全 文 :基金项目:安徽省质量工程项目(编号:2014zy078)
作者简介:卫强(1977-),男,安徽新华学院副教授,硕士。
E-mail:weiqiang509@sina.com
收稿日期:2015—12—21
第32卷第8期
2 0 1 6年8月 食 品 与 机 械
OOD&MACHINERY Vol.32,No.8
Aug.2 0 1 6
DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.006
葱兰叶挥发油成分分析及其对鲜牛奶的抑菌作用
The analyses on chemical components in the leaf volatile oils of Zephyranthes
candida(Lindl.)Herb.and their antimicrobial activities in the fresh milk
卫 强
WEI Qiang
时雪风
SHI Xue-feng
(安徽新华学院药学院,安徽 合肥 230088)
(Pharmacy School,Anhui Xinhua University,Hefei,Anhui 230088,China)
摘要:采用水蒸气蒸馏(SDE)和超临界二氧化碳(SFE-CO2)提
取叶中挥发油,以 GC—MS检测分析,考察挥发油在4℃、
10d内对鲜牛奶致腐菌的抑菌效果。结果表明:两者不同成分
有39种,其中SDE挥发油中主要有甲基环己烷、二十八烷、间
二甲苯、邻苯二甲酸二丁酯;SFE-CO2挥发油主要有4-(4-乙基
环己基)-1-戊基-环己烯、甲苯、邻苯二甲酸二异辛酯、1-乙氧基
戊烷、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚。两者相同
成分有16种,含量差异较大。SFE-CO2挥发油抑菌作用较强,
MIC值范围为0.031~0.125mg/mL。SFE-CO2挥发油成分为
浓郁香气和更强的防腐效果提供了物质基础。
关键词:葱兰叶;挥发油;鲜牛奶;抑菌活性;SDE;SFE-CO2
Abstract:Two kinds of volatile oil were extracted by steam
distilation extraction(SDE)and supercritical fluid extraction of CO2
(SFE-CO2),and then they were identified by gas chromatography-
mass spectrometry (GC—MS).The antimicroble effects of the
extract on different rot funguses in fresh milk was evaluated in 4℃
within 10days.There were 39different components in the two kinds
of volatile oil,including methyl cyclohexane,octacosane,1,3-dime-
thyl-benzene,and dibutyl phthalate mainly found in the SDE volatile
oil,and 4-(4-ethylcyclohexyl)-1-pentyl-cyclohexene,toluene,1,2-
benzenedicar-boxylic acid,disooctyl ester,1-ethoxy-pentane,2-me-
thoxy-4-vinylphenol,and 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol mostly
presented in the SFE-CO2volatile oil.The differences among the
contents of 20common components in two oils was great.The SFE-
CO2volatile oil showed more effective antimicrobial activity with the
MIC range of 0.031~0.125mg/mL.Moreover,those from SFE-CO2
volatile oil could also provide better exotic perfume and stronger an-
tiseptic functions.
Keywords:leaf from Zephyranthes candida(Lindl.)Herb.;volatile
oil;fresh milk;antimicrobial activities;SDE;SFE-CO2
鲜奶含有丰富的脂肪、蛋白质、乳糖[1],营养成分丰富。
但极易发生变质、酸败,如乳酸菌可分解乳糖使牛奶发酵[2];
胨化菌使牛奶发生非酸性凝固,产生腐败气味[2];荧光假单
胞菌产生脂肪酶分解乳脂而生成具有臭味的低级酮类[3];产
气菌分解碳水化合物,产生二氧化碳、氢气、乳酸和有机酸,
发生产气、酸性凝固现象[3]。目前,牛奶非法添加的化学防
腐剂有不同程度的毒性或副作用,如苯甲酸可引起精子畸
形[4],对消化道内微生物以及消化道pH 有一定影响[5],尼
泊金酯类对雌性激素有影响[6],并有试验[3]表明其对男性睾
丸存在危害。挥发油是多种小分子挥发性化合物的油状物
质,其作为抑菌剂和防腐剂的作用已被证实,如肉桂精油可
强烈抑制细菌、霉菌和酵母[7],柑橘精油及其主要成分D-柠
檬烯可抑制大肠杆菌、金葡菌、枯草芽孢杆菌、酵母、黑曲霉,
应用于橙汁防腐[8]。
葱兰(Zephyranthes candida(Lindl.)Herb.)是石蒜科葱
兰属植物,别名葱莲、玉帘、白花菖蒲莲、韭菜莲、肝风草,原
产南美[9]。由于葱兰色泽艳丽、花期长,近年来被广泛用于
城市园林绿化和观赏植物,世界各国均有引种栽培[10],在中
国栽培广泛。葱兰含有生物碱[11]、黄酮[12]、凝集素[13]、挥发
油[14]等成分,药理试验[15]证明其生物碱成分对人上皮癌细
胞、人表皮癌细胞、鼠淋巴肿瘤细胞P388-D1等有较强的抗
肿瘤活性,挥发油成分具有清除 DPPH 和 ABTS自由基作
