全 文 ：生物物理学报 第 n卷 第 1期
A Cf AB IOP H、 SI CA SL、 I CAV 1 1 OI .
1竺翅巧年 3 月
N O
.
I M公 .1望巧
: 一 苦瓜子蛋白和 刀一 苦瓜子蛋白紫外光谱的研究
陈世芝 徐 薇 王耀萍
(中国科学院生物物理研究所 北京
董贻诚
l) ( X10 1)
摘 要
对 , 一
~
及刀一 r n r n c进行了溶剂微扰差光谱的研究及在不 同温度条件下的 光谱滴定 , 结合
最新得到的 仪 一
~
的晶体结构进行了分析和讨论 , 并与天花粉蛋白的紫外光谱进行了比较 。
关键词 : 仪苦瓜子蛋白 刀苦瓜子蛋白 紫外光谱
以一 苦瓜子蛋白 (以下简写为 良一~
c )和 口一 苦瓜子蛋 白 (以下简写为 刀一
~
)均 由苦
瓜 (葫芦科 ) 种子 中提取 出来 的类似于天花粉蛋 白 (以下简写为 T CS ) 的蛋 白质 。 早 在古
代 , 天花粉就用于引产 。 70 年代后期我国科学家对它们进行 了科学研究 , 除了将 它用于引
产外 1j[ , 还用于抗早孕及治疗与滋养层细胞相关的肿瘤病 2[] 。 近来还发现天花粉蛋白在体外有
抑制 H l v 复制的功能 34[] 。 : 一
~
分子量 29 kD
,
p IS .9
, 含 1 . 6% 的糖 ; 氨基 酸残基 序列 已测
出 。 序列 比较显示它和天花粉蛋 白 同源 , 也是 单链 核 糖体 失 活蛋 白 ( R IP ) , 具 有 R N A
N 一 糖昔酶活性阎 。 刀一
~
分子量 2 8k D , lP 9 . 1 , 含 1 . 3% 的糖 , 氨基酸残基序列正在测定
之中 , 但从其组成和性 质推测 , 它与 : 一 IT l 刀 c
很相似 。 : 一
~
的晶体结构 已经解 出 !司, 它很
类 似于天 花粉蛋 白的晶体结构 。 图 1 给 出 了
: 一 I Tl l l c 的 OZ n m 分辨率 晶体结 构带状 图 。 图
中标 出了 12 个酪氨酸残基 (以 下 简写 为 T y )r
所处 的位置 。
本 文 希 望 通 过 紫外 光 谱的 研 究 : 了 解
: 一
~
和 刀一
~
在溶液 中的构象稳定的 p H
范 围 ; 结合晶体结构 , 对 : 一 m l劝c 和 刀一 n l n c
中酪氨酸残基在维持构象稳定中的作用进行探
讨 ; 对由 p H 改变所引起的分子构象变化过程
提出设想 。
1 实
瑰 J A iR bbo n d I’a iw ng of : 一 n l l l l c mo 政ul e .
验
L l 材料
: 一 1l l l l c 和 刀一
~
由本实验 室提 取 , 电泳 鉴定 为单 一 组分 ; 模 型化 合物 N 一 乙 酞
一 L 一 色 氨酸 乙 醋和 N 一 乙酞 一 L 一 酪氨酸酞胺 , 聚乙 二醇 20 田E G Zo o) , 聚乙 二醇 40
田E G 40 0) 为 iS g am 产 品 ; 二 甲亚矾 (D M S O ) 为 J
.
T
.
B a ke r
.
C o 光 谱学专用 试剂 ; 重水
(D O少为北京化工厂生产的优级纯 (9 9 . 8% )试剂 ; 其余各试剂均 为国产分析纯试剂 ; 全部实
第 1期 沉一 苦瓜子蛋白和口一 苦瓜子蛋白紫外光谱的研究
验均用二次重蒸水 ;全部光谱滴定所用溶液都除去了 CO :。
Z L光谱测量
所有 的光谱测量均在 P e r k in一 E ln止 r公 司的 加 m bd a17 U/ V V IS分 光 光 度计 上 进 行 , 用
10
~
互相匹配的石英杯 , p H 校正用三种标准缓冲液 : 邻苯二甲酸氢钾 , 硼砂及饱 和氢氧
化钙 。
1
.
