全 文 ：茉莉叶石蜡制片技术的改进
邓传远 1,郭素枝 2,3,刘伟军 1,潘东明 4,赖钟雄 4
(1、福建农林大学 园林学院,福建 福州 350002;2、福建农林大学 生命科学学院,福建 福州 350002;
3、福建农林大学测试中心,福建 福州 350002;4、福建农林大学 园艺学院,福建 福州 350002)
摘要:以茉莉叶片为材料,对石蜡常规制片的部分步骤在时间上作了改进,并对制成的片子在光学显微镜下观察、拍
照,以期寻找最佳观察结果和高效的制片方法。实验结果表明,以清洗 3次(15min/次)、脱水 4次(30min/次)、透明 2次
(30min/次)、浸蜡2次(120min/次)、脱蜡2次(30min/次)、番红染色50min的细胞结构完整,图像效果最佳,全程耗时 624
min,与常规石蜡制片的需要时间(2464min)比较,可节省 1840min。清洗时间不低于 15min/次,脱水时间不低于 30min/
次,对细胞结构和图像清晰度影响不大,但透明时间低于 30min/次、浸蜡时间低于 120min/次对细胞结构和图像清晰度有
一定影响,若透明时间高于30min/次、浸蜡时间高于120min/次则浪费时间,而且造成组织块变硬变脆,影响制片质量。
关键词:茉莉叶片;石蜡制片技术;改进
中图分类号:S685.160.36 文献标识码:A 文章编号:1673-4343(2008)02-0188-05
ImprovementsonParafinSectioningTechniqueforJasminumsambacLeaf
DENGChuan-yuan1,GUOSu-zhi2,3,LIUWei-jun1,PANDong-ming4,LAIZhong-xiong4
(1.ColegeofLandscapeArchitecture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;2.ColegeofLifeScience,
FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;3.ElectronicMicroscopeCenter,FujianAgricultureandForestry
University,Fuzhou350002,China;4.ColegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)
Abstract:ThestationtimeofpartprocessingscheduleonparafinsectioninginJasmimumsambacsleaveswasoptimized,the
slidesmadefromtheoptimizedprocessingschedulebasedonorthogonaldesignwereobservedandphotographedusinglight
microscopetoexploreperfectobservationresultsandleasttime-consumingmethodsinthispaper.Theresultshowedthatcelular
structurethatwascleanedthrice(oncefor15min),dehydratedfourtimes(oncefor30min),clearedtwice(oncefor30min),
infiltratedbyparafintwice(oncefor120min),deparafinizatedtwice(oncefor30min),andstainedbysafraninewasintactand
thebestinimageefect.Thefulprocessconsumed624min,whoseparafinsectioningperiodcan,comparedwithregularone
(2464min),save1840min.cleaningtimenotlessthan15minonceanddehydrationtimenotlessthan30minoncehavenoefect
oncelularstructureandimagedefinitionwhileclearingtimelessthan30minonceandparafininfiltratingtimelessthan120min
oncehaveacertainefectoncelularstructureandimagedefinition.clearingtimemorethan30minonceandclearingtimemore
than120minonceleadtowasteonstationtime,alsohardeningandcrispingtissuegroupandworsesectioningquality.
Keywords:leafofJasminumsambac;parafinsectioningtechnique;improvement.
