全 文 ：福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
J O URN AL OF F J U皿 AN T E A Ct I ER S UN IV ER S IT Y
(N AT UR AL S C IEN C E )
5( 3 ): 76
·
79
1 98 9
赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子体外
抑制作用及其作用机理的初步探讨 .
杨同成 李田 土
(福建师大 )
胡 铃 男
(福州市第二医院 )
摘 要
本文首次报道 , 用从 中药赤小豆 ( P人a se o工u s co 忿e ar a t“ 5 R ox b ) 中提纯的眺蛋 白 薛
抑制 剂 , 剂量在 4。。林g /。 . 2m l以 上 , 在休外能 全部抑制人体精子 . 该抑制 剂对人休 精 子
顶体粒蛋 白亦有较强的抑制作用 , 初步探计 了它时人体精子顶体拉蛋白的抑 制 作 用 机
理 . 通过进一 步研 究 , 赤 小豆抑制 荆可望成为一种新型的避孕药 .
关健词 : 赤 小豆 , 眺蛋白酶 , 抑制荆 , 人体精子 , 顶体拉蛋白
由于顶体粒蛋白具有类似胰蛋白酶的性质 , 能使卵细胞的透明带水解出一条通道 , 使
精子顺利穿过透明带与卵细胞融合而受精 . 因此 , 如能有效地抑制顶体粒蛋 白的活 力 ,
就 能 控 制 受精 , 从而肴计划地控制人口的增长 , 这在计划生育工作方面是很有现实意
义的 . 近二十多年来 , 国内外许多学者广泛研究了来自动植物体的胰蛋白酶抑制荆对顶
体粒蛋白的抑制作用 〔’ , ’ ] . 然而 , 有关赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子顶体粒蛋白的
抑制作用 , 在国内外尚未见报道 . 本文首次报道赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子的体
外抑制作用及其作用机理 .
1 实验部分
1
.
1 实脸材料
赤小豆胰蛋白酶抑制剂 : 本室制备的电泳纯样品 [3 1 .
人体精子顶体粒蛋白 : 福州市第二医院提供正常人精液 , 由我室提纯人体精子顶体
拉蛋白电泳单点纯样品 [弓 ] .
1
.
2 试摘
苯甲酞一D L 一 精氨酞对硝基苯胺 ( B A P N A ) , 苯甲酞精氨酸乙醋 ( B A E E ) 均为上
海生物化学研究所东风试剂厂产品 , 酪蛋白为上海化学试剂采购供应站分装品 , 其他试
剂均为 A R 级 .
. 本文于 1 9 8 9年 3月 5日收到 .
3 期 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子体外抑制作用及其作用机理的初步探讨 7
1
.
3 实脸方法
1
.
3
.
1 人体精液的检测及评定
精液收集对象 : 选择 12 、 03 岁的青年男子共 5例 , 均在禁止房事至少 2天后 , 用手淫
法取得精液样本 .
人体精液的检测方法和标准评定主要参考文献 〔5〕和文献 〔的 , 结果见表 1 . 精 子 抗
一2一例
裹 1
项 目 {正常标准 {例 i
精液检洲结果
例 3 }例
4 例 5
色 泽 }
精液量 ( m l) .
精 子 数 .
( 1 0
.
/m l )
!
精子活率 ( 呱 )…
精 液 P H }精 子 抗 力 {
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乳白色
2、 6
乳 白色
2
乳白色
2
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3
乳白色
2
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5
乳 白色
2
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> 5 0
7
。
2 、 8。 0
> 3 0 0 0
2 5
。
3
6 0
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7
。
5
4 0 0 0
7
。
5
4 0 0 0
7
。
5
5 0 0 0
6 0
7
。
5
4 0 0 0
7
。
5
3 5 0 0
力是指吸取原精液 o . 02 m l , 在 15 分钟内可加入 1肠 N a cl 溶液的总量 , 用以判断精子对
1肠N a C I液耐受量的大小 . 具体可按下列公式求出抗力指数 :
精子抗力 二 加入的 1肠 N a C I液总量 ( m l )
0
.
0 2
精子对 1帕 N a cl 液耐受量愈大 , 则精子抗力愈强 , 抗力指数一般不低于 3 0 0 0 . 抗力
大小可作为精子质量优劣的参考 . 表 1表明 , 5例精液均符合正常标准 , 属于正常精液 ,
可作为赤小豆抑制剂对人体精子体外抑制试验及提纯顶体粒白蛋的实验材料 .
