免费文献传递   相关文献

赤小豆胰蛋白酶抑制剂抑制人体精子顶体蛋白酶的动力学



全 文 :福建师范大学学报 (自然科学版 )
JU O R N人 LO F FU JI A O N N R卜I A U L NI E V RS 】Y T
( NA T L】 RA S C LI E NE C)
1 0 ( 2) :5 2一 5 5
19 9 4
赤小豆胰蛋白酶抑制剂抑制人体
精子顶体蛋白酶的动力学 ’
杨同成 刘艳吸。
(高分子研究所 )
摘 要 通过一 系列晦促反应动 力学的研 究 , 结果表明赤小豆胰蛋白晦抑制剂叶人
体精子顶 体蛋 白酶 ( A er os in) 有较强 的不可逆竟争性抑制作用 . 其 K 。 和 K .值分别为 1 . 86
义 1 0一 3m o l / L 和 2 . 1又 10 一“ m o l / L .
类键词 赤 小豆 , 胰蛋白酶 , 顶体蛋 白晦 , 动力学 , 抑制作用
本文作者曾从中药赤小豆 ( hP a , 坛。 ca l ca 、 俪 Rxo b) 中分离出一种蛋白酶抑制剂 , 该
抑制剂对胰蛋 白酶有较强 的专一性不可逆竞争性抑制作 用 l[J . 只要该抑制剂的剂量在
2
.
Om g / m l 以上 , 在体外就能全部抑制人体精子 zjL . 为了进一步探讨赤小豆胰蛋白酶抑制
剂对人体精子的抑制作用机制 , 本文作者从酶动力学角度 , 研究了赤小豆胰蛋白酶抑制
齐」对受精有重要作用的人体精子顶体蛋白酶的影响 .
1 实验方法与结果
L l 实验材料
赤小豆胰蛋白酶抑制剂 (尸ha se o l哪 e a zca , a to s t r y 详 in i n h i b it o r ) 由本文作者从新鲜赤小
豆提取 二’ 〕 , 经聚丙烯酞胺凝胶电泳纯度鉴定 , 为电泳单点纯样品 . 它仅专一地抑制胰蛋白
酶 对酪蛋 白 、 N一苯 甲酞 一 D L 一精氨酸一对硝基苯胺 ( BA P N A ) 和苯甲酞精氨酸 乙醋
( B A E E ) 等底物的水解 , 其摩尔抑制 比分别为 1 : 3 . 9 0 、 1 : 3 . 25 和 1 : 3 . 3 . 人体精子顶
体蛋白酶 ( A cr os i n ) 是对受精过程有重要作用的一种蛋白水解酶比 3」, 由本文作者从正常
青年人新鲜精液提取 , 经聚丙烯酞胺凝胶电泳和 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶 电泳纯度鉴定 , 为
电泳单点纯样品 ( M w 为 1 04 70 ) , 赤小豆胰豆 白酶抑制剂对人体精子顶体蛋白酶水解
B A E E
、 酪蛋白和 B A P N A 等底物的抑制作用 , 其摩尔抑制比分别为 l : 1 . 56 、 1 , 1 . 49 和
1 , l
·
39
·
B A P N A 和 B A E E 均 为中科院上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 . 其它
试剂均为国产分析纯试剂 .
1
.
2 人体精子顶体蛋白酶活力的测定
将底物 B A E E 用 0 . 0 5 m o l / L p H S . 0 的 T r i s 一 H C I 缓冲液 (内含 0 . o lm o 一/ L aC C 12 ) 配成
. 本文于 19 9 3年 7月 2 日收到 .
第 2 期 杨同成等 : 赤小豆胰蛋白酶抑制剂抑制人体精子顶体蛋白酶的动力学
0
.