用[14]。传统的SDE提取具有高温,易引起挥发油成分氧
化[16]。SFE-CO2萃取技术可实现常温提取和保持热敏性成
分不被热分解[17],可有效富集芳香活性物质,使挥发油更接
近天然香韵[18]。葱兰叶中挥发油具有浓郁的香气,其化学
成分研究国内外还未见报道。本研究拟运用SDE和SFE-
CO2提取葱兰叶中挥发油,以气相色谱—质谱联用(GC—
MS)研究其成分,进一步比较两种提取挥发油的成分和对鲜
牛奶抑菌作用的差异,从该芳香植物中筛选天然活性成分,
12
扩大在食品行业的应用。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
葱兰叶:于2014年5月采自安徽合肥大蜀山地区,标本
存于安徽新华学院药学院实验室;
鲜牛奶:批号20151002,光明乳业有限公司;
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)、腐败假单胞菌(Pseudomonadaceae
putrefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜杆
菌(Clostridium perfringens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、保加利亚乳杆菌(Lacto-
bacillus bulgaricus):中国菌种保藏中心;
溶菌酶:酶活力>2万U/mg,上海谷研实业有限公司;
所用试剂均为分析纯;
超临界萃取设备:HA221-50-01型,江苏南通华安超临
界有限公司;
气相色谱仪:Agilent 6890-5973N型,安捷伦科技(中国)
有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 挥发油的提取 精密称取干燥粉碎后的葱兰叶200g
装入料筒,等份,一份以水蒸气蒸馏装置提取,收集油水混合
物,以无水硫酸钠脱水,得挥发油,呈近无色,香味较淡;另一
份放入超临界萃取装置萃取釜内,设置萃取压力45MPa,萃
取温度20℃,萃取流量20L/h,萃取1.5h后,打开分离釜排
料阀,收集萃取物。萃取物经减压蒸馏后分别以环己烷、乙
醚萃取,氮气吹去溶剂,得到挥发油,挥发油几近无色,香气
浓郁。
1.2.2 色谱条件 HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×
0.25μm),载气为高纯氦,不分流,进样量1μL;程序升温,柱
起始温度为40℃,保持1min后以5℃/min升至200℃,保
持2min,再以10 ℃/min升至280 ℃,保持5min,再以
5℃/min升至300 ℃,保持至完成分析。电子轰击能量
60eV,扫描范围m/z 25~550,离子源温度220℃,接口温
度280℃,全离子扫描。
1.2.3 对牛奶的抑菌试验 以溶菌酶为对照,制备溶菌酶、
葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油肉膏平板培养基,浓度依次为
2.000,1.000,0.500,0.250,0.125,0.062,0.031,0.016mg/mL。
在以上培养基上分别接种粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、
腐败假单胞菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜杆菌、大肠杆菌、粪
产碱杆菌、保加利亚乳杆菌,移入培养箱中37℃培养48h,
计算溶菌酶、葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油的最小抑菌浓度
(minimum inhibitory concentration,MIC),选择整体抑菌效
果较好的挥发油组进行如下试验。
取800mL的鲜牛奶均分为8份,鲜牛奶组设为空白对
照组,加入质量浓度0.05%的溶菌酶鲜牛奶组设为阳性对照
组,葱兰叶SDE和SFE-CO2挥发油均以10%吐温-80溶液
稀释,分别按照质量浓度0.02%,0.04%,0.06%加入鲜牛奶
设为样品组。采用平板菌落计数法(参照 GB 4789.2—2010
《食品微生物学检验 菌落总数测定》),分别按照一定的稀
释梯度稀释,贮藏于冰箱4℃冷藏一定时间(0,2,4,6,8,
10d),按式(1)计算菌落总数:
N = ∑C(n1+0.1n2)d , (1)
式中:
N———样品中菌落数,CFU;
∑C———平板菌落数之和,个;
n1———低稀释倍数平板个数,个。
n2———高稀释倍数平板个数,个。
d———稀释因子。
1.2.4 数据处理 通过面积归一化法测定鉴定的化合物的
相对含量,检索为NIST2011数据库。
2 结果与讨论
2.1 葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油化学成分
葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油化学成分测定结果见图1
和表1~3。
由表1可知,从葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共鉴定
出55种化学成分,主要有烃类、酯类、苯类、醇类、醛类、酮
类、酸类、醚类、杂环类等。其中从葱兰叶SDE和SFE-CO2
挥发油中共鉴定出37,34种挥发性成分,分别占总挥发性成
分的74.16%,92.40%。由表2可知,SFE-CO2挥发油中醇
类、烃类、苯类、醛类、酮类、酯类含量均高于SDE挥发油,且
不含酸类、醚类、杂环化合物,说明两者挥发油含量和种类差
别较大。由表3可知,两者挥发油的特征成分具有显著差
异,SDE和SFE-CO2挥发油中最高含量的化学成分分别是
甲基环己烷(15.96%)、4-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯
(8.73%)。与文献[14]葱兰花SDE挥发油成分相似。但花
图1 葱兰叶中挥发油总离子流
Figure 1 Total ion chromatogram of SDE and SFE-CO2vol-
atile oil of leaf from Zephyranthes candida
(Lindl.)herb.
