47(5)
高原的特殊地貌直接相关;根表的微生物优势度最
高 ,这主要由于植物根系发达 ,植物相关微生物数量
显著增加 。本研究采用克隆文库随机测序的方法研
究微生物多样性 ,可以直接获得微生物的分类地位 ,
但由于测序数量和费用的限制不能完全反映微生物
种群和多样性的变化 ,还需要与 DGGE 、RFLP 等分
子手段相结合。
参 考 文 献
[ 1 ] 苏永中 ,赵哈林.科尔沁沙地不同土地利用和管理方式对土
壤质量性状的影响.应用生态学报, 2003 , 14:1681-1686.
[ 2 ] 牛西午.柠条研究.北京:科学出版社 , 2003.
[ 3 ] 郑敏燕 , 魏永生.藏锦鸡儿原药材中总黄酮含量的初步测
定.青海大学学报(自然科学版), 2001, 19:10-11.
[ 4 ] 张继敏 ,梁桂英, 徐朗然.陕北柠条的种群分类及其与水土
保持和固沙的关系.陕西林业科技 , 1996 , 3:18-22.
[ 5 ] Marilley L ,Vogt G , Blanc M , et al.Bacterial diversity in the bulk
soil and rhizosphere f ractions of Lolium perenne and Trifolium repens
as revealed by PCR restriction analysis of 16S rDNA.Plant and
Soil , 1998, 198:219-224.
[ 6 ] Lee SY , Bollinger J , Bezdicek D , et al.Estimation of the abundance
of an uncultured soil bacterial strain by a competitive quantitative
PCR method.App.Environ Microbiol , 1996, 62:3787-3793.
[ 7 ] Smit E , Leef lang P , Gommans S , et al.Diversity and seasonal
　　　
fluctuations of the dominant members of the bacterial soi l community
in a wheat field as determined by cultivation and molecular methods.
Appl Environ Microbiol , 2001 , 67:2284-2291.
[ 8 ] Lane DJ. 16S 23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E ,
Goodfellow M (eds).Nucleic Acid Techniques in Bacterial
Systematics.New York:Wiley , 1991.115-175.
[ 9 ] Sambrook J , Russell DW.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.
3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,2001.
[ 10] Hill TCJ ,WalshKA ,Harris JA.Using ecological diversity measureswith
bacterial communities.FEMS Microbiol Ecology ,2003, 43:1-11.
[ 11] Magurran AE.Ecological Diversity and Its Measurement.New
Jersey:Princeton University Press.1988:86-97.
[ 12] 马克平 , 刘玉明.生物多样性的测度方法 Ⅰ .α多样性的测
度方法(下).生物多样性 , 1994 , 2(4):231-239.
[ 13] Olsen GJ , Woese CR , Overbeek R.The winds of (evolutionary)
change:breathing new life into microbiology.J Bacteriol , 1994 ,
176:1-6.
[ 14] 胡江春 ,薛德林 ,马成新 ,等.植物根际促生菌(PGPR)的研究
与应用前景.应用生态学报 , 2004 , 15(10):1963-1966.
[ 15] Schabereiter-Gurtner C , Saiz-Jimenez C , Pińar G , et al.Altamira
Cave Paleolithic paintings harbor partly unknown bacterial
communities.FEMS Microbiol Lett , 2002 ,211:7-11.
[ 16] Urakawa H , Kita-Tsukamoto K , Ohwada K.Microbial diversity in
marine sediments from Sagami Bay and Tokyo Bay , Japan , as
determined by 16S rRNA gene analysis.Microbiology , 1999 , 145:
3305-3315.
Soil microbial diversity of artificial peashrub plantation on North Loess Plateau of China
ZHANG Wei
1 , 2 ,3 ,HU Yue-gao3 ,HUANG Guo-he2 ,GAO Hong-wen1＊
(1 Institute of Animal Science , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100094 , China)
(2 Energy and Environmental Research Center , North China Electric Power Universi ty , Beijing 102206, China)
(3 College of Agronomy and Biotechnology , China Agricultural University , Beijing 100094, China)
Abstract:Peashrub(Caragana korshinskii Kom)is a kind of excellent shrub used for dune-fixation in Loess Plateau of
China.In order to explore relationship between peashrub and soil microorganisms , microbial communities diversity
associated with rhizoplane , rhizosphere and bulk soil of peashrub in Loess Plateau of China were characterized based on a
culture-independent approach.Three 16S rDNA gene libraries were constructed , respectively , and each different profile
was used to define an operational taxonomic unit (OTU).The numbers of microorganisms decreased as root proximity
decreased and a few OTUs became dominant.Phylogenetic analyses indicated that Proteobacteria was the predominant
group in rhizoplane ,which included manyα-Proteobacteria ,partially consisted of rhizobia , andγ-Proteobacteria beneficial
to plant growth.In bulk soil , the most frequent OTUs were closely related to Archaea , while Acidobacteria was the
dominant group in rhizosphere of peashrub.The diversity index (H′)was higher in rhizosphere than in rhizoplane and
bulk soil ,whereas microbial populations in rhizoplane and bulk soil had the greater dominance indices(D).It was shown
that there was a significant change in microbial species composition along the root gradient , shifting from complex plant-
associated bacterial community in the root habitats to a simple bacterial community in the bulk soil.These results showed
that plant roots and soil conditions created a selective environment for microbial populations.
Keywords:16S rDNA;microbial diversity;Caragana korshinskii
Foundat ion item:National Programs for High Technology Research and Development of China(2002AA241091)
＊Corresponding author.Tel Fax:86-10-62894560;E-mail:gaohongwen@263.net
Received:16 January 2007 Accepted:5 February 2007 Revised:22 June 2007
756 ZHANG Wei et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)