1
.
3
.
2 赤小豆抑制剂对人体精子的体外抑制试验
用生理盐水将赤小豆抑制剂稀释成不同浓度 , 分别取不同浓度的抑制剂稀 释 液 各
o
.
Zm l以及用生理盐水稀释 10 倍的精液 o . 03 m 1( 以不 加精液的作为对照 ) , 分别滴在载
裹 2 赤小豆抑制荆对人体精子体外抑制作用的试验结果
号
{
1
{
2
}
3
{
4 …
精 , 量 ( m , )·
{
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抑带,}率 (肠 ) { o {9 8· “ {9 9· 7! ” }9 8 · “ }9 9 · 7 } ” }9 8· 619 9 · 7…” {9 8· “ }9 9 · 7 } 。 }9 8 · 6 {9 9· 7
( 一 ) 表示不抑制 : · 为原精液稀释 10 倍后的量 。
《 福 建 师 范 大 学 学 报协 自 然 科 学 版 198 9年 9月
物片上 , 混匀后在高倍显微镜下观察 . 记录从赤小豆抑制剂与精液混合时开始 , 至精子
完全处于停止活动时所需的时间 . 整个试验均在室温下进行。 表 2实验结果表 明 , 赤 小
豆胰蛋 白酶抑制剂的剂量至少要在 40 邻愁/ 0 . 2m l以上 , 才能全部抑制或杀死体外的人 体
精子飞
1
.
3
。
3 赤小豆抑制剂对人体精子顶体粒蛋白的抑制反应
赤小豆胰蛋白酶抑制剂的活力测定和抑制常数的计算均按文献报道的方法 f 7 , 召了. 以
下各项试验中 , 赤小豆胰蛋白酶抑制剂 仁r 〕 的用量均为 3阳 / 1 . o m l .
试验 l : 以酪蛋白为底物 , 底物浓度为 r 畅 . 取不同体积 的 〔 I 〕和 E ( 顶体粒蛋白
琳 g / 1 . o m l 混匀 , 再加 , o . 05 m of / L p H 7 . 8 的磷酸缓冲液至 2 . Om l . 37 ℃反应 10 分钟 , 各
加底物 1 . o m l 后再反应 20 分钟 . 最后加入 15 肠 T C A I . o m l 停止反应 . 按 L o w yr 蛋 白质
Wl] 定法 , 测定在 6 8 0 n m 下光密度的变化 , 结果见图 1 .
试验 2 : 以 B A E E为底物 , 用 o . o s m o l / L pH s . o的介15 一 H e x缓冲液 ( 内含 o . o l m o l / L
C a cl
:
) 配制 , 使终浓度为 0 . 8 x l 。一 “ m ol / L . 取不同体积 I[ 〕加 o . s m 1 E (顶体粒蛋白 1陀 /
。 . s m l) , 均用同一缓冲液补充至工. o m l . 25 ℃反应 10 分钟后 , 加入 B A E E 3 . 0m l , 再反应
10 分钟后 , 立即在 2 5 3 n m下测定光密度的变化 , 结果见图 2 .
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图 1 抑制荆对人体精子顶体粒蛋
白水解漪蛋白的抑制作用
I ( m l )
图 2 抑制荆对人体精子顶体粒蛋
白水解 B A E七的抑制 作用
次只触ǎ卿材谧妞镊
声验 3 : 以 B A咖 A 为底物 , 一浓度为 36 。`她 /
1
.
o m l
,
. 取不同体积 〔I〕加 E O . sm l ( 顶体粒 蛋白
l协g / 0 . s m l ) , 用0 . 0 5m o l / L p H S . o 的 T r主s 一 H C I 缓
冲液补充至 l . Om l . 37 ℃ 反应 10 分 钟 后 , 加 入
B A P N A 2
.
sm l
,
37 ℃ 再反应 10 分钟后立 即加入
3 6肠醋酸溶液 0 . 5m l 终止反应 . 用 7 21 型分光光度
计 ( 4 1 On m )下测定光密度的变化 , 结果见图 3 .