22
基础研究 2016年第8期
表1 葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中化学成分
Table 1 SDE and SFE-CO2 volatile oils'chemical
constituents of leaf fromZephyranthes candida
(Lindl.)Herb.
种类
保留时
间/min
化合物名称
相对含量/%
SDE SFE-CO2
烷烃
类
4.834 1-乙氧基戊烷 - 6.36
5.077 甲基环己烷 15.96 -
17.153 十二烷 - 0.42
18.885 2,6,10-三甲基十四烷 0.30 0.36
19.957 十三烷 - 1.29
21.954 2,6,10-三甲基十二烷 - 0.78
22.614 十四烷 - 2.52
25.467 十五烷 - 2.88
27.848 十六烷 0.15 2.94
28.725 氯代十八烷 0.51 -
29.575 2,6,10,15-四甲基十七烷 1.17 2.94
29.586 十七烷 1.14 -
30.571 4-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯 - 8.73
32.406 二十七烷 1.32 2.58
35.031 3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷 0.78 1.71
36.281 二十一烷 3.45 -
40.974 反式角鲨烯 0.90 -
42.116 二十八烷 5.34 -
酯类
5.364 乙酸(6-庚烯-1-基)酯 1.02 -
6.311 醋酸正丁酯 1.68 1.98
31.843 丁基邻苯二甲酸十四酯 2.04 -
32.601 十六酸甲酯 0.96 -
32.963 邻苯二甲酸二丁酯 5.10 3.21
32.979 邻苯二甲酸-丁基-8-甲基壬酯 - 4.89
38.198 邻苯二甲酸二异辛酯 4.74 7.17
苯类
5.045 甲苯 - 8.25
7.443 乙苯 2.64 4.65
7.654 间二甲苯 5.25 -
8.255 对二甲苯 1.65 2.58
10.122 1-乙基-3-甲基苯 0.30 -
10.225 1-乙基-2-甲基苯 0.18 -
11.020 1,2,3-三甲苯 0.15 0.24
12.276 邻甲基苯乙烯 - 0.12
20.308 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚 3.66 5.97
24.898 2,4,6-三甲氧基甲苯 0.81 -
25.678 2,4-二叔丁基苯酚 1.83 5.58
醇类
7.020 3-己烯-1-醇 - 3.63
13.851 α-(1-庚烯基)-α-甲基苯甲醇 - 0.12
25.862 3,7,11-三甲基十二醇 0.21 -
31.523 叶绿醇 2.40 1.74
31.318 2-十八烷氧基乙醇 0.18 -
35.491 (Z)-2-(9-十八碳烯基氧基)乙醇 0.42 -
40.974
2,2,4-三甲-3-(3,8,12,16-四甲
基-十八 烷 基-3,7,11,15-四 烯
基)-环己醇
0.90 -
续表1
种类
保留时
间/min
化合物名称
相对含量/%
SDE SFE-CO2
醛类
5.673 辛醛 - 0.60
6.409 糠醛 - 0.96
12.590 苯乙醛 - 0.24
14.371 壬醛 - 0.15
22.880 十二醛 - 0.96
23.681 4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛 3.48 2.73
酮类
8.114 2-甲基环戊酮 - 1.50
29.142 2-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮 1.44 1.62
30.419
3,5,6,7,8,8α-六氢-4,8α-二甲基-6-
(1-羟甲基乙烯基)-(1 H)-萘-2-酮
0.87 -
杂环 27.058
4α-乙酰氧基-5,5,8α-三甲基-八
氢苯并[b]吡喃
0.36 -
酸类 32.709
6-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氢-1,
1-二甲基-1H-茚-4-乙酸
0.51 -
醚类 27.036 4-羟基-3-叔丁基-苯甲醚 0.36 -
表2 SFE-CO2和SDE挥发油中不同成分的数目和含量对比
Table 2 Comparison between the number and content of
SFE-CO2and SDE volatile oils
成分
SFE-CO2