随着科学技术的不断发展,应用电镜手段研
究细胞的超微结构也越来越多,但是,电镜观察的
视野有一定局限性,特别是透射电镜观察,由于样
品必须经过超薄切片,只能观察一个细胞内的细
胞器或几个细胞,如果研究完整的横切面,电镜就
无能为力了,必须依靠石蜡制片技术,在光学显微
镜下观察。石蜡制片技术既繁琐又费时,做一批样
品全程往往需要3-4天,而且各个步骤互相关联,
某个步骤的失误直接影响观察结果,如影响结构
的真实性,或影响图像美观,最终影响图像的分析
和解释,达不到研究的目的。前人对石蜡制片技术
的改良,主要集中在以动物为材料的研究上[1~3],有
关植物的研究极为少见,为此,本论文用茉莉叶片
为研究材料,主要在石蜡制片的时间或步骤设置
几种改进的方法,优选既省时,结果又好的制片方
法,为类似植物叶片的研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料
供试的材料采自福建农林大学实验地栽培的
收稿日期:2008-05-10
基金项目:福建省青年科技人才创新项目(2004J009);福建省博士后科研基金项目(010212)
作者简介:邓传远(1971-),男,福建永安人,副教授,博士。
2008年 6月
第25卷 第2期
三 明 学 院 学 报
JOURNALOFSANMINGUNIVERSITY
Jun.2008
Vol.25 No.2
DOI:10.14098/j.cn35-1288/z.2008.02.004
双瓣茉莉植株,选择生长正常,长势较一致,相同
朝向的一年生枝条,取相同叶位(从顶端往下数第
2叶位)的功能叶,带回实验室待用。
1.2方法
上述的叶片均用蒸馏水清洗3次,在叶片主
脉两侧中部,剪取 0.5cm×0.2cm小条立即投入
FAA固定液中固定 24h,清洗、脱水、透明、浸蜡、
脱蜡、染色等步骤在时间上作改进,包埋、切片、贴
片和干片等步骤按常规方法,不作改进。
1.2.1常规石蜡制片
石蜡制片方法参照许鸿川的方法[4]。清洗(用
70%酒精更换3次,每次间隔120min)、脱水(脱水
剂依次用 83%、95%、100%、100%,各级脱水时间
为 120min)、透明(2/3纯酒精+1/3二甲苯→1/3纯
酒精+2/3二甲苯→二甲苯 2次,每次透明
120min)、浸蜡(把透明好的研究材料移入盛有已
融化的石蜡的小杯中,放置 54～56℃恒温箱中 180
min后,更换一次已融化的纯石蜡,再经 180min
后即可包埋)、脱蜡(将已干的玻片标本插入盛有
二甲苯的染色缸中脱蜡 15min),经脱蜡的玻片
标本依次用下列溶液更换,1/2纯酒精+1/2二甲苯
4min→纯酒精4min→95%酒精 4min→85%酒精
4min→70%酒精 4min、染色(采用—固绿双重染
色,番红 12h→85%酒精 1min→95%酒精 1
min→固绿 1min→纯酒精 1min→1/2纯酒精+1/2
二甲苯2min→二甲苯3min→二甲苯20min)。
1.2.2石蜡制片改进
(1)清洗、脱水、透明、浸蜡等步骤在时间上的
改进
采用正交实验设计[5],各因素、水平编号(见表
1),再按正交设计的组合(见表2)进行清洗、脱水、
透明、浸蜡等步骤,表2每个实验号切1片载玻
片,用常规方法进行脱蜡、染色,观察结果。
(2)脱蜡时间改进
表1改进条件各水平、因素编码表
水平
1
2
3
A清洗3次(min/次)
15
30
45
B脱水4次(min/次)
15
30
60
C透明2次(min/次)
15
30
60
D浸蜡2次(min/次)
60
120
180
表2根据正交设计的9种优化方案
实验号
I
I
II
IV
V
VI
VI
VII
IX
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
注:表2各实验号的清洗、脱水、透明、浸蜡所用试剂及浓度与常规方法相同。
选取 1.2.2(1)实验中获得最佳观察结果实验
号的组织石蜡块切3片载玻片,然后三载玻片分
别进行不同脱蜡时间处理,脱蜡时间分别为15min
(1次)、15min/次(2次)、30min/次(2次),番红染色
50min。观察结果。
(3)染色方法
选取 1.2.2(1)实验中获得最佳观察结果实验
号的组织石蜡块切3片载玻片,按1.2.2(2)实验中
获取最佳观察结果的脱蜡时间进行脱蜡,然后三
载玻片分别进行三种染色:(1)双染法(先用番红染
色 50min,再用固绿染色 1min);(2)只用番红染色
50min;(3)只用固绿染色1min。制成永久切片进行
显微观察。
1.2.3观察
制成的永久装片待树胶干燥后即可用 Nikon