2
.
1 : 一
~
和 刀一 n 卫刀 c 的摩尔消光系数测量 : 在北京大学生物系 B a ck ma n 12 l M B 型
氨基酸 自动分析仪上 由袁洪生同志协助测得氨基酸组成 , 计算出 :
: 一
~
的摩尔消光系数 几= .2 38 X l少cnI 一 ’ mo l一 ’ L
刀一
~
的摩尔消光系数 今一 .2 54 x 10俪 一 ’ mo l 一 ’ L
1
.
.2 2 溶剂微扰差光谱 : 蛋白浓度 l ngr 阿 , 在三种不 同的 p H 条件下对各种 不同的微
扰剂进行光谱测量 。 以等摩尔模型化合物为 10 % 暴露计算各条件的暴露分数 。
1
.
2 3 酪氨酸光谱滴定 : 每种天然蛋白分别于二种温 度下进 行了光谱滴定 ; : 一 n l n l c 为
25
O
C 和 4 0 O C ; 刀一
~
于 25 O C 和 35 O C 。 所 用 的 蛋 白浓 度 均 为 o . smo l压
、 溶 于 含
0
,
15mo l瓜 K a 的 T ir 一 H C I 缓冲液 ( p H 7
.
5)
, 参考池 中注人相同 的缓 冲液 , 样 品池 中用 微
量注射器注人浓 K O H , 搅匀后记录 2 92 nm 处光谱读数
, 整个 过程 由加碱量 所引起 的浓度变
化小于 2% 。 每种蛋 白在 25 OC 于 s mo l瓜脉变性条件进行滴定 , 以确定天然蛋白滴定终点
。
2 结果和讨论
.2 1 溶剂微扰差光谱
溶剂微扰差光谱得到 : 一
~
和 刀一
~
在三种 p H 条件下 T yr 的暴露分数 , 见表 1 和
表 2 。 由表可见两种蛋 白的 T yr 在不同 p H 暴露分数约为 40 % 一 50 % 。
aT ble 丁h e fr a c tio n e x p os de ty or s ine 心 id ues
fo r 义一 n l l l l C
.
T h翻睦 2 们 l e if习 e tio n ex po s de t yr o s ine esr id ues
fo r 刀一 m 刀 I c .
P H Z万 P H 7 . 0 P H S石
以〕。 35% 35 % 69 %
D M SO 38% 49 % 51%
ct h y】e ll e gl )切1 46 % 48 % 48 %
P EG Z你 ) 4 % 37 % 40 %
P EG 粼洲) 52% 48 % 37%
PH Z
·
5 P H 7
.
0 P H 8
.
6
E咬) , 4 2 % 48 % 48 %
D M SO 48 % 50 % 49 %
e th y】e n e g】y“ 〕1 45 % 54 % 48 。毛
P EG Z侧) 4 2 % 52 % 45 %
P EG喇X ) 49 % 38 % 49 %
该结果与天花粉蛋白相应的结果类似网 。 氨基酸残基序列测定结果表 明 : 一 n ln l c 含 13 个
T yr
, 然而晶体结构测定表 明第 5 位残基并不显示 T yr 密度 , 而是极佳的精氨基酸残基密
度 . 因此 我 们认 为 : 一
nmcr
含 有 12 个 T y r : T y r 14 , T y r 3 2 , T y r 4 7 , T y r 7O, T y r 74 , T y r s l ,
yT
r 94
,
T y r l 0 7
,
T y r l 1 1
,
T y r l 4 2
,
T y r l 6 6
,
T y r l 7 6
。
T y r l 6 6
、
T y r l 7 6 为 仪一
cmnr
特 有 ;
T yr 5
,
T yr 141
、
T yr 164 为天花粉特有 。 刀一
~
序列测定尚未完成 , 由其组成测得含 12 个
T y r
。
由晶体结构的结果 对这 12 个 T yr 的可及表面计算 (按苯环的暴露表面积分类 ) 得 出 :
生 物 物 理 学 报 1卯5 年
其中五个完全内埋 ;两个 完全暴露 ;5个半暴露 , 见表 3 ; 可见溶剂微扰差光谱的结果与晶
体结构所得结果是一致的 。
T油廿晚 3 11r a “ ℃骆 ible s ur af 戊 a 代么 a dn het P h丫芝 lo il c h川or 娜
卿 14 ytr 32 娜47 ytr 70 ytr 74 ytr sl tyt 94
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.