数目/种 含量/%
SDE
数目/种 含量/%
醇类 3 5.49 5 4.11
醛类 6 5.64 1 3.48
烃类 12 33.51 11 31.02
苯类 7 27.39 9 16.47
酮类 2 3.12 2 2.31
酯类 4 17.25 6 15.54
酸类 0 - 1 0.51
醚类 0 - 1 0.36
杂环 0 - 1 0.36
表3 两类挥发油主要成分比较
Table 3 The comparison of themain components in
two types of volatile oils
挥发油种类 特征成分及含量
SDE
甲基环己烷(15.96%)、二十八烷(5.34%)、二十一烷
(3.45%)、间二甲苯(5.25%)、邻苯二甲酸二丁酯
(5.10%)、邻苯二甲酸二异辛酯(4.74%)、4-乙烯基-2-
甲氧基苯酚(3.66%)、4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛
(3.48%)
SFE-CO2
4-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯(8.73%)、1-乙氧基戊
烷 (6.36%)、甲 苯 (8.25%)、2,4-二 叔 丁 基 苯 酚
(5.58%)、4-乙 烯 基-2-甲 氧 基 苯 酚 (5.97%)、乙 苯
(4.65%)、邻苯二甲酸二异辛酯(7.17%)、邻苯二甲酸-
丁基-8-甲 基 壬 酯 (4.89%)、邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯
(3.21%)、3-己烯-1-醇(3.63%)
32
第32卷第8期 卫 强等:葱兰叶挥发油成分分析及其对鲜牛奶的抑菌作用
以脂肪酸(22.05%)、萜类及其含氧衍生物(13.53%)、烷烃
(13.19%)和醛(6.93%)为主,主要成分有棕榈酸(12.12%)、
亚油酸(9.67%)、二十三烷(7.57%)、庚醛(5.90%)、4-乙烯
基-2-甲氧基苯酚(5.36%)、2,6-二叔丁基对甲酚(5.33%)等。
花、叶挥发油共有成分有十五烷、十六烷、十七烷、二十一烷、
4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、糠醛、苯乙醛。
葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共同成分有16种,分别
为:2,6,10-三甲基十四烷、十六烷、2,6,10,15-四甲基十七烷、
二十七烷、3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷、醋酸正丁酯、邻苯
二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯、乙苯、对二甲苯、1,2,3-
三甲苯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、叶绿醇、
4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛、2-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮。
相同成分中绝大多数成分以SFE-CO2挥发油中含量较高,葱
兰叶SDE仅有邻苯二甲酸二丁酯(5.10%)、叶绿醇(2.40%)、
4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛(3.48%)含量偏高。
2.2 对牛奶的抑菌作用
由表4可知,葱兰叶SFE-CO2挥发油对粘质沙雷氏菌、
金黄色葡萄球菌、腐败假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、
产气荚膜杆菌、粪产碱杆菌、保加利亚乳杆菌有较强抑制力,
其 MIC值范围为0.031~0.062mg/mL,而葱兰叶SDE挥发
油相对抑制力较弱,其 MIC值范围为0.062~2.000mg/mL。
由表5可知,与空白组对照,在4℃冰箱中放置0~10d,随着
葱兰叶SDE和SFE-CO2挥发油添加浓度的提高,对鲜牛奶有
明显抑菌作用,而SFE-CO2挥发油组抑菌作用强于SDE挥发
油组。溶菌酶对G+菌抑制作用较强,但对G-菌,包括一些主
要的食源性病原体无效,在食品应用上受到一定限制[19]。
表4 葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油抗菌试验的 MIC值
Table 4 Antimicrobial MIC of SDE and SFE-CO2essential
oils from Zephyranthes candida(Lindl.)Herb.