(eclipse80i)显微镜进行观察和拍照。
邓传远:茉莉叶石蜡制片技术的改进第2期 189- -
表3改进条件对实验结果的影响
实验号
I
I
II
IV
V
VI
VI
VII
IX
实验结果
栅栏组织和部分海绵组织细胞区分不明显,些许细胞不完整,细胞间隙出现裂缝
表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞完整,图像清晰
部分栅栏组织和海绵组织细胞区分不明显,图像清晰度一般
表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞结构较完整,图像清晰度一般
部分栅栏组织和海绵组织细胞区分不明显,细胞间隙出现裂缝
细胞结构尚完整,图像清晰度欠佳
细胞结构完整,图像清晰度一般
细胞结构尚完整,图像不够清晰
表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞区分明 显,栅栏组织与海绵组织出现裂缝
完成所有步骤所需时间
255min
465min
765min
570min
450min
600min
555min
645min
555min
图例
图1-2
图1-12
图1-3
图1-4
图1-5
图1-6
图1-7
图1-8
图1-9
2结果与分析
2.1不同改进方案对茉莉叶结构的影响
按正交设计的时间进行清洗、脱水、透明、浸
蜡等步骤的观察结果见表3,图例见图 1-2～图 1-
9和图1-12,实验结果表明采用实验号I的改进
方法可以获得最佳观察结果,完成清洗、脱水、透
明、浸蜡等步骤仅需465min,完成步骤时间比实验
号I长210min和实验号V长15min,而比实验号
II、IV、VI-IX都节省时间,常规的石蜡切片制作完
成这些步骤需 1560min,且图像不够清晰,仅达到
表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞结构尚完整
的效果(图1-1)。
2.2脱蜡时间对茉莉叶结构的影响
三 明 学 院 学 报 第25卷
选取获得最佳观察结果实验号I的组织石蜡
块切3片载玻片,然后三载玻片分别进行不同脱蜡
时间处理,观察结果见图1-10～图1-12。本实验的
3种脱蜡时间分别为 15min/次 (1次)、15min/次(2
次)、30min/次(2次),结果表明随着脱蜡时间的增
加,茉莉叶片的结构越清晰。切片脱蜡15min/次(1
次),不管是表皮细胞还是栅栏组织或海绵组织均
出现结构模糊的现象,脱蜡 15min/次(2次)的海绵
组织较脱蜡 15min/次(1次)清晰,脱蜡 30min/次(2
次)的表皮细胞、栅栏组织和海绵组织结构清晰。
2.3染色方法对茉莉叶结构的影响
选取获得最佳观察结果实验号I的组织石蜡
块切3片载玻片,按实验中获得最佳观察结果的
脱蜡时间进行脱蜡(脱蜡2次,每次30min),然后三
载玻片分别进行三种染色,结果见图 1-13~图1-
15。从图1-13～图1-15可知,双染法可显示茉莉
叶片不同组织结构的颜色,维管组织为红色,表皮
细胞、栅栏组织和海绵组织为绿色,但图像清晰度
欠佳;番红染色的表皮细胞、栅栏组织和海绵组织
等结构清晰;固绿染色的表皮细胞、栅栏组织和海
绵组织可以明显区分,可图像不够清晰。
3讨论
石蜡切片的制作过程并不难,但影响切片质
量的因素是多方面的,要制作高质量的切片,每一
个操作步骤及处理时间都至关重要。结果表明,清
洗、脱水、透明、浸蜡和脱蜡时间的掌握既是取得
完好观察结果的关键也是提高工作效率的关键(详
见2.1和2.2)。采用实验号I的改进方法,清洗 3
次(15min/次)、脱水 4次(30min/次)、透明 2次(30
min/次)、浸蜡 2次(120min),以及最佳脱蜡时间,
脱蜡2次 (30min/次)和最佳染色方法,番红染色
50min的表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞完
整,图像清晰,是茉莉叶石蜡切片制作的首选方
法,全程耗时 624min,与常规的石蜡切片耗时
2464min比较,制作时间可节省1840min,大大提
高工作效率。从实验号II、实验号IV、实验号VI
可见,表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞结构较
完整,图像清晰度与常规石蜡切片制作的结果相
媲美,全程制作时间可节省1540～1750min。按正
交设计的组合制作的结果发现,实验号 I、实验号
V、实验号 VI、实验号 VII、实验号 IX的透明时间