8 义 10一 3ml o / L的溶液 .分别往两个石英比色池中各加入 2 . sl m经 2 5℃预热的 B A E E
溶液 , 然后往一个 比色池中加入 0 . Zml rT is 一 H o 缓冲液 , 混匀作为空白对照 ; 另一个比色
池中加入 0 . Zml 人体精子顶体蛋白酶 ( l以g) , 立即混匀 , 在 2 5 3n m 下测定不同时间内光
密度的变化 , 结果见图 1 .
1
.
3 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子顶体蛋 白酶抑制作用的类型
月,6jq妇.0.0.0,峭的NO
取一定量的人体精子顶体蛋白酶溶液 , 分别加入一
定量抑制剂和不含抑制剂的等量底物 (B A P N A ) 溶液 , 于
波长 刁】on m 下测定不同酶量时的光密度变化 , 结果见图
2
. 由图 2 可知 , 未加抑制剂时可得一条通过原点的直线
a , 加入抑制剂后则得一条不通过原点 , 向右移动并与直线
a 平行的直线 b . 这说明抑制剂使一定量的酶失活 , 剩余
酶的摩尔数超过抑制剂的摩尔数 , 才表现出有活力 . 其
反应的初速度随酶量的增加程度与无抑制剂时一样 , 故
以酶量对光密度作图得一条向右移动且与直线 a 平行的
直线 b [’, s〕 . 这表明赤小豆胰蛋 白酶抑制剂对人体精子顶
体蛋白酶呈不可逆的抑制作用 .
时 l白 1( m一 n )
图 l 人体精子 顶休蛋 白酶
活 力的测定
1
.
4 赤小豆胰蛋白酶抑 制剂抑制人体
精子顶体蛋白酶的动力学观察
通过 Li n e w e a v e r一 B u r k 曲线 , 即光密度
与底物浓度双倒数关 系图 ( l / A 刁1 0n m一 l/’
[
s
] ) 可见 , 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精
子顶体蛋白酶的抑制作用是竞争性 的 (见图
3 )
. 万。 值为 1 . 8 6 义 1 0 一 3m o l / L . 由 D ix o n 作
图即光密度倒数与抑制剂浓度关系作图
( l / ^ 刁10 n m一 〔 l ] ) 测 得 ` . 值 为 2 . 1 又
10 一 “ m of / L
. ` 。值大过 K .值 , 结果表明抑制剂
与精子顶体蛋白酶的亲和力比底物和精子顶
体蛋白酶的亲合力大 (见图 4 ) . 说 明赤小豆
翌à一.V
0
.
1 0
.
2 0
.
3 0
.
4 0
.
5
油 ( 、 g )
图 2 赤小 豆胰蛋 白晦抑制荆对人体精子
顶体蛋 白酶抑制作用的 类型
a
. 未加抑 制荆 b . 加抑制荆胰蛋白酶抑制剂对人体精子顶体蛋白酶有较强的抑制作用 . 另从图 2 中又得到证实 , 赤
小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子顶体蛋白酶和对胰蛋 白酶 同样都具有不 可逆抑制 作
用二’」. 因此 , 人体精子顶体蛋白酶具有类胰蛋白酶的特性 , 抑制剂与底物可能有某些相似 ,
可以与顶体蛋白酶活性 中心的底物结合基团共价结合 , 属于底物型的不可逆抑制剂川 , 亦
即邹承鲁教授所提出的竞争性的不可逆抑制川 .
2 讨论
实验结果表明 . 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子顶体蛋白酶有较强的不可逆竞争
性抑制作用 . 由于这种抑制作用的存在 , 就有可能通过抑制剂和精子顶体蛋白酶活性中
福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 19 9 4年 6月
心的共价结合 , 使精子顶体蛋白酶的活性不可逆地丧失 , 进而影响整个精子的活动能力 .
M ior w ak :ia 」等人认为顶体蛋白酶除了能使卵细胞的透明带水解出一条通道 , 以便让精子
穿过透明带与卵细胞融合外 , 还能在顶体蛋白酶作用下 , 在雌性生殖道 内释放激肤 , 从
而增强精子的活动性并促进精子的移动 . 赤小豆胰蛋白酶抑制剂在体内对人体精子顶体
蛋酶是否有抑制作用 , 以阻止精子的受精 , 达到避孕 目的 , 正待进一步研究 .