(n=3) mg/mL
菌种 SDE挥发油 SFE-CO2挥发油 溶菌酶
粘质沙雷氏菌 1.000 0.031 0.062
金黄色葡萄球菌 0.125 0.062 0.031
腐败假单胞菌 2.000 0.031 1.000
枯草芽孢杆菌 0.125 0.062 0.125
大肠杆菌 0.500 0.062 0.062
产气荚膜杆菌 0.062 0.062 0.062
粪产碱杆菌 0.125 0.062 0.031
保加利亚乳杆菌 0.125 0.062 1.000
表5 葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油处理前后对鲜牛奶中微生物中菌落数的影响
Table 5 Affect on the total count of microorganisms before and after milk processing with SDE and SFE-CO2essential oils
fromZephyranthes candida(Lindl.)Herb. CFU/mL
样品 浓度/%
放置天数/d
0 2 4 6 8 10
空白组 202 7.4×103 5.3×105 4.7×107 6.2×109 7.7×1011
对照组 0.04 206 2.6×103 2.6×104 5.5×105 3.7×106 4.8×107
SDE挥发
油组
0.02 187 5.2×103 6.2×104 8.9×105 7.8×106 7.5×107
0.04 179 3.1×103 4.1×104 6.0×105 5.2×106 6.2×107
0.06 192 1.5×103 2.0×104 4.4×105 3.4×106 4.6×107
SFE-CO2挥
发油组
0.02 182 4.1×103 5.9×104 6.9×105 5.6×106 6.2×107
0.04 191 2.0×103 3.0×104 5.0×105 4.0×106 4.4×107
0.06 178 1.2×103 1.5×104 2.7×105 2.1×106 2.0×107
放置4℃冰箱中。
3 结论
从葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共鉴定出55种化学
成分,其中不同成分39种,分别占41.67%,44.40%;相同成
分16种,分别占32.49%,48.00%。其不同成分类别差异明
显,其中SFE-CO2挥发油不含醚类、酸类和杂环成分;相同成
分含量差异较大,多数以SFE-CO2挥发油含量较高。说明成
分差异决定挥发油品质,对其香型也产生决定性影响,SFE-
CO2挥发油香气浓郁的结果与其成分组成密切相关。另外,
葱兰叶挥发油成分对鲜牛奶的抑菌作用结果显示,SFE-CO2
挥发油对引发牛奶变质的粘质沙雷氏菌等有较强抑制力,其
MIC值范围为0.031~0.125mg/mL。研究[20-21]表明,多种
酚类成分是抗菌的有效成分。酚羟基是起抗菌作用的主要
官能团,邻位甲氧基能提高抗菌活性,抗菌活性可能还与电
性、疏水性和空间结构有关。SFE-CO2挥发油显示较强的抗
菌活性,可能与其含有较高的苯类成分有关(27.39%)。本
试验从挥发油成分与香气和对鲜牛奶的抑菌作用的关系两
个方面说明SFE-CO2萃取具有更好的技术优势。
参考文献
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(下转第90页)
42
基础研究 2016年第8期
程并不足以使核桃壳裂纹扩展到整个核桃,仅仅是接触部分
的破壳,故破壳效果不理想。
当挤压行程为6mm,4个挤压块从4个点同时向内挤
压核桃壳时,核桃壳在接触部分开始产生裂纹,且6mm的
挤压行程足以使核桃壳的形变扩及整个核桃壳,从而使核桃
破壳完全,故核桃壳破碎率高。
当挤压行程为8mm时,核桃壳在接触部分开始产生裂
纹,且伴随着极高的破壳率,核桃的高路仁率也在降低。因
为核桃壳在完全破碎后,挤压块还在进一步挤压核桃,以至
于将完整的核桃仁挤碎,从而降低了高路仁率。
为了提高破壳率和高路仁率,以陕西本地核桃为例,在
四点挤压式核桃破壳机中,最优的挤压行程为6mm,此时,
核桃壳完全破碎,破壳率为100%,高路仁率为96.8%。
3 结论
本试验研制的“四点挤压”式核桃破壳机适用于不同尺
寸大小的核桃,且破壳效果明显优于“两点受力”破壳的机
械。“四点挤压“式破壳机的破壳率为100%,高路仁率为
96.8%。四点受力破壳为提高核桃破壳率、整仁率提供了一
定的思路。
在前期的偏心式核桃破壳机的参数优化试验中,不同的
挤压行程对核桃破壳有一定影响[11],本试验中不同尺寸大
小的核桃在破壳时,挤压行程为4mm 时,破壳率都不好。
当挤压行程为6mm 时,所有尺寸核桃的破壳效果明显提
高,也进一步说明破壳效果和挤压行程有大关系,但和核桃
本身大小尺寸关系并不明显。
本次试验只采用了一个品种的核桃,将来还应进一步用
多个品种核桃进行破壳试验,以检验核桃破壳效率。在核桃
破壳试验的过程中,力的加载位置对破壳效果有一定的影
响,将来在改进“四点挤压”式核桃机时,应该加上核桃的定
向装置。
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包装与机械 2016年第8期