为2次(15min/次)、浸蜡时间为2次(60min/次),部
分栅栏组织和海绵组织细胞区分不明显,些许细
胞不完整,细胞间隙偶见裂缝,图像清晰度欠佳,
可能是透明时间和浸蜡时间短,或透明和浸蜡温
度较低,造成蜡难以渗透到组织内部。一般来说,
在冬季做石蜡制片,脱水、透明和浸蜡步骤最好在
190- -
图版说明:
图 1-1:常规石蜡制片方法的图像效果;图 1-2:按实验号 I改进的石蜡制片方法的图像效果(箭头示细胞间隙出现裂缝);
图1-3:按实验号II改进的石蜡制片方法的图像效果(箭头示维管束);图1-4:按实验号 IV改进的石蜡制片方法的图像效
果(箭头示维管束);图 1-5:按实验号 V改进的石蜡制片方法的图像效果(箭头示细胞间隙出现裂缝);图 1-6:按实验号 VI
改进的石蜡制片方法的图像效果,图像欠清晰;图1-7:按实验号VI改进的石蜡制片方法的图像效果,图像清晰度一般;图
1-8:按实验号 VII改进的石蜡制片方法的图像效果,图像不够清晰;图 1-9:按实验号 IX改进的石蜡制片方法的图像效果
(箭头示细胞间隙出现裂缝);图 1-10:按实验号 I改进的石蜡制片方法和脱蜡时间为 1次(15min/次)的图像效果;图 1-
11:按实验号I改进的石蜡制片方法和脱蜡时间为2次(15min/次)的图像效果;图1-12:按实验号I改进的石蜡制片方法
和脱蜡时间为2次(30min/次)的图像效果;图1-13:按实验号I改进的石蜡制片方法、脱蜡时间为 2次(30min/次)和双染
法的图像效果;图 1-14:按实验号 I改进的石蜡制片方法、脱蜡时间为 2次(30min/次)和番红染色(实验号 I)的图
像效果;图 1-15:按实验号 I改进的石蜡制片方法、脱蜡时间为 2次(30min/次)和固绿染色的图像效果。以上比例
尺( )均为Bar=50μm
图1光镜图片示改进条件对实验结果的影响
邓传远:茉莉叶石蜡制片技术的改进第2期 191- -
恒温箱中进行。清洗时间和脱水时间的实验结果
表明,只要处理时间不低于15min/次,对细胞结构
的影响不大,如果脱水时间高于30min/次,组织皱
缩、变硬或变脆。
本实验对相同材料、相同的制片技术,设置不
同的脱蜡时间处理,显示脱蜡时间为2次(30min/
次)的效果最佳,虽然比常规的脱蜡时间增加了
40min,但是表皮细胞、栅栏组织和海绵组织细胞
结构完整,图像更清晰,说明蜡脱得干净、彻底,有
利于提高图像质量。脱蜡时间低于2次(30min/次),
图像清晰度较差,而脱蜡时间超过 2次(30min/
次),不但不能得到更好的图像质量,而且浪费时
间,还可能造成组织变硬或变脆。
通过对常用的 3种染色方法进行比较实验,
结果表明,必须根据研究的目的来选择采用哪种
染色法,双染法能将维管组织染成红色,而表皮细
胞、栅栏组织、海绵组织染成绿色,通过不同的颜
色有利于区别组织结构,但必须增加固绿染色的
时间及操作步骤,而且图像清晰度不如番红染色
的好。此外,一般发表文章常常用黑白图像,研究
论文的石蜡切片不一定采用双染法。用番红染色
的表皮细胞、栅栏组织和海绵组织等结构清晰,对
茉莉叶片制作的石蜡切片来讲,是一种最好的染
色方法。固绿染色的表皮细胞、栅栏组织和海绵组
织可以明显区分,但图像清晰度不如番红染色的
效果好,较双染法略好些。本实验认为,只要切片
切得好,用番红染色(图3、4)或固绿染色(图12)也
可明显区别出维管组织,但固绿染色在时间上较
难掌握。
总之,要制备一张高质量的石蜡切片,必须做
好制片过程中的每一个步骤,除上述步骤外,切片
技术是关系到制片成败的重要因素之一,如切片
时用力的程度、组织蜡块的修整(四周的整齐度、大
小是否适当)、切片机是否放稳、切片机的刀片与样
品的切面角度是否适宜、刀口是否锋利等细节将
影响图像的清晰度及细胞结构的完整性,而高水
平的切片技术需要长期的摸索和改进。
参考文献:
[1]杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志,2006,23
(1):44-45.
[2]杨素娇,陈华絮.石蜡切片制作技术中简化染色的尝试[J].
实验室研究与探索,2005,24(7):33-34.
[3]杜辉,王树迎,陶卫平,等.快速 HE染色切片制作[J].畜牧
与兽医,2003.35(6):25-26.
[4]许鸿川.植物学实验技术[M].北京:中国林业出版社,2003:
12-16.
[5]邵崇斌.概率论与数理统计[M].北京:中国林业出版社,
2003:305-307.
(责任编辑:赖文忠)
三 明 学 院 学 报 第25卷192- -