ytr l 07 ytr l l l 坷 142 ytr l肠 ytr l 76
苯环可及
表面
酚经基可
及表面
50 6 0
.
69 65
.
5 0 0 D 5 29名3 2 . 28 18 29 4 3. 13 39 . 1 87 . 87
g D 1 0乡 30 . 29 0名 1 11.肠 30 . 5 144 4 . 34 20 . 86
形成氢键 … eS ir 57 … A k 12022O
状态 O
… eS ir 4
O
… E l印
O E
.
… Ser 182
O G
: 一
~
在 p H .S 6时以 D户 为微扰剂暴露分数略有增加 , 而天花粉蛋 白没有这一现象 ,
可能的解释如下 : 在天花粉蛋 白分子 中有 yT r 141 (在 叼 其酚经基 与 lG u5 8 的 O EI (在 几)
形成氢键 , 加强 了分子中部的 : 一 螺旋构成 的芯子与大 刀片层间的作用 , 而 : 一
~
分 子中
没有 T yr l4 1 , 因而没有这种氢键 , 当 p H 升高到 .8 6 时其三维结构可能有少许松 动 , 即大 刀
片层略徽张开使处于边沿的 T y 8r 1 , yT r l4 2 能接触较多 的 D户 分子 , 造成 T yr 暴露分 数有所
增加 。 另外 , T yr 16 处于 口, , 几。的内侧苯环部分为半暴露 , 这个小 刀片层在 p H 高达 .8 6 时
也可能会略微张开使半暴露的苯环暴露更多些 , 而天花粉蛋白没有 这个 酪 氨酸 , 因而 反 应
不出这种变化 。
.2 2 酪氨酸光谱滴定 :
由各 p H 在 29 2 n j n 处的光谱数据可算出相应的摩尔消光系数 , 并作出光谱滴定曲线 。 相
应的滴定 曲线表示在 图 2 , 图 3中 。
以上各图可见它们大致相似 , 略有不同 。 相似的是滴定 曲线都分成三个步骤 : 第一步在
p H n 或 p H n . 5左右以下 , 这一步为可逆反应 ; 第二步发生在 p H H 或 p H l . 5至 p H 12 左右
较小 的 p H范围内 , 曲线在这一步急剧上升 ; 最后 , 在 p H 12 以上 为滴定 的第三步 。 第 一
步相 当于约 5个酪氨酸被滴定 ; 第二步相 当于约 4 个酪氨酸被滴定 ; 第三步相 当于约 3 个酪
氨酸被滴定 。
: 一 In n cl 的三维结构与 T CS 相似 , 其二级结构排布颇为独特 : : 一 螺旋相对地集中于分
子中部 , 刀折叠构成的 刀片层绕在分子的外围 。 造成分子可分成不同的层次 , 处于不 同层次
的酪氨酸被滴定的先后顺序 当然也不同 。 显然 , 酪氨酸残基根据它们在分子中所处的位置由
表及里分成三类 , 形成滴定曲线 由低 p H 到高 p H 的三步 。
现在可以设想 : 一 1刀 I n c 分子 中 12 个酪氨酸是这样被滴定 的 : 首先 , 在 曲线的第一步 ,
位于分子表面的大约 5 个酪氨酸 (指酚轻基外暴的酪氨酸 , 除完全暴露 的 T y r 70 , yT r 1 76 和
T y 9r 4 外 , 及几个部分暴露的酚经基 中之 2 一 3 个 ) 被 滴定 , 这 时分子 的三 维结构没有被破
坏 , 滴定是可逆的 ; 继续提高 p H , 分子的三维结构受到部分破坏 , 刀片层打开 , 使处于 方片