在以酪蛋白 、 B A E E和 B A P N A 为底物时 , 赤
小豆抑制剂对人体精子顶体粒蛋白的 当 量 比 值
分别为 1 , 1 . 49 、 1 : 1 . 56 和 1 : 从 39 , 其抑制常
数分另!1为 1 . 2 5 又 1 0 一 3 m o l / L 、 1 . 5 x l o 一 “ 咖 l / L 和
I (口 l )
圈 3 抑制荆对人体精子顶体粒蛋
它水解B A P N A的抑制作用
3期 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子体外抑制作用及其作用机理的初步探讨
1
.
l x1 0
一 , m ol / L
. 赤小豆胰蛋白酶抑制剂是从中药赤小豆中提取的一种仅对胰蛋白酶有
抑制作用的专一性蛋 白酶抑制剂图 . 图 1、 图 3所示的抑制曲线与赤小豆抑制 剂 对 胰 蛋
白酶的抑制曲线相似 , 表明赤小豆胰蛋白酶抑制剂亦能抑制人体精子顶体粒白蛋 ·
2 讨论
上述试验结果表明 , 赤小豆胰蛋白酶抑制剂不仅在体外能抑制人体精子 , 也能抑制
人体精子的顶体粒蛋白 . 周元聪 [ ’ ]在综述蛋白酶抑制剂的作用时认为 , 对于完整的精子 ,
顶体 粒 蛋 白 的抑制剂必须穿过精子的浆膜和外顶体膜 , 才能与顶体粒蛋白相结合 . 情
子膜表面分布一层带负电荷的基因 ( 如 二c o o 一 等 ) , 它们能排斥带负电荷的抑制 剂 ,
而有 利 于 带 正电荷 的抑制剂通过精子膜与顶体粒蛋 白相结合 . 可是 , 从赤小豆抑制剂
组成来看 ` 3 , , 比其他植物性胰蛋白酶抑制剂含有较多的碱性氨基酸及较少酸性氨基酸 ,
也许将更容易穿过顶体膜 , 与顶体粒蛋白相结合 , 使酶失去活性 . 因此 , 赤小豆胰蛋 白酶
抑制剂有希望成为一种新型避孕药 . 但我们的试验还仅限于体外抑制作用 , 对受精过程
影响如何 , 还有待进一步研究 .
参 考 文 献
〔1〕 周元聪 . 生理科学进展 , 10 86 , 1 7 ( 3 ) : 2 2 1~ 22 2
〔2〕 张燕林 , 谢衷明 , 顾锡根 . 生殖与避孕 , 1 9 84 , 4 (3 ) : 9~ 10
〔3〕 杨同成 , 李田土 . 国际水溶性高分子学术讨论会论文摘要集 , 1 9 8 8 , 1 4一 1 16
〔41 杨同成 , 李田土 , 胡徐男 . 福建师范大学学报 ( 自然科学版 ) , 待发表 ·
[ 5〕 郝金瑞 , 曹坚 . 中级医刊 , 19 8 4 , 19 ( 7 ) : 魂s ~ 46
[ 6〕 郭纲碗 , 张荫槐 . 药学通报 , 19 5 4 , 1 9 ( 10 ) : 2`
臼〕 屈贤铭 , 戚正武 . 生物化学与生物物理学报 , ’ 19 63 , 3 ( 2 ) : 2 29 ~ 2 30
仁s 〕 G r e e n N M , w o r k E . P a n e r e a t i e t r y p s i n I n 五i b i t o r l , R e a e t i o n w i t五 T r y p s i n . B i o e h e m . J . , 一9 5 3
5 4 , 3 4 7
。
阳〕 杨同成 , 李田土 , 谢亦鲁 . 国际水溶性高分子学术讨论会论文摘要集 , 1 9 88 , 1 1~ 1 3
P r e l im i n a r y E x P l o r e o f t h e Ihn i b i t i n g E fe
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M e e h a n is m o 空 厂幼 a s e o爪 5 c a c/ a 耀 f ,` s T汀 P s i n Ihn i b i t o r
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o f i t 15 o v e r 4 0 0协吕/ 0 . 2m l , a n d i t ha s s t orn g
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P u r i f i e a t i o n f r o m
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.
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K e y w o r d s : C h i一 i a o 一d o u ( P h a s eo l u s C a 忿ca r a t u s R ox b ) , a e r o s i n , t r y P s i n i n h i b i t o r -
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