;::{ /
2 0 1 /才 产产户
一 0 . 5 0 . 5 ! . 0 1 . 5
1 2 下B A P 、 A 一 ( m m o l z L )

1 0 [ 0 2 0 3 0
抑 制角l ( * m o 一z L )
图 3 光密度与底物浓度双倒数关系图
l。 无 抑 制 荆 , 1 , 加 2 0协s / m 一抑 制 荆 , I : 加
4 0 0 9 /m l 抑 制齐!
图 4 光密度倒数与抑制 剂浓度 关系图
I
:
2 0协 m o l / L B A PN A
I
:
10协 m o l / L B A PN A
l
:
6
.
6协 m o l / L B A P N A
参考文献
「l ] 杨同成 · 赤小豆抑制剂对胰蛋白酶不可逆抑制作用的动力学探讨 . 生物化学杂志 , 1” l , 7( 2) : 2 1 ~
2 2 4
【2〕 杨同成 , 李田土 , 胡余男 . 赤小豆胰蛋白酶抑制剂对人体精子体外抑制作用及其作用机理的初步探
讨 · 福建师范大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 9 8 9 , 5 ( 3 ) : 7 6 ~ 7 9
[ 3」杨同成 , 胡余男 , 李田土 . 人体精子顶体蛋白酶的研究 , 福建师范大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 9 1 , 7 ( 2 ) :
5 6 ~ 5 9
「月 许根俊 · 酶的作用机理 . 北京 :科学 出版社 , 198 3 , 45 一 46
[ 5」陈惠黎 ,李文杰 · 分子酶学 . 北京 : 人民卫生出版社 , 1 98 3 , 23 2 ~ 23 3
[ 6」梁之彦 . 生理化学 . 上海 : 上海科学技术出版社 , 1 98 5 , 23 8 ~ 24 。
[ 7〕邹承鲁 . 酶活性不可逆改变的动力学 1. 底物影响酶与抑制剂结合速度的动力学方程 . 生物化学与生物
物理学报 , 1 9 6 5 , 5 (月) : 3 9 5 ~ 月0 6
[ 8〕M o r iw a k i c , L u n d g山 s t F . s t u id es o n ht e b ioc h e m ist r y o f hunr a n a e ros j n . A d y . E x p . M ed . B i o l . , 19 7 8 , 1 2 0 :
3 5 1 ~ 3 5 9
第2 期 杨同成等 : 赤小豆胰蛋白酶抑制剂抑制人体精子顶体蛋白酶的动力学 5 5
K in et i e s of Inh ib it or yf f E e et s ofP l : a se ol u s
e al e ar at u s Inh ib it orn o A er o s in of Hu m anB d e y
Y an gT n o g eh en gL iu Yn a r u
( b以故J 份 可 只又尹子眨甲 5七企爪犯 )
Ab st r a et n Ith isP ap er
,
t h e r es
u l st P r e lim i n a r y i n d i ca t
e
d t h a t P h a se
o
l
“ 5 e a l e a r a t砚 5 R o x b h a s
只 tr o n g e r e f f e e t o f i r r e v e r s i b le
, e o m ep t j v e i n h ib i t io n o n a e r os in o f h u m a n b o d y b y a se r i es o f k i n e t
-
, e s t u d y o n e n z y m e

ca at ly ez d r
e a e t i o n s
.
T h e ` . a n d 万 . a r e 1 . 8 6义 1 0一 3m m o l / L a n d Z. l 义 1 0一 ” m
m o l / L
r e s
pe
e t iv e l y
.
K e y w o r d s P如 s eo l赵 5 e a l e a r a t u s , t r y P s i n , a e r沉 i n , k i n e t i cs , in h i b it o r y e f f ec st