层与 : 螺旋构成的 “ 芯子 ” 间的 4 个酪氨酸暴露 (如 T y r 4 7 , T y r l 0 7 , T y r 74 , yT r s l 等 ) , 从
而被滴定 , 形成 了滴定曲线的第二步 。 据天花粉蛋 白园二色性研究结果揭示 :s[] 在这个条件
下分子的二级结构仍 然保 持 , 因而可 以说是 “刀片层 打开 ” 。 当 p H 再升高 , “ 螺 旋构成的
第 1期 “ 一 苦瓜子蛋白和 刀一 苦瓜子蛋白紫外光谱的研究
“芯子 ” 破坏之后 , 处于它们之间的大约三个酪氨酸 (如 : T y r l 4 , T y r l l , T y r 16 等 ) 才被
滴定 , 这是滴定曲线的第三步 。
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这些滴定曲线的差异反 映在各步 出现 的 p H 值和相应 的酪氨酸个数上 。 从图上可看 出
, 一
~
40
O
C 滴定曲线 , 及 刀一
~
35
O
C 滴定曲线较相应的 25 O C 滴 定曲线各阶段发生
在稍低一些的 p H 值 , 这一差异可从温度高分子热振动大 , 分子稳定性相对小一些来理解 。
: 一 1111l l c 2 5 “ C 滴定曲线第三步较 40 “ C 滴定 曲线第三步要 陡 。 25 O C 时第二步及第三步被
滴定的酪氨酸个数与 4 0 OC 相应的各步被滴定的酪氨酸也有可察觉的差异 。 这可能是由于分
布在各部位的酪氨酸被滴定 的先后顺序并不唯一取决 于它 所处的位 置 , 显然 还 与酚经 基
( 一 O H ) 与其它基 团是否形成氢键有关 , 只有 当氢键破坏之后 一 O H 释 放出来 的那些酪氨酸
才能被滴定 。 从三维结构信息得知 : 处于分子表面 的 T y r 32 的 一 O H 与 lA a2 02 的氧形成氢
键 ; 处于 刀 片层与 : 一 螺旋构成 的 “ 芯子 ” 之间和 yT ir 07 , 其 一 O H 与 S er l科 的 O 形成氢
键 。 它们可能不一定会在第一步或第二步被滴定 , 而可能在第二步或第三步被滴定 。
将这些滴定曲线和天花粉蛋白相应的二种温度的滴定 曲线比较发现 :
: 一 1刀 r n c 4 0 “ C 的滴定 曲线与天花粉蛋白的 40 O C 的滴定曲线类似 ; 而 25 O C 它们的滴
定曲线有所不同 。 推测可能原因是 : : 一
~
分子 中处于 “ 一 螺旋 之间有 T y r 1 6 (处于 : 6 ) ,
它的 一 O H 与 S er l8 2O G (处于 叼 形成氢键 , 而天花粉蛋 白在这个位置是 P he , 无法形成这
种氢键 。 在高温 ( 40 “ )C 时 , : 一
~
这种氢键可能很弱 , 因而滴定曲线类似于无此氢键的
天花粉蛋白 。 由此可推测在常温 : 一 n 卫n c 可能有 比天花粉更稳定 的 : 螺旋 “ 芯子 ” , 这种差
异对活性有何影响有待进一步研究 。
20生 物 物 理 学 报 19 5 年
刀一
~
的滴定曲线情况类似于 :一
~
, 它比 : 一
~
不稳定 。 由于 吞一
~
的序列和
结构还不清楚 , 难于作进一步的讨论 。
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本文于 19 4 年 8月 